Name: Libre de detergente ultra rápida reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas soportadas utilizando fusogénicas complementarios cargados de Proteoliposomes. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprende a reconstituir proteínas de membrana en bicapas lipídicas sin detergente usando proteoliposomas fusogénicos de carga complementaria. Este método ultrarrápido permite ensamblar sistemas multicapa funcionales para estudios de biología sintética.

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Autores están agradecidos a Robert Gennis en Universidad de Illinois y Christoph von Ballmoos desde Universidad de Berna por un plásmido y un esfuerzo para expresar bo3-oxidasa. El proyecto fue apoyado por el BBSRC conceder BB/L01985X/1 a las R.I. y R.B.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A continuación algunas cuestiones deben considerarse para el éxito de este enfoque experimental:
Elección de carga de lípidos para bicapas de proteoliposomes y blanco: Los lípidos catiónicos no se encuentran en la naturaleza, mientras que los lípidos aniónicos son abundantes en las membranas biológicas, alcanzando, por ejemplo, ~ 25, 35 y 20% en la membrana interna de Escherichia coli, membrana del plasma de la levadura S. cerevisiaey las membranas mitocondriales internas de muchas especies, respectivamente27,28,29. Sería razonable esperar que la funcionalidad de las proteínas de membrana en PL+ puede verse afectada por la fuerza de una carga positiva de la bicapa, que a su vez dependen de un contenido relativo de lípidos catiónicos en la bicapa y externos iónico fuerza. Por lo tanto, es importante abordar experimentalmente hasta qué punto funcionalidad de proteínas de membrana de interés dependerá de la carga del medio ambiente de lípidos catiónicos. Aquí, mostramos que tanto F1Fo ATP sintasa y bo3-oxidasa son sensibles al entorno de lípidos catiónicos, pero hemos conseguido modular y neutralizar este efecto primero colocando las proteínas en PL+ y entrega de los mismos en aniónicos bicapas de aceptar y luego aumentando la fuerza iónica del medio de reacción después de la fusión se acaba.
Elección de un lípido catiónico particular: Más lípidos catiónicos disponibles comercialmente son triacylglyceride no; por lo tanto, debe probarse un lípido candidato potencial para la compatibilidad con las proteínas de membrana de interés. Anteriormente encontramos15 que la ATP Sintetasa utilizada en este estudio mostraron que su mejor desempeño en PL+ formado de etilo-PC, que cuenta con la mayor similitud estructural a los lípidos naturales triacylglyceride, mientras de DOTAP (triacylglyceride no lípido) PL+ esta proteína era menos activa.
Ensayos de fusión de vesícula: Fusión de la vesícula true (cuando el contenido líquido intravesicular de la mezcla) debe ser distinguido de Estados intermedios de hemi-fusion, cuando las vesículas se adhieren uno al otro sin mezclar su contenido acuoso, pero mezclan fácilmente el contenido de su externo o ambos lípidos foliolos de30. En caso de mezclas de lípidos subóptima o ciertas condiciones, las vesículas también demuestran pronunciadas fugas de contenido líquido en fusión31. Concentraciones mínimas de lípidos cargados en mezclas fusogénicas que verdadera fusión necesitan ser encontrado experimentalmente para cada especie de lípidos, pero en general, se encuentra que las membranas con menos del 10% cargado lípidos son prestados no fusogénicas 32.
Mientras se forma fusogénicas SUV en presencia de iones de multi-valent, es importante no mezclar componentes opuesto cargados, ya que puede causar aglutinación inmediata y agregación de lípidos por estos iones. Por ejemplo, mientras se preparaba el SUV para el método de cobalto-calceína-EDTA, es importante evitar la mezcla de una mezcla de lípidos catiónicos con EDTA para prevenir la obstrucción del filtro de policarbonato por componentes agrupados.
