Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

El objetivo general de este protocolo es generar un cultivo de alto rendimiento de neuronas inducidas a partir de fibroblastos de piel humana adulta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los trastornos neurológicos, ya que permite la degeneración de un sistema neuronal basado en el paciente que mantiene la edad de la célula. La principal ventaja de este método es que permite la generación de neuronas inducidas de personas de cualquier edad de una manera muy estandarizada y eficiente en solo 25 días.

Permite una amplia gama de aplicaciones biomédicas, incluido el modelado de enfermedades, toxicología, diagnóstico, así como ensayos de detección de medicamentos a gran escala. La demostración del procedimiento estará a cargo de Shelby, una estudiante de doctorado dentro de la unidad donde se entrena el cerebro, así como Karlonia, en nuestro laboratorio. Para empezar, descongele los fibroblastos dérmicos humanos adultos utilizando un sistema automatizado de descongelación de células.

Después de contar el número de células con un contador de células automatizado, siembre doscientas mil células por matraz T-75 que contenga 10 mililitros de medio fibroblasto. Mantener a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio antiguo con medio de fibroblastos fresco.

Siga cambiando el medio de fibroblastos cada tres o cuatro días hasta que las células alcancen el 95% de confluencia. Una hora antes de sembrar los fibroblastos dérmicos humanos adultos de la reprogramación, cubra cada pocillo de una placa de 24 pocillos con 250 microlitros de gelatina al 0,1%. Incubar la placa a 37 grados centígrados.

Aspire el medio fibroblasto del matraz y lávese una vez con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Después del lavado, lisar las células con 1,5 mililitros de tripsina al 0,05% por matraz T-75 a 37 grados centígrados durante tres minutos. Luego, agregue tres mililitros de medio de fibroblastos para neutralizar la solución de tripsina.

Enfríe las células desprendidas en un tubo de 15 mililitros enjuagando las células del matraz dos veces. A continuación, centrifugar las células a 400 g durante cinco minutos. Expulse el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de medio fibroblasto.

A continuación, prepare una suspensión celular de 1.320.000 células en 13,2 mililitros de medio fibroblasto para conseguir 100.000 células por mililitro de medio. Después de aspirar la gelatina del plato, lave el plato con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco dos veces. Luego agregue 500 microlitros de suspensión celular a cada uno de los pocillos e incube a 37 grados centígrados durante la noche.

Calentar 13,2 mililitros de medio fibroblasto a 37 grados centígrados. A continuación, descongele el vector lentiviral en la campana laminar a temperatura ambiente. Agregue el volumen requerido de lentivirus necesario para infectar los fibroblastos dérmicos humanos adultos en una multiplicidad de infección de 20 al medio sin ningún potenciador de la transducción.

Luego, reemplace el medio con 500 microlitros de medio fibroblasto con la adición del vector lentiviral. Incuba la placa a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, reemplace el medio que contiene lentivirus con medio de fibroblastos fresco sin el vector lentiviral.

Al tercer día después de la transducción viral, retire el medio de fibroblastos y agregue 500 microlitros de medio de conversión neuronal temprana. Dos o tres veces por semana, reemplace 225 microlitros de medio viejo de cada pocillo con 250 microlitros de medio fresco de conversión neuronal temprana. A los 18 días después de la transducción viral, retire el medio de conversión neuronal temprano y reemplácelo con 500 microlitros de medio de conversión neuronal tardía.

Siga cambiando el medio cada dos o tres días como antes hasta el día 25 o el punto final experimental. Utilice una pipeta de 1000 microlitros para eliminar el medio. Luego agregue dos 250 microlitros de agente disociador celular a cada pocillo y deje la placa en la incubadora durante 10 a 20 minutos hasta que las celdas se desprendan y floten como células individuales.

Mientras tanto, prepare el búfer FACS. Triturar con una pipeta de 1000 microlitros. Incuba un poco más si quedan grupos de células.

Transfiera la suspensión de una sola celda obtenida a un tubo de 1,5 mililitros. Enjuague los pocillos dos veces con medio de conversión neuronal tardía y transfiéralo al mismo tubo de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugar a 400 g durante cinco minutos y desechar el supernatent.

A continuación, vuelva a suspender el pellet de celda en 200 microlitros de tampón FACS. De nuevo, centrifuga las celdas a 400 g durante cinco minutos y desecha el supernatent. Vuelva a suspender las celdas en el tampón FACS y la centrífuga.

Repite dos veces más. A continuación, vuelva a suspender el gránulo de la célula en 50 microlitros de tampón FACS que contenga el anticuerpo CD56 humano en una concentración de uno a 50 durante 15 minutos en hielo, lejos de la luz. Centrifugar las células a 400 g durante cinco minutos y disolver el pellet de células en 200 microlitros de tampón FACS para lavar las células.

De nuevo, centrifuga las células a 400 g durante cinco minutos. Lavar con tampón FACS dos veces seguido de centrifugación. Por último, volver a suspender en 200 microlitros de tampón FACS que contenga 10 microgramos por mililitro de yoduro de propidio.

Clasifique las células NCAM positivas y negativas para yoduro de propidio mediante compuerta en función del nivel de intensidad de fluorescencia de las muestras de control que no se teñieron con el anticuerpo NCAM o el yoduro de propidio. Utilice un contador de células automatizado para contar el número de células y sembrar 50.000 células por centímetro cuadrado en una placa recubierta de poli-L-ornitina, fibronectina y laminina con medio de conversión neuronal tardía. Siga cambiando la mitad del medio dos o tres veces por semana con el medio de conversión neuronal tardía hasta el punto final experimental.

Las imágenes representativas de contraste de fase muestran los cambios morfológicos en las células durante el período de conversión. Una transformación significativa en la morfología celular es visible desde el quinto día. Al día 22, aproximadamente la mitad de las células se han convertido en neuronas.

Las imágenes representativas de aminofluorescencia muestran la presencia de marcadores neuronales estándar en las células. A los 25 días, las células obtienen la morfología neuronal y expresan marcadores neuronales como MAP2 y TAU. Los núcleos se tiñen con DAPI.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar neuronas inducidas a partir de fibroblastos humanos adultos. Y esto incluye la siembra de las células para la reprogramación, la transducción viral, el mantenimiento de las células, así como la clasificación FACS para la purificación. El desarrollo de esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de los trastornos neurológicos estudien diferentes características asociadas con la enfermedad, así como posibles terapias.

Y eso se puede hacer en un sistema que no es solo un sistema neuronal humano, sino que puede ser tanto específico del paciente como de la enfermedad.