Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

El objetivo general de este procedimiento es realizar imágenes radiométricas de calcio de los efectos de la actividad de la neurona hermafrodita específica, o HSN, en el comportamiento de Caenorhabditis elegans. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia conductual sobre cómo la actividad de los circuitos neurológicos produce cambios en el comportamiento animal a medida que los animales alternan entre estados de comportamiento. Esta técnica permite registrar los cambios en la actividad del calcio intracelular con una alta relación señal/ruido, al mismo tiempo que rastrea el comportamiento y la locomoción de los animales.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la actividad neuronal en C. elegans, también se puede aplicar a otros sistemas modelo transparentes, como las larvas de Drosophila y el pez cebra. Demostrando el procedimiento conmigo, estarán los estudiantes de Collin's Labs: Richard Kopcock, Pravat Dhakal y Layla Nassar. Para montar los animales, primero aplique el alimento bacteriano OP50 de una placa de agar de medio de crecimiento de nematodos sembrados a la parte inferior de un pico de gusano de platino y use el pico para transferir aproximadamente 20 L tardío cuatro L-X 2, 000 para animales que expresan el reportero de calcio sensible GCaMP5 y mCherry en HSN desde el promotor N-L tres P a una placa de medio de crecimiento de nematodos sembrados.

Confirme la presencia de la vulva en desarrollo bajo un microscopio estereoscópico como una mancha oscura clara rodeada por una media luna blanca e incube los gusanos a 20 grados centígrados durante 24-40 horas. Al final de la incubación, aplique OP50 a una nueva selección y transfiera tres lombrices a una placa de medio de crecimiento de nematodos sin semillas, dejando una pequeña porción de alimento en la nueva placa para que las lombrices se alimenten durante la toma de imágenes. A continuación, use una espátula plana y redondeada para cortar un trozo de 20 por 20 milímetros de la placa sin semillas y coloque el trozo, con el gusano hacia abajo, en un borde de un cubreobjetos limpio de 24 por 60 milímetros con el número 1.5.

Luego, deslice con cuidado el trozo de agar en el centro del cubreobjetos y coloque un cubreobjetos número uno de 22 por 22 milímetros encima del cubreobjetos para reducir la adherencia y la evaporación. Para configurar el generador de imágenes, coloque los gusanos en la platina de un microscopio invertido y seleccione el subjetivo 20x. Use los oculares binoculares para seleccionar un gusano para obtener imágenes y deslice el filtro infrarrojo y colóquelo sobre el condensador.

Abra un programa de análisis de vídeo adecuado y ejecute el script de comunicación final de la etapa XY de la etapa en serie. Haga clic en CsvWriter y seleccione una carpeta para guardar la información de las etapas X e Y grabadas. A continuación, haga clic en la punta de la flecha verde para inicializar el dispositivo de adquisición digital.

En el software de grabación de la cámara infrarroja, en configuración, seleccione Alternar cuadro de diálogo de control de la cámara. A continuación, seleccione el menú Modos de vídeo personalizados y seleccione Modo 1 y Formato de píxel Raw ocho. En Carrera del gatillo, establezca la línea de entrada del disparador en tres, la polaridad en alta y el modo en 14.

Toggle Enable para detener la adquisición de fotogramas hasta que se reciba la señal de disparo de voltaje de la cámara fluorescente. Con la ventana de visualización de imágenes abierta, haga clic en Grabar y seleccione la carpeta para guardar las secuencias de imágenes. Seleccione el modo de grabación en búfer y guarde las imágenes en formato JPEG.

A continuación, haga clic en Iniciar grabación para inicializar la adquisición. A continuación, abra la pestaña Capturar en el software de adquisición Florescence y establezca el tiempo de exposición en 10 milisegundos, el Binning en cuatro X y la Profundidad de imagen en 16 bits. Seleccione una submatriz de cámara centrada de 512 píxeles de ancho por 256 píxeles de alto.

El programa dividirá automáticamente la imagen ancha por la mitad para generar los canales de fluorescencia separados. Haga clic en Mostrar opciones de desencadenador de salida y establezca todos los desencadenadores en positivos. Confirme que el activador uno y el activador dos estén configurados en Exposición y que el activador tres esté configurado en Programable con un período de 25 milisegundos.

A continuación, en la pestaña de secuencia, seleccione Lapso de tiempo En Configuración de escaneo, establezca Retraso de campo uno en 50 milisegundos para recopilar imágenes a 20 hercios. Seleccione Guardar en búfer temporal. En Imágenes de calcio radiométricas, en la pestaña Secuencia, haga clic en Iniciar para comenzar a grabar y rastrear el gusano con el joystick manteniendo las células y sinapsis del interés enfocadas en el centro del campo de visión.