También es importante mencionar que el método de cobalto-calceína-EDTA, siendo muy sensible y conveniente para el control de la fusión en tiempo real, puede subestimar todavía el grado de fusión debido a 1) self-amortiguamiento de la fluorescencia de calceína libre dentro postfusion las vesículas, que se espera que alcance 1 mM, mientras que el umbral de auto enfriamiento se divulga para ser alrededor 20 μm33y 2) superficie-limita cobalto-calceína, que sigue siendo límite a SUV+ incluso después de pasar por la resina de gel filtración y colores de vesículas a un color naranja brillante, mientras que los SUV0 tienen un color naranja pálido. También tenga en cuenta que liberación de lo consolidado calceína de cobalto sobre adición de detergente Triton X-100 en presencia de EDTA genera señales mucho más fuertes para SUV+ (figura 3, rastro rojo) que SUV0 (trazo en gris).
Perspectivas: esperamos que los enfoques fast descritos aquí mucho pueden facilitar y acelerar el montaje de membranas complejas para las necesidades de las nuevas aplicaciones de la biología sintética. Nuestro protocolo de reconstitución de la proteína de membrana toma sólo media hora para la reconstitución de proteínas de membrana grande frágiles conocidos por ser sensibles a las técnicas de reconstitución basado en diálisis largas, mientras que este enfoque fusogénicas toma solamente 5-10 minutos para entregar tales proteínas en bicapas de lípidos grandes. Aquí, demostramos las ventajas de estos enfoques mediante la manipulación de e. coli F1Fo ATP sintasa, que es un ejemplo de una proteína frágil. Se hace 23 de subunidades y se conoce fácilmente perder su integridad si se exponen a condiciones subóptimas (por ejemplo, calor) durante y después de solubilización, pero se utiliza en estos procedimientos, la proteína muestra reproducible alta actividad en el bombeo de protones.

Funcionalización de bicapas lipídicas artificiales con proteínas de la membrana es un paso fundamental en el montaje de sistemas modelo de membrana. El modelo más simple, proteoliposomes (PL), consiste en pequeñas (30-200 nm de diámetro) unilaminar vesículas (SUV, también llamados liposomas), con las proteínas integraron en sus membranas. PL se forman tradicionalmente en dos pasos1. Preformadas, primera SUV se mezclan con una proteína de membrana de interés y un detergente a una concentración por encima de su concentración micelar crítica (CMC). En segundo lugar, se elimina el detergente con varias diálisis, "bio-bolas" o gel técnicas filtración, dejando la proteína en la membrana. Este último enfoque es mucho más rápido (~ 30 min1) y por lo tanto es preferible para la reconstitución de proteínas de membrana frágil y sensible, mientras que los dos primeros enfoques están limitados por la velocidad de extracción detergente, que lleva muchas horas y puede provocar un pérdida sustancial de la actividad y pérdida de la integridad estructural de las proteínas. Funcionalización de grandes vesículas (propiedades grandes vesículas, LUV, hasta 1 μm de diámetro) por ello es más difícil, como vesícula de tamaño se reduce después de la eliminación del detergente y no es posible que las vesículas unilaminar gigante (GUV, > 1 μm), como son desestabilizado por detergentes (pero véase Johnson et al. 2 lento 2D-cristalización de proteínas de membrana en bicapas de grandes). Enfoques alternativos de GUV membrana funcionalización3,4,5 existen pero son laboriosos, lentos y necesitan algo de detergente en concentraciones por debajo de la CMC. Más frágiles o complejo lipídico modelos (por ejemplo, gotas hidrogel bicapas6 y 3D tejidos artificiales gota interfaz bicapa base imprimible7) no pueden tolerar detergentes. Rápidamente nuevas aplicaciones de biología sintética8,9,10 críticamente depende de funcionalización de estas estructuras complejas de la membrana. Por lo tanto, un método fácil y robusto que permite una entrega rápida y suave de proteínas de membrana en las bicapas frágil destino es muy solicitado en el campo.
