Utilizando un sistema de enriquecimiento integral inmunoprecipitación para identificar un perfil endógeno modificación poste-de translación de proteínas blanco
8 de enero de 2018
Investigando múltiples, modificaciones post-traduccionales endógenas para una proteína de la blanco pueden ser extremadamente difíciles. Técnicas descritas aquí utilizan un sistema de buffer y filtro de lisis optimizado desarrollado con metas específicas de PTM, matrices de afinidad para detectar las modificaciones de fosforilación de tirosina, acetilación, ubiquitinación y sumoilación 2/3 para un objetivo proteína mediante un sistema único y aerodinámico.
El objetivo general de este protocolo experimental es permitir que los investigadores de PTM sin experiencia determinen de manera efectiva si su proteína objetivo es modificada endógenamente por uno o más PTM utilizando un único sistema integral. Este método mejorará la investigación en el campo de la modificación postraduccional al permitir la detección de PTM clave y la posible diafonía para cualquier proteína objetivo utilizando un sistema único y simplificado. La principal ventaja de esta técnica es que los no expertos en PTM pueden detectar si una proteína es modificada endógenamente por uno o más PTM en su sistema modelo.
Primero tuvimos la idea de este método mientras estudiábamos los mecanismos reguladores de varias vías de señalización celular, y descubrimos que nuestros kits o sistemas fáciles de usar no estaban realmente disponibles para estudiar PTM no fosfométricos. Comience este procedimiento con la preparación de células A431, como se describe en el protocolo de texto. Además, prepare la lisis del blaster en tampones de dilución con inhibidores.
Vierta los medios de cultivo y coloque las células en hielo. A continuación, lavar las células dos veces con 10 mililitros de solución salina tamponada con 1x fosfato. Elimine la mayor cantidad posible de PBS antes de agregar el tampón de lisis del blaster para maximizar la lisis celular.
Agregue 600 microlitros de tampón de lisis blaster a cada placa de 150 milímetros. La cantidad de tampón se basa en el rendimiento proteico esperado. A continuación, lise las células con un raspador de células.
El lisado se volverá viscoso debido a la lisis nuclear. Utilice una punta de pipeta cortada de un milímetro para transferir el lisado crudo a un filtro blaster que se ha colocado en un tubo de recolección de 15 mililitros. Utilice el émbolo del filtro suministrado para comprimir completamente el filtro blaster y recoger el flujo de lisado, incluidas las burbujas, en un tubo de 15 mililitros.
El filtro blaster simple y eficiente elimina el ADN genómico, en lugar de cortarlo como se ve en otros métodos comúnmente utilizados. Diluir el lisado clarificado con tampón de dilución blaster hasta un volumen final de tres mililitros por cada placa de 150 milímetros. El volumen final se basa en el rendimiento proteico esperado.
Este paso es importante, ya que la composición final del tampón afectará la rigurosidad de la reacción de precipitación de aminoácidos. A continuación, prepare el ensayo de cuantificación de proteínas, tal y como se describe en el protocolo de texto. Mida la absorbancia de la muestra de lisado a 600 nanómetros y calcule la concentración de proteína.
Invierta el tubo de reactivo original varias veces para asegurarse de que las perlas se resuspendan completamente en el tubo. Para cada ensayo IP, alícuota la suspensión de perlas en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitros sobre hielo. Aquí, agregue 20 microlitros de perlas de afinidad de ubiquitina, 30 microlitros de perlas de afinidad de fosfotirosina, 40 microlitros de perlas de afinidad SUMOilation 2/3 o 50 microlitros de perlas de afinidad de acetilación a los tubos de microcentrífuga individuales.
Invierta varias veces los tubos de reactivos de stock que contienen perlas de control IP de ubiquitinación y perlas de control IGG para asegurarse de que las perlas se resuspendan completamente en el tubo. A continuación, alícuota las cuentas de control por reacción de control para determinar el enlace no específico. Aquí, agregue 20 microlitros de perlas de control de ubiquitina, 30 microlitros de perlas de control de fosfotirosina, 40 microlitros de perlas de control SUMOilation 2/3 o 50 microlitros de perlas de control de acetilación a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros en hielo.
