Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

El objetivo general de este protocolo es identificar objetivos del huésped que puedan manipularse para mejorar la terapia con virus oncolíticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia con virus oncolíticos, como qué factores específicos del huésped y vías celulares modulan la replicación del virus oncolítico. La principal ventaja de esta técnica es que permite identificar objetivos del huésped que pueden ser manipulados para mejorar la terapia con virus oncolíticos de una manera integral e imparcial.

Este protocolo también se puede utilizar para identificar los factores del huésped que modulan la replicación del virus en general. Después de desarrollar un ensayo de detección de alto rendimiento de acuerdo con el protocolo de texto, retire un lote de placas de microtitulación del congelador y deje que se descongelen durante 20 a 30 minutos. Mientras tanto, llene dos botellas con etanol al 70%, luego llene dos tubos cónicos de 50 ml con PBS y uno con agua destilada.

Sumerja el tubo del dispensador de líquido en una botella de etanol al 70% y, a continuación, coloque un trozo de cinta adhesiva alrededor del tubo para marcar el punto por debajo del cual el tubo puede considerarse estéril. Utilice aproximadamente 25 ml de etanol al 70% para cebar el tubo. Vierta etanol adicional en la botella para reemplazar el volumen perdido, luego deje reposar el tubo en etanol durante un mínimo de cinco minutos.

Después de preparar la campana de cultivo celular, centrifugar las placas selladas y fraguadas a 1026 veces G a temperatura ambiente durante dos minutos. A continuación, retire los sellos de las placas. A continuación, pipetee la cantidad necesaria de reactivo de transfección en los tubos cónicos que contienen el diluyente de reactivo de transfección precalentado.

Comience a tripsinizar las células aspirando el medio de cada placa. Use nueve ml de PBS para enjuagar las células, luego pipetee tres ml de tripsina por placa. Incuba las células a 37 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos.

Luego, use 22 ml de medio para resuspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Combine la suspensión celular de cada placa de cultivo de tejidos en un frasco estéril y mezcle la suspensión celular invirtiendo el frasco. A continuación, pipetea un mL de aliquats en la suspensión celular en dos tubos de microfuga separados.

Retire la muestra de cada tubo de microfuga y cuente las células. A continuación, calcule el volumen de suspensión celular necesario para la densidad requerida y prepare suficiente suspensión celular diluida para dispensar en un lote de placas. Mientras se preparan las celdas, vacíe el tubo del dispensador de líquido de etanol.

Use aproximadamente 25 ml de PBS para cebar el tubo y luego vacíelo. Asegúrese de que la parte del tubo que se sumergirá en el reactivo de transfección, y posteriormente en la suspensión celular, se mantenga estéril. Separe las placas que se pueden hacer de manera segura con un tubo cónico de solución reactiva de transfección.

Pipetee las soluciones de reactivo de transfección hacia arriba y hacia abajo 10 veces. A continuación, utilice la solución para cebar el tubo antes de dispensar 5 microlitros por pocillo. Centrifugar las placas a 1026 veces G a temperatura ambiente durante un minuto.

A continuación, incubar las placas a temperatura ambiente durante el tiempo prescrito para el reactivo de transfección que se está utilizando. Durante la incubación, vacíe el tubo de la solución reactiva de transfección y colóquelo en un tubo cónico completo de 50 ml que contenga PBS. Luego use aproximadamente 25 ml de PBS para enjuagar el tubo cebándolo y luego vaciándolo.

Mezcle el frasco que contiene la suspensión celular, luego coloque el tubo en la suspensión y cebe el tubo lo suficiente como para ver que cada punta se dispense correctamente. Dispense 30 microlitros por pocillo de la suspensión celular en todas las placas. Vacíe la suspensión celular del tubo, luego enjuague el tubo con aproximadamente 25 ml de PBS seguido de aproximadamente 50 ml de agua destilada.

Deje reposar las placas a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos desde el momento de la siembra de las células. A continuación, incube las placas en una incubadora inalterada durante el tiempo deseado de silenciamiento génico. Para ahorrar tiempo, el día antes de infectar las células, pipetee en frascos estériles la cantidad precisa de medio necesaria para infectar cada lote de placas, incluido el medio para los pocillos no infectados.

Caliente el medio a 37 grados centígrados, luego llene dos botellas con etanol al 70%, dos tubos cónicos de 50 ml con PBS y uno con agua destilada. Esterilice el tubo con etanol al 70% como se demostró anteriormente. Mientras el tubo está asentado en el etanol, primero haga un vórtice del virus y luego pipetee el volumen preciso de virus requerido en la botella de medio de infección.

A continuación, enjuague el tubo con 25 ml de PBS para cebarlo y luego vacíelo. Después de retirar las placas de la incubadora, colóquelas en la campana de cultivo de tejidos. Use medio para cebar el tubo, luego dispense 40 microlitros de medio en los pocillos de control no infectados.

Vacíe el tubo de medio y use 25 ml de PBS para enjuagarlo. Después de mezclar el virus, coloque el tubo en la botella que contiene el virus, dispense 40 microlitros de virus en los platos. Centrifugar las placas a 400 veces G a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Incubar las placas durante el tiempo previamente determinado. El día antes de la fijación, prepare una botella de solución de fijación y reposo que contenga un cuatro por ciento de formaldehído y PBS para cada lote de placas, pero omita la mancha de Hoechst. Guarde la solución en el armario inflamable lejos de la luz.

Al día siguiente, use etanol al 70% y PBS para enjuagar el tubo como se demostró anteriormente. Dispense 30 microlitros de la solución en todas las placas, luego coloque las placas en la incubadora durante 30 minutos. Después de la incubación, aplique los sellos a las placas y guárdelas a cuatro grados centígrados protegidos de la luz.

Realice imágenes y análisis de acuerdo con el protocolo de texto. Aquí se muestran 786 células O teñidas con Hoechst 33342 después de una incubación de 72 horas con diluyente de reactivo de transfección solo. Reactivo y diluyente de transfección, siRNA no dirigido y con siRNA dirigido a PLK1.

El gráfico de supervivencia que se ve aquí indica que el 22% de las células transfectadas con siRNA PLK1 sobrevivieron, y el 94% de las células transfectadas con siRNA no objetivo sobrevivieron. Este gráfico muestra los resultados del curso en tiempo real de 786 células O infectadas con el virus vaccinia oncolítico que expresan GFP mejorada en varios MOI. Aquí se muestran imágenes representativas de células infectadas a un MOI de 0,05 durante un curso de tiempo en vivo.

Un período de incubación de 21 horas permitiría detectar aumentos y disminuciones en la propagación, ya que el punto de tiempo está dentro de un rango lineal. Después de las pruebas de detección de ARNi de todo el genoma en tres líneas celulares tumorales, se identificaron 1008 resultados comunes a al menos dos de las tres líneas celulares cancerosas utilizando el método MAD. Se seleccionaron 10 aciertos dentro de las vías UPR y ERAD para la validación secundaria a través de siRNA con diferentes secuencias dirigidas.

Al dispensar reactivos, es fundamental que tenga el lote correcto de placas, que haya seleccionado el volumen correcto para la dispensación y que el tubo se haya llenado con el reactivo correcto y siempre esté completamente sumergido en el reactivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un cribado de ARNi de alto rendimiento para identificar objetivos del huésped que se pueden manipular para mejorar la terapia con virus oncolíticos, o para identificar los factores del huésped que modulan la replicación del virus en general.