Alternativa, método de la entrega de proteína libre de detergente es fusión de la vesícula, donde se unen las membranas de las vesículas interactuando en la bicapa postfusion intacta, mientras que su contenido acuoso intravesicular se mezcla, sin ser liberado en el externo medio ambiente. Fusión de la vesícula está habilitada y ya sea por los cambios conformacionales dentro de agentes fusogénicas complementarios (11,12 y péptidos proteínas13 alguna especialmente modificado ADN14) situados en el contacto con bicapas o Coulombic interacciones entre bicapas de lípidos forman de lípidos catiónicos y aniónicos complementariamente cargado15,16, o bicapas catiónicos y proteínas cargadas negativamente17.
El enfoque anterior requiere la presencia de agentes fusogénica en las interacción las membranas antes de la fusión, es relativamente lento (~ 30 min para llegar a medio-máximo de12,de fusión18), pero se puede aplicar a natural y artificial membranas.
Una ventaja del enfoque usando fusogénicas lípidos (figura 1) es que permite mucho más rápida fusión de la membrana (~ 1 min para llegar a máximo de la mitad y 5-10 minutos para terminar la reacción). Además, el grado de fusión puede ser controlado por i) una fácil formular contenido relativo de lípidos cargados en bicapas fusogénica y ii) iónico y, en general, osmótica fuerza del medio de reacción (sales en por encima de 50 mM y, por ejemplo, sacarosa15 aparecen para detener la fusión), o una combinación de ambos. Para iniciar la fusión, vesículas fusogénicas opuesto cargado se mezclan en un medio de fuerza iónica baja (típicamente sal de 10-20 mM) para 5-10 minutos. Una desventaja relativa del método es que los lípidos catiónicos pueden ejercer un efecto negativo sobre la funcionalidad de las proteínas de membrana en proteoliposomes catiónico antes de la fusión, especialmente en la baja fuerza iónica, pero este efecto es reversible y mitigadas por una natural composición lipídica de la membrana post-fusion y su vuelta al medio de fuerza iónica normal.

<table><tbody><tr><td>Lípido neutro DOPC</td><td>Lípidos Avanti</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Lípido aniónico POPA</td><td>Lípidos Avanti</td><td>840857</td><td></td></tr><tr><td>Lípido catiónico E-PC</td><td>Lípidos Avanti</td><td>890704</td><td></td></tr><tr><td>Colesteril-Bodipy-FL12</td><td>Thermofisher</td><td>C3927MP</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50, Super Fine</td><td>Sigma</td><td>G5050</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400, Tipo 400-DL</td><td>Sigma</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>ACMA</td><td>Sigma</td><td>A5806</td><td></td></tr><tr><td>Nigericina</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Q1</td><td>Sigma</td><td>C7956</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma</td><td>P9136-1KU</td><td></td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Luciferina</td><td>Sigma</td><td>L6882</td><td></td></tr><tr><td>Luciferasa</td><td>Sigma/Roche</td><td>10411523001</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Insight Biotechnology</td><td>sc-202090</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Sigma</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamina 101</td><td>Sigma</td><td>S7635</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de extrusión</td><td>Extrusora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti Luminómetro monotubo, modelo Sirius L</td><td>Titertek Berthold</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de policarbonato, D19 mm</td><td>Sigma, Whatman NucleporeMembranas grabadas en pista</td><td>WHA800309, WHA800284</td><td>100 o 200 nm para formar SUV, y 400 o 800 nm para LUV</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Buffers utilizados en el papel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer A</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer B</td><td></td><td></td><td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4, 0,1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>tampón C</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4</td></tr><tr><td>Tampón D</td><td></td><td></td><td>1 mM MOPS pH 7,4 Varias concentraciones de KCl</td></tr></tbody></table>

libre de detergente ultra rápida reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas soportadas utilizando fusogénicas complementarios cargados de proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergentes son indispensables para la entrega de proteínas de membrana en vesículas de unilaminar pequeña de 30-100 nm, mientras que las bicapas de lípidos más complejos y más grande modelo son menos compatibles con los detergentes.