Guarde 20 microlitros de lisado para ejecutarlo como control de lisado de entrada de Western blot. Añadir cinco microlitros de tampón de muestra 5x al lisado reservado y hervir a 95 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, agregue lisado a cada tubo IP y controle el tubo IP.
En este caso, se utilizó un miligramo de lisado por IP y reacción de control, lo que dio como resultado un total de ocho reacciones IP. incubar los tubos en un extremo y plataforma giratoria a cuatro grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, recoja las perlas por centrifugación a tres a 5.000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados.
Aspire la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar las perlas, luego lave las perlas en un mililitro de tampón de lavado blaster durante cinco minutos en una plataforma giratoria de cuatro grados centígrados y recoja las perlas por centrifugación como antes. Después de la centrifugación, aspire la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar las perlas y repita el paso de lavado dos veces más. Después del lavado final y la centrifugación, aspire la mayor parte en el sobrenadante tampón, luego elimine el sobrenadante residual con una punta de carga de proteínas de diámetro fino.
Es aceptable una interrupción mínima de la bolita de cuentas. Asegúrese de que se haya eliminado todo el tampón de lavado y minimice la interrupción del pellet de batido para maximizar la recuperación de sus proteínas PTM. A continuación, agregue 30 microlitros de tampón de elución de perlas y vuelva a suspender las perlas golpeando o golpeando suavemente el costado del tubo.
No utilice una pipeta en esta etapa. Incube las perlas resuspendidas a temperatura ambiente durante cinco minutos. Corte el extremo de la punta de la pipeta de transferencia y transfiera suavemente cada suspensión de cuentas a una columna de centrifugación de microcentrífuga de 1,5 mililitros que se ha colocado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar la muestra a una velocidad de entre nueve y 10.000 veces G durante un minuto a temperatura ambiente para recoger la muestra IP, luego añadir dos microlitros de 2-mercaptoetanol a cada muestra y mezclar bien. Coloque las muestras en un baño de agua a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, recoja la muestra por centrifugación a 10.000 veces G durante un minuto a temperatura ambiente.
Por último, proceda a ejecutar el análisis SDS PAGE, transfer y western blot tal y como se describe en el protocolo de texto. Se añadió lisado de células A431 no tratado y tratado con EGF a las perlas de afinidad de ubiquitina, fosfotirosina, SUMO 2/3 y acetil lisina. Se utilizó un anticuerpo PD-L1 para el análisis de inmunotransferencia occidental para determinar si la proteína PD-L1 fue modificada por estos cuatro PTM en respuesta a la estimulación de EGF.
Los resultados representativos mostrados aquí indican que este método identifica eficazmente las modificaciones endógenas de PTM de PD-L1. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro a 4 1/2 horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo detectar PTM enógeno o diafonía para su proteína objetivo o vía de señalización mediante el uso de este completo sistema de detección de PTM.
Descripción general
Este artículo presenta un método simplificado para detectar múltiples modificaciones post-traduccionales endógenas (PTMs) de proteínas diana. La técnica utiliza un tampón de lisis optimizado y un sistema de filtro para facilitar la identificación de acetilación, ubiquitinación, SUMOilación 2/3 y fosforilación de tirosina.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Modificaciones postraduccionales
Antecedentes
- Las modificaciones postraduccionales desempeñan un papel fundamental en la función de las proteínas.
- La detección simultánea de múltiples PTM puede resultar complicada.
- Los métodos existentes a menudo carecen de sistemas fáciles de usar para no expertos.
- Este estudio aborda la necesidad de un método integral de detección.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo simplificado para detectar PTM endógenas.
- Permitir que investigadores sin experiencia en PTM estudien modificaciones proteicas.