En el momento en que se inicia la grabación de fluorescencia, se envían disparadores a la cámara de campo claro en espera y al controlador de escenario que comienzan a recopilar imágenes sincronizadas y la posición del escenario. Haga clic en el botón Estadísticas de la ventana Histograma para mostrar las estadísticas de píxeles de cada canal. Ajuste la potencia del LED para garantizar un máximo de un solo píxel de fluorescencia mCherry en el extremo presináptico de más o igual a 8.000 recuentos en el canal rojo, lo que proporciona un rango dinámico de aproximadamente 12 bits por encima del fondo.

Las señales reporteras de calcio en el extremo presináptico durante el reposo o el bajo nivel de calcio deben ser de alrededor de 2.500 recuentos en el canal verde. Registre el comportamiento hasta que se alcance un estado activo de puesta de huevos. A continuación, guarde un subconjunto de 10 minutos que contenga 6.000 fotogramas antes y 6.001 fotogramas después del primer evento de puesta de huevos.

Tenga cuidado de mantener el mismo subconjunto de imágenes de campo claro del comportamiento del gusano y los puntos de tiempo de la posición de la etapa X-Y o se perderá la sincronización precisa de los flujos de datos. Para la segmentación de imágenes, importe las secuencias de imágenes en un programa de software de cuantificación radiométrica adecuado y haga clic con el botón derecho en la serie temporal en la pestaña de secuencia para establecer la serie temporal en 20 fotogramas por segundo y 1,25 micrómetros por píxel. En el menú Herramientas, seleccione Relación y, a continuación, seleccione mCherry para el canal A y GCaMP5 para el canal B y haga clic en Calcular para restar el fondo de cada secuencia de imágenes.

Seleccione Aplicar una tabla de búsqueda de arco iris al canal de relación y utilice el canal mCherry para generar un canal de relación modulada por intensidad para asignar el color de la relación al brillo del canal mCherry. Haga clic en Relación para generar los dos canales. Para crear en el protocolo de búsqueda de objetos, arrastre la herramienta Buscar objetos usando intensidad en la pestaña de mediciones al panel de protocolo y haga clic en el engranaje para establecer la ventana de valores de intensidad de mCherry y para Buscar objetos.

Seleccione valores de intensidad mayores o iguales a dos desviaciones estándar por encima del fondo, teniendo cuidado de que se detecte el cuerpo celular y el extremo presináptico. Agregue cualquier filtro adicional dirigido al canal mCherry solo cuando sea necesario para excluir objetos no deseados, como: cabeza, cola o florescencia intestinal. A continuación, abra el menú Mediciones y seleccione Hacer elemento de medición y elija todos los puntos de tiempo para ejecutar el protocolo de análisis de cuantificación de la imagen.

La adquisición simultánea de señales de florescencia GCaMP5 y mCherry se utiliza para generar un canal de relación píxel a píxel que compensa los cambios en el movimiento y el enfoque de los animales. Para cada animal, los cambios en el calcio HSN intracelular presináptico se pueden correlacionar con comportamientos evidentes en las imágenes de campo claro, incluida la liberación de huevos y los cambios en la locomoción. De hecho, se pueden observar diferencias significativas en la velocidad del gusano antes, durante y después del estado activo de puesta de huevos.

Al acercarse a un evento de puesta de huevos, se revela un cambio robusto en la florescencia de GCaMP5 antes del evento de puesta de huevos. Mientras que la floración de mCherry se mantiene relativamente sin cambios. Además, los cambios medidos en la proporción GCaMP5:mCherry muestran claramente un transitorio de calcio HSN unos 4 segundos antes de la liberación del huevo.

El resultado es una contracción del músculo vulvar evidente de una clara ralentización de la locomoción del gusano que termina con la liberación de los huevos. Además, la obtención de imágenes y el seguimiento de los gusanos, como se acaba de demostrar, permiten visualizar la organización espacial del comportamiento de la puesta de huevos a partir de la búsqueda de alimento, los cambios transitorios de calcio HSM y la actividad HSN que pasa a un disparo en ráfaga antes de la locomoción al lugar de puesta de huevos. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en una o dos horas, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el enfoque en las células de interés y sus terminales presinápticas durante los pasos de obtención de imágenes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la Activación Optogenética, para responder preguntas adicionales sobre cómo responde el HSN a la estimulación presináptica. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploren la función del circuito de puesta de huevos en C. elegans.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes radiométricas de calcio de HSN en Caenorhabditis elegans activo.