Aquí, describimos una estrategia para pasar por esta limitación fundamental utilizando fusogénicas teniendo una proteína de membrana de interés liposomas con carga opuesta. Fusión de estas vesículas se produce dentro de 5 min en un tampón de baja fuerza iónica. Liposomas cargados positivamente fusogénicas pueden utilizarse como vectores de transporte simple para la entrega de detergente libre de proteínas de membrana en biomimética destino bicapas lipídicas soportadas, que se cargan negativamente. También mostramos cómo reconstituir las proteínas de membrana en proteoliposomes fusogénicas con un protocolo rápido de 30 minutos.
La combinación de estos dos enfoques, demostrar un montaje rápido de una cadena de transporte de electrones que consiste en dos proteínas de la membrana de e. coli, un protón primario bomba bo3-oxidasa y F1Fo ATP sintasa, en las membranas de vesículas de diferentes tamaños, que van desde 0.1 a > 10 micras, así como la producción de ATP por esta cadena.

El uso de fusogénicas complementarios cargados de proteoliposomes para la entrega rápida libre de detergente de proteínas de membrana en membranas de bicapa de destino incluye tres pasos (figura 1): A, formación de fusogénicas SUV de mezclas de lípidos con alto contenido de lípidos cargados; Estos SUV opcionalmente puede llevar una carga intravesicular; Bconversión de fusogénicas SUV en PL utilizando nuestra reconstitución de proteínas de membrana rápido; Cfusión de fusogénicas PL con bicapas de destino en un medio de baja en sal, seguido por la adición de sal alta para detener la reacción de fusión. En el caso de grandes vesículas (D), es una estrategia preferible ofrecer proteína de la membrana a la bicapa aniónica blanco, que proporciona un mejor ambiente de lípidos para la actividad de proteínas de membrana (más discutido en el texto).
Se destaca el protocolo de formación GUV con método de emulsión invertida en detalle en la figura 2. Preferimos utilizar hexadecano en la mezcla de lípidos y aceite debido a su relativamente alta temperatura de congelación (° C 18), que permite retiro fácil del aceite solidificado después de GUV granulación.
Figura 3 muestra la fusión de la vesícula mediante método de cobalto-calceína-EDTA. Fusión se ve sólo cuando complementarias vesículas cargadas se utilizan buffers de sal baja, mientras que altas concentraciones de sal (&gt; 50 mM14) o el uso de vesículas fusogénicas no demostrar ninguna fusión.
Este protocolo rápido de la reconstitución de proteínas de membrana en fusogénicas SUV se ilustra en la Figura 4A. Mediante este protocolo, se demuestra rápido reconstitución de protón primario bomba bo3-oxidasa y F1Fo ATP sintasa en PL y la evaluación de su actividad específica en estas membranas. Es importante mencionar que el rendimiento de la reconstitución de proteínas no depende de la carga de un lípido usado15 y es aproximadamente el 50-75%25,12, y que después de la reconstitución en PL, la proteína puede guardarse durante al menos tres días, incluso a temperatura ambiente sin pérdida evidente de la actividad de la proteína. Este procedimiento proporciona también orientación unidireccional de la sintasa de ATP, donde más del 95% de ella tiene su parte hidrofílica F1 orientado hacia afuera15,26.
Figura 5 muestra que el protón bombeo actividad de F1Fo (Panel A) y bo3-oxidasa (Panel B) en los lípidos catiónicos es reducida y sensibles a baja fuerza iónica, en comparación con el entorno de lípidos aniónicos y neutral, pero Este efecto se mitiga en las membranas de postfusion después de la fusión de PL+ con aniónico LUV–.
Figura 6 muestra la entrega de la F1Fo ATP sintasa en las membranas de las vesículas grandes. En este experimento, PL+ y 800 nm LUV– fueron fundidos en 20 mM KCl por 5 min y el producto de reacción se peleteado para quitar PL cuya+, se resuspendió y se ensayaron para el bombeo de protones. Experimentos de control demostraron que no hay bombeo de protones cuando LUV0 en lugar de LUV– se utilizaron en la reacción de la fusión (trazo negro), o vacío LUV– solo fueron ensayada (trazo azul).