- Mejorar la comprensión de la interacción entre PTM en la señalización celular.
Métodos Utilizados
- Preparación de células A431 y lisis utilizando un tampón de lisis blaster.
- Uso de matrices de afinidad para PTM específicas.
- Cuantificación de proteínas y ensayos de inmunoprecipitación.
- Análisis por inmunotransferencia para confirmar modificaciones por PTM.
Resultados Principales
- El método identifica eficazmente las modificaciones endógenas de PD-L1.
- Los resultados indican la detección exitosa de múltiples PTM en respuesta a la estimulación con EGF.
- Este enfoque es reproducible y fácil de usar para los investigadores.
Conclusiones
- El método descrito simplifica la detección de diversas PTM.
- Permite una participación más amplia en la investigación de PTM entre los científicos.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar la comprensión de la regulación proteica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección de modificaciones postraduccionales (PTM) endógenas es fundamental para la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. Este método permite la evaluación simultánea de acetilación, ubiquitinación, SUMOilación 2/3 y fosforilación de tirosina, proporcionando un enfoque simplificado para evaluar la interacción entre PTM y los estados funcionales de las proteínas. Al reducir las barreras técnicas para los no expertos, facilita perfiles de PTM reproducibles y escalables en los flujos de trabajo de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la determinación del estado endógeno de PTM en proteínas diana.
- Valor operativo: Reduce la ambigüedad mecanicista mediante la detección directa de múltiples PTM en una única preparación de lisado.
- Valor predictivo: Apoya la evaluación de la confianza en la diana al revelar patrones de modificación que podrían influir en la estabilidad, actividad o interacciones de la proteína.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayos: Genera un lisado clarificado compatible con inmunoprecipitación posterior y análisis por inmunotransferencia.
- Reproducibilidad: Utiliza un sistema de lisis desnaturalizante y filtración para eliminar el ADN genómico, minimizando la variabilidad en el enriquecimiento de modificaciones postraduccionales (PTM).
- Escalabilidad: Compatible con formatos de múltiples pocillos y reacciones de control para evaluar la unión no específica entre réplicas.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite el perfilado de PTM en sistemas relevantes para enfermedades, como células A431 estimuladas con EGF, vinculando el descubrimiento con la modulación de vías.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Facilita la evaluación de la interacción entre PTM, que es común en las redes de señalización y fundamental para predecir resultados funcionales.
- Alineación Preclínica: Apoya investigaciones relacionadas con biomarcadores mediante la identificación de estados de modificación endógenos que responden a estímulos.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde el acoplamiento al blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando datos de modificaciones postraduccionales que orientan ensayos funcionales y relaciones estructura-actividad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al determinar si una proteína diana experimenta modificaciones endógenas bajo condiciones basales o estimuladas.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos de enriquecimiento de PTM que pueden normalizarse y compararse entre distintas condiciones o tratamientos con compuestos.
- Análisis: Genera muestras listas para inmunotransferencia que permiten evaluar de forma semicuantitativa los niveles de modificación y su estequiometría.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica mediante la evaluación de la dinámica de PTM en modelos celulares de relevancia para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada de detección de PTM aplicable a múltiples dianas y proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir los falsos negativos derivados de la omisión de PTM.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante la estandarización de la lisis, filtración y enriquecimiento basado en perlas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al permitir la detección temprana de la variabilidad funcional impulsada por PTM.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al identificar objetivos con patrones de modificación asociados a la actividad de la vía.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de inmunoprecipitación y western blot.
- Depende del acceso a centrifugación, plataformas de rotación y matrices de afinidad compatibles.
- Necesita la estandarización de las condiciones de lisis y lavado entre usuarios y laboratorios.
- La adaptación a sistemas modelo alternativos puede requerir la optimización de la compatibilidad del tampón de lisis.
- Limitación práctica: la detección de señales de PTM depende de la especificidad del anticuerpo y de la abundancia de la modificación.
