4.3: Espectrometría de masas MALDI-TOF

La ionización por desorción láser asistida por matriz, o MALDI, es una fuente de iones de espectrometría de masas ideal para el análisis de biomoléculas. La mayoría de las fuentes de iones eliminan la información estructural de las biomoléculas grandes y frágiles. MALDI mantiene la integridad estructural y, por lo tanto, la información, mientras acelera las moléculas en el analizador de masas, que separa los compuestos en función del tamaño y la carga. El más comúnmente acoplado con MALDI es el analizador de masas de tiempo de vuelo, o TOF. Este video mostrará los conceptos de ionización MALDI, un procedimiento general, y algunos de sus usos en bioquímica.

Para que la espectrometría de masas funcione, las moléculas deben ionizarse en estado gaseoso. En MALDI, la muestra está incrustada en una matriz, normalmente un compuesto orgánico que contiene dobles enlaces aromáticos y conjugados.

Cuando un pulso láser golpea esta mezcla, la matriz absorbe la mayor parte de la energía, se calienta rápidamente y se desorbe, o se libera, de la superficie. La matriz energizada transfiere parte de su energía a las biomoléculas, desorbiéndolas y luego ionizándolas.

Por lo general, MALDI se combina con un analizador de masas de tiempo de vuelo, o TOF. Un campo eléctrico aplica energía cinética a los iones, moviéndolos a una región libre de campo llamada tubo de deriva. La velocidad de los iones a medida que se mueven a través del tubo está relacionada con su relación masa-carga, por lo que las partículas más pesadas viajan más lentamente a través del instrumento. Un detector en el extremo del tubo mide el tiempo de vuelo de cada ion. Con este conocimiento, así como la longitud del tubo y la intensidad de campo aplicada, se puede dilucidar la relación masa-carga de cada ion.

Este gráfico de la intensidad de la señal a la relación masa-carga, conocido como espectro de masas, se puede comparar con una biblioteca de espectros recopilados. Si no se encuentran coincidencias, se pueden identificar moléculas mediante técnicas adicionales, como la espectrometría de masas en tándem. Para obtener más información, vea el video de esta colección sobre el tema.

Ahora que se han discutido los conceptos básicos de MALDI-TOF, veamos el proceso en el laboratorio.

Antes de comenzar un experimento, es importante considerar la elección de la matriz a partir de la cual se desorberán las muestras. Debe absorber la energía del láser, ser estable en el vacío, no reaccionar con las moléculas objetivo y ser capaz de desorber. Dependiendo de la muestra, se prefieren diferentes matrices. Para una proteína grande, una combinación de CHCA y DHB ha mostrado una mejor separación de los picos, llamada resolución, que las matrices individuales.

Hay varias formas de preparar muestras. Mostraremos lo que se conoce como el método de "doble capa" o "sándwich". Para empezar, limpie la placa MALDI con reactivos ultrapuros, ya que la espectrometría de masas es muy sensible a la contaminación. Seque la placa con un chorro de gas inerte.

A continuación, se elabora una solución de matriz saturada, normalmente con un disolvente orgánico. La solución se raya en la placa MALDI y se seca. Se prepara una segunda solución saturada de matriz que contiene ácido trifluoroacético, o TFA. El TFA ayuda a los iones a entrar en la fase gaseosa.

A continuación, se añade la solución de muestra sobre la mancha de matriz seca. Agregue la solución de matriz que contiene TFA sobre la muestra, completando así el "sándwich" de matriz. La homogeneidad de la mancha se puede verificar bajo un microscopio de baja potencia.

Placa un patrón de calibración, que es una mezcla con una amplia gama de masas conocidas y se utiliza para correlacionar el tiempo de vuelo con m/z. Por último, coloque la matriz sola como control negativo.

Para analizar los puntos, coloque la placa objetivo en el instrumento. Asegúrese de que no haya residuos presentes, lo que permite la formación de un vacío hermético. En el software, seleccione el estándar, el control negativo y las muestras de interés. Etiquete los lugares con la identificación correcta.

La fuente de iones y los voltajes de la lente se pueden manipular para mejorar el rendimiento del análisis. Esto dependerá de las características específicas del instrumento y la muestra. Concéntrese en el punto estándar y calibre el instrumento con el software.

A continuación, recoja los espectros de cada uno de los puntos de muestra. Pruebe algunas ubicaciones diferentes en el lugar para maximizar la calidad de los datos recopilados. Una vez terminada, la placa MALDI se puede recoger y reutilizar después de la limpieza.

Ahora que hemos revisado un procedimiento, veamos algunas de las formas en que se utiliza MALDI y una técnica de ionización diferente.

Además de las biomoléculas, MALDI se puede utilizar para analizar células vivas. Los macrófagos son células inmunitarias que adoptan una de varias formas diferentes, en función de su microentorno. Después de exponer las células a varias moléculas de señalización, o citocinas, se pueden agregar directamente a la placa y analizar. Los espectros MALDI se pueden utilizar como "huellas dactilares" únicas, dependiendo de la citocina utilizada.

Las muestras biológicas complejas, como las secreciones sebáceas de mamíferos, requieren un paso de purificación antes del análisis MALDI. La cromatografía en capa fina es una de esas técnicas que se basa en la polaridad de los componentes. Los compuestos se recogen del paté de TLC, se purifican y se transfieren a una matriz MALDI. Los espectros resultantes verifican la identidad y pureza de las biomoléculas separadas de las secreciones sebáceas de los mamíferos.

Otra fuente común de iones para las biomoléculas es la ionización por electrospray, o ESI. En este método, la muestra se inyecta en el instrumento, donde se aplica un alto voltaje, creando un aerosol de gotas cargadas. A medida que el solvente en la gota se evapora, la carga se mueve a las moléculas de la muestra, hasta que son completamente gaseosas. ESI no requiere el procedimiento de detección y la muestra se puede inyectar directamente en el instrumento. Por otro lado, ESI es más sensible a la presencia de componentes tampón y otros contaminantes, lo que significa que MALDI es más robusto.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la espectrometría de masas MALDI. Este video describió la teoría detrás del instrumento, repasó un procedimiento general y cubrió algunos de los usos de la técnica. ¡Gracias por mirar!