Montaje rápido de un funcionamiento cadena transporte de electrones en las membranas de vesículas grandes mediante fusogénicas PL se muestra en la figura 7. Usamos F1Fo SUV+ y bo3 SUV+ para la fusión con 800 nm LUV-y demostró la producción de ATP por esta cadena en las vesículas postfusion añadiendo secuencialmente coenzima Q1 y TDT para energizar membranas y luego agregando fosfato para síntesis de ATP por F1Fo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> Figura 1: concepto de ultrarrápida entrega detergente libre de proteínas de membrana en bicapas de lípidos objetivo a través de la fusión de vesículas unilaminar formada de lípidos cargados complementarios. (A) formación de catiónicos y aniónicos fusogénicas unilaminar pequeña vesículas (+de SUV, SUV–) opcionalmente cargado con cargas intravesicular. (B) conversión de fusogénicas SUV en fusogénicas proteoliposomes (PL) por reconstitución de proteínas de membrana. (C) libre de detergente entrega de proteínas de membrana en membranas postfusion con la estrategia preferible de fusogénicas PL. (D) para la entrega de proteínas de membrana en membranas de vesículas grandes, ilustradas por la fusión entre 100 nm PL+ y 800 nm LUV–. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> Figura 2: Protocolo de formación GUV con un método de emulsión invertida. (A) formación de una monocapa de lípidos en la frontera entre la mezcla de aceite de lípidos y agua. (B) formación de una emulsión (agua en aceite) invertida. (C) GUV formación pasando la emulsión a través de la frontera de agua y aceite mediante centrifugación. (D) enfriamiento del tubo abajo &lt; 18 ° C a solidificar y quitar el aceite. (E) A imagen de microscopia fluorescente de un GUV con lípidos fluorescentes (1% peso fracción del colesterilo-Bodipy-FL12) en su membrana (verde) y un fluoróforo polar (1 mM sulforodamina 101) en el lumen de la vesícula (rojo). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> Figura 3: fusión de las vesículas de lípidos estudiados con el método de cobalto-calceína-EDTA. (A) diagrama esquemático del método, donde calceína libre se lanza de un complejo cobalto-calceína no fluorescente con EDTA. (B) fusión de SUV en diferentes concentraciones de KCl. (C) liberación de la calceína intravesicular por adición de EDTA y Triton X-100 detergente a las vesículas postfusion que se muestra en B como se describe en el texto. El grado de fusión (%) para el rastro rojo se calcula dividiendo la señal de fusión máxima corrección de fondo (1 - 2) por la señal máxima corrección de fondo tras el lanzamiento de calceína encapsulado (3-2) y multiplicando por 100. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> Figura 4: Reconstitución ultrarrápida de bo3-oxidasa y F1Fo en proteoliposomes fusogénicas y las mediciones de actividad de la proteína en tales proteoliposomes. (A) esquema del Protocolo de reconstitución. (B) coenzima Q1 oxidación impulsado por bombeo de protones por bo3-oxidasa en PL medido con ACMA Temple (explicado en el texto). (C) ATP conducido hidrólisis protón bombeo por F1Fo en PL medido con ACMA Temple (explicado en el texto). (D) ATP hidrólisis por F1Fo en PL medidos con sistema de regeneración de ATP (explicado en el texto) y su estimulación por el uncoupler. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> Figura 5: influencia del ambiente lipídico y fuerza iónica sobre la actividad de proteínas de membrana. Protón bombeo por F1Fo (A) y bo3-oxidasa (B) catiónico PL (trazo rojo), PL aniónico (trazo azul), PL neutro (trazo negro) y PL catiónico fusionado con aniónico LUV (trazo verde) de 20 y 100 mM (rastro) KCl. Control gris) no muestran ningún cambio en protón bombeo por F1Fo PL– en mezcla con SUV–. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> Figura 6: Entrega de la F1Fo ATP sintasa en las membranas de 800 nm LUV– vía fusión con PL+. (A) esquema del experimento: PL+ y 800 nm LUV– fueron fundidos en 1 mM MOPS (pH 7.4), 1 mM MgCl2, 20 mM, KCl 5 min, peleteado para quitar cuya PL y serán suspendidas en el mismo buffer. (B) protón bombeo por la LUV postfusion (trazo rojo). Experimentos de control no demostraron ACMA apagando cuando PL0 se mezclaron con LUV– (trazo negro), o vacío LUV– solo fueron ensayada (trazo azul). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> Figura 7: 5 min el montaje sin detergente de una cadena de transporte de electrones en las membranas de 800 nm LUV– vía fusión con PL+. (A) esquema del experimento: 100 nm F1Fo PL+ y 100 nm bo3-oxidasa PL+ fueron fundidos con LUV-, como se describe en la figura 6. Fusión se detuvo por adición de KCl y fregonas a 100 y 50 mM respectivamente. Las membranas se mezclaron con cóctel de ADP-luciferin-luciferasa y energizadas por la adición de TDT y Q1, como se describe en el texto. Producción de ATP fue iniciada por la adición de fosfato de 1 mM (P) y monitoreados en tiempo real con sistema de luciferin luciferasa como se describe en el texto. (B) ATP Síntesis de vesículas postfusion (trazo rojo). Experimentos de control no demostrados producción de ATP cuando la PL+ se mezclaron con LUV– en alto sal (gris) o PL0 se mezclaron con LUV– (negro). Tasa de síntesis de ATP se calculó como se explica en el texto (pasos 8.8 8.9). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí presentamos dos protocolos ultrarrápidos para la reconstitución de proteínas de membrana en proteoliposomes fusogénicas y fusión de tales proteoliposomes con bicapas de lípidos de destino para la entrega de detergente libre de estas proteínas de membrana a la bicapa postfusion. La combinación de estos enfoques permite a Asamblea rápida y fácilmente controlado de los sistemas de membranas de varios componentes complejos.

Libre de detergente ultra rápida reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas soportadas utilizando fusogénicas complementarios cargados de Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

El objetivo general de nuestro procedimiento fácil de implementar es demostrar la entrega rápida y sin detergente de proteínas de membrana en bicapas lipídicas de varios tamaños mediante la fusión entre bicapas lipídicas formadas por lípidos con carga opuesta. Nuestra metodología se puede utilizar en bioquímica y biofísica para el ensamblaje en un solo paso de sistemas bicapa lipídicos multicomponente métricos bioméricos a partir de componentes individuales de capas. Es importante mencionar que la ventaja de nuestro enfoque está en esta rápida funcionalización, es decir, en el modelo complejo de bilasa lipídica, con proteínas, lípidos y otras moléculas de interés.Esta metodología también se puede utilizar para estudiar los procesos de transporte de membranas que requieren la energización de la membrana lipídica. Por ejemplo, las bombas primarias se pueden utilizar para impulsar el transporte secundario habilitado por otras proteínas de membrana. Nuestro método también puede servir en las necesidades de la biología sintética.Por ejemplo, para crear vesículas de membrana con diversas funcionalidades de programa. En el futuro, atrapar pequeñas vesículas como estas dentro de otras similares más grandes, tal vez sea un paso hacia la construcción de una célula artificial. Para formar la solución de lípidos y aceite, mezcle el caldo de cloroformo con un mililitro de hexadecano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.A continuación, para evaporar el cloroformo, mezcle y caliente constantemente la mezcla en un agitador horizontal a 80 grados centígrados durante 30 minutos dejando el tubo abierto. Después de la evaporación, cierre el tubo y enfríe a temperatura ambiente. A continuación, para formar la monocapa de lípidos, en la interfaz del tampón acuoso de lípidos en aceite, tome un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y transfiera 200 microlitros de lípidos en solución de aceite encima de 0,5 mililitros de tampón B. Luego espere de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente para que el borde de separación de fases se aplane, lo que indica la formación de la monocapa de lípidos.La forma convexa del borde de separación de fases se debe al desajuste de la tensión superficial entre el aceite y el tampón acuoso. A continuación, para preparar la emulsión de agua y aceite, mezcle una solución de polisacárido no iónico en el tampón B con una densidad superior a la del agua. A continuación, transfiera 0,5 microlitros de la mezcla a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mililitros, que contenga 100 microlitros de lípidos en una solución de aceite.A continuación, sonicar la mezcla a 44 kilohercios y 14 vatios durante 30 segundos en un baño de agua ultrasónico. Después de sonicar, agite vigorosamente durante 45 minutos para formar la emulsión de agua en aceite. Luego, para convertir el agua en emulsión de aceite en GUV aniónico, transfiera cuidadosamente la emulsión sobre la interfaz acuosa de lípidos y aceite.En la emulsión, cada gota está recubierta con una monocapa lipídica. El vórtice de sindicación adecuado del agua en la emulsión de aceite determina el éxito de la formación de GUV. Si no se forma correctamente, la gota de emulsión se fusionará a su vez, lo que reducirá el rendimiento de la formación de GUV.Para obtener el pellet GUV, centrifugar rápidamente la muestra a 1000 veces G durante dos minutos. Coloque un alambre de metal doblado en el tubo para que se asiente dentro del aceite. A continuación, deje el tubo en hielo para solidificar la mezcla de lípidos y aceite.Retire con cuidado el aceite congelado y recoja la fase acuosa. A continuación, vuelva a suspender el pellet GUV en 50 microlitros de tampón B fresco y transfiéralo a un nuevo tubo. Inspeccione el GUV bajo un objetivo de emersión en aceite de 100 X de un microscopio fluorescente.Utilice resina de filtración en gel para preparar una columna de flujo por gravedad y equivalga con el tampón A mantenido a temperatura ambiente. A continuación, diluya la proteína de membrana purificada hasta una concentración final de 0,7 miligramos por mililitro utilizando el tampón de extracción. A continuación, mezcle la proteína con el SUV catiónico preformado en una proporción de uno a 30 junto con el colado que contiene el tampón A hasta un volumen final de 660 microlitros.A continuación, coloque el tubo de muestra en un balancín y agite suavemente la mezcla durante 15 minutos. A continuación, pase la mezcla a través de la resina de filtración en gel y recoja las fracciones turbias de proteoliposomas y centrifugue a 4.000 veces G durante 15 minutos. Luego, deseche el sobrenadante de proteína no reconstituida y disuelva el pellet en un mililitro de tampón fresco A.In una cubeta de fluorómetro, agregue 20 microlitros de proteoliposoma con B03 oxidasa junto con dos mililitros de tampón A en presencia de ACMA de 0,5 micromolares, y espere una señal estable a 430 nanómetros de excitación y 515 nanómetros de emisión.A continuación, añada 40 micromolares de coenzima Q1 a la cubeta. A continuación, agregue dos milimolares de DTT al proteoliposoma para comenzar el bombeo de protones y luego disipe el pH delta formado. En una cubeta separada, agregue 40 microlitros de proteoliposomas con F1-F0 a 2 mililitros de tampón A en presencia de 0,5 micromolares de ACMA y desencadene el bombeo de protones agregando 0,2 milimolares de ATP al proteoliposoma y luego disipe el pH delta formado.Fusionar 50 microlitros de PL+ con 50 microlitros de 800 nanómetros LUV-en un mililitro de tampón D, suplementado con un milimolar de cloruro de magnesio y 20 milimolares de cloruro de potasio durante cinco minutos. A continuación, centrifugar la muestra a 6.000 veces G durante cinco minutos para granular el LUV de posfusión. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante que consiste en PL+ sin reaccionar y luego vuelva a suspender el pellet formado en un mililitro de tampón D, suplementado con un milimolar de cloruro de magnesio y 100 milimolares de cloruro de potasio.Nuevamente, realice el ensayo de enfriamiento ACM. Primero, mezcle tres microlitros de B03 oxidasa PL+ y cinco microlitros de F1F0 PL+, luego fusione la mezcla con tres microlitros de LUV o GUV en 800 microlitros en el tampón D, suplementado con 20 milimolares de cloruro de potasio y un milimolar de cloruro de magnesio durante cinco minutos. A continuación, agregue cloruro de potasio y tampón de fregona a la mezcla de membrana fusionada a una concentración final de 150 milimolares.Mezcle 400 micromolares de ADP, 50 micromolares de luciferina y 2,5 de luciferasa en 200 microlitros de tampón A para preparar un cóctel de luciferina luciferasa ADP. Luego, agregue el cóctel a la mezcla de membrana fusionada. Para una correcta medición de la síntesis de ADP, es importante tener una señal de luciferasa estable para evitar falsos positivos, antes de la adición de Q1 y DTT.Luego agregue 40 micromolares de coenzima Q1 oxidada, y luego agregue dos milimolares DTT para iniciar la energización de la membrana fusionada. Después de un minuto, agregue una solución de fosfato de potasio de cinco milimolares a las vesículas energizadas para iniciar la síntesis de ATP. Para inspeccionar el GUV resuspendido al eliminar el hexadecano congelado de la mezcla de lípidos y aceite, se utilizó microscopía fluorescente.Las imágenes del GUV obtenidas muestran la presencia de biopoty fluorescente de colesterol FL12 en su membrana, y autoerodimina 101, un fluoróforo polar en el lumen. Para cuantificar la fusión de SUV en la concentración creciente de cloruro de potasio, se trazó un gráfico. El gráfico explica que con el aumento de la concentración de cloruro de potasio más allá de 50 milimolares, la fusión de las vesículas lipídicas SUV comienza a disminuir.Sin embargo, a baja concentración de cloruro de potasio, entre uno y 20 milimolares, las vesículas cargadas complementarias se fusionan. A continuación, para medir la oxidación del impulsión de bombeo de protones meditado de BO3 oxidasa del sustrato de coenzima Q1, se trazó un gráfico basado en el ensayo de enfriamiento ACMA. Los resultados muestran que la adición de un desacoplador aumenta la señal de fluorescencia ACMA representada a lo largo del eje Y de la gráfica.Luego, también se midió el bombeo de protones dependiente de la hidrólisis de ATP por F1F0 en función del ensayo de enfriamiento ACMA. En el gráfico, se muestra que agregar un desacoplador aumenta la señal de fluorescencia AMCA. Además, el sistema luciferina luciferasa se utilizó para monitorear la síntesis de ATP en vesículas fusionadas.La adición secuencial de coenzima Q1 DTT, seguida de la adición de fosfato, muestra una producción exitosa de ATP por parte de las vesículas fusionadas. Una vez dominada, la primera técnica: la formación de proteoliposomas fusogénicos a partir de detergentes simbolizados por las proteínas de membrana y la unión de los miomédicos, se puede realizar en solo 30 minutos. La segunda técnica, la fusión física, se puede hacer aún más rápido en solo diez minutos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se pueden construir sistemas de membranas multicomponentes combinando varios bloques de construcción individuales que se presentan mediante vesículas lipídicas funcionalizadas. Esperamos que tales sistemas modulares tengan las principales propiedades y funciones que son imposibles con la reconstitución de las proteínas de membrana en un solo paso. En general, nuestros procedimientos proporcionan un marco simple para construir sistemas bioquímicos compartimentados complejos, a partir de los llamados bioladrillos más simples.

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Investigación

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Bioquímica

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Libre de detergente ultra rápida reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas soportadas utilizando fusogénicas complementarios cargados de Proteoliposomes. (Video) | JoVE Journal

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