Name: Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprende a realizar un cribado de RNAi de alto rendimiento para identificar factores del huésped que modulan la terapia con virus oncolíticos. Este método permite descubrir dianas celulares que mejoran la replicación viral de manera integral y sin sesgos.

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Este trabajo fue apoyado por becas del Instituto de Ontario para la investigación del cáncer, la Fundación de Canadá para la innovación, la Fundación de cáncer Regional de Ottawa y el Instituto de investigación del zorro de Terry. K.J.A. fue apoyado por una beca postgrado Vanier Canadá, un Instituto canadiense de salud investigación-Master Award y una beca de postgrado de Ontario.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí presentamos un protocolo para el empleo de proyección de ARNi de alto rendimiento para identificar objetivos de host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos. Esto ha sido probado con éxito con oncolíticos Maraba virus y virus de la vaccinia oncolíticos, pero, como se ha señalado, puede ser adaptado para su uso con otros virus oncolíticos u otros virus generalmente para identificar host genes que modulan la replicación del virus. El protocolo de investigación también está diseñado para id...

Proyección de alto rendimiento genoma ARNi ha demostrado para ser una valiosa herramienta para revelar conocimientos biológicos en diversas áreas de estudio como la biología del virus. Lo largo de la última década, han realizado numerosos grupos celulares a gran escala ARNi screening para identificar ampliamente genes host que modulan la replicación del virus (revisado en1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). Curiosamente, un gran número de estas pantallas se han realizado en células de cáncer y varios virus que son candidatos de virus oncolíticos actuales incluyendo el vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12, estomatitis vesicular virus13,14y Maraba virus15. Mientras que el foco de la mayoría de estos estudios fue en la identificación de factores de huésped que influyen en algún aspecto de la replicación del virus y no en la identificación de objetivos bioterapéuticos para mejorar la terapia de virus oncolíticos, datos valiosos pueden ser extraídos de estos conjuntos de datos en este sentido. Está claro que el potencial de gran alcance para identificar objetivos de host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos no ha sido plenamente explotado.
Una gran cantidad de plataformas de virus oncolíticos se están probando en estudios clínicos y preclínicos incluyendo herpes simplex virus, reovirus y vaccinia virus, que han tenido éxito demostrable en ensayos clínicos de última etapa. Para la mayoría de estas plataformas, los esfuerzos se han dirigido hacia alterar los genomas de virus para mejorar la terapia. Por ejemplo, para aumentar la especificidad del tumor, genes de virus específico han sido eliminados o transformado para restringir significativamente la replicación viral en las células normales, pero no en las células del tumor. En algunos casos, se han añadido los transgenes como GM-CSF (factor de estimulante de colonias de macrófagos en granulocitos) para potenciar la respuesta inmune o NIS (symporter del yoduro de sodio) para permitir la proyección de imagen in vivo y la absorción celular del radioiodide para terapéutica propósitos. Sin embargo, ha habido muy poco trabajo centrado en manipular los genes del anfitrión, tumor y explorar el impacto de genes del anfitrión, tumor en la replicación de virus oncolíticos. Con el advenimiento de la tecnología de proyección de alto rendimiento, ahora es posible para sondar interacciones virus host en una escala genoma y descifrar oportunidades para manipular el genoma del anfitrión para mejorar la terapia de virus oncolíticos (revisado en16, 17,18).
Nosotros reportamos el primer estudio que prueba-de-concepto para usar la investigación para identificar los host objetivos que podrían ser manipulados para mejorar la terapia de virus oncolíticos genética de alto rendimiento. Para descubrir genes de host que modulan Maraba virus oncolysis, un rhabdovirus oncolíticos están probando en fase I y II de ensayos, realizamos pantallas de RNAi del genoma a través de tres líneas celulares de tumor diferentes por duplicado con un siRNA (short interferencia RNA) Biblioteca dirigido a 18.120 genes15. Análisis de la vía de golpes en las pantallas revelaron enriquecimiento de los miembros de las vías de respuesta de estrés de ER (retículo endoplásmico). Se seleccionaron 10 golpes de estas vías para validación secundaria usando siRNA con secuencias de objetivos diferentes de los de la pantalla principal. Como parte de la validación terciario, se realizó un experimento de rescate con IRE1α (inositol-requerir alpha enzima 1) para confirmar que el golpe estaba en blanco. In vitro y en vivo la prueba usando un inhibidor de molécula pequeña de IRE1α dio lugar a eficacia dramáticamente mejorada oncolíticos.
Workenhe et al. 12 también realizó una pantalla de RNAi del genoma con un shRNA lentivirales combinado (horquilla corto RNA) Biblioteca dirigida a 16.056 genes para identificar los factores de host restringir el virus herpes simple humano tipo 1 oncolysis de KM100-mediados de (HSV-1) de mutante de mama células cancerosas. En la pantalla principal, identificaron 343 genes la caída de que conducen a mayor citotoxicidad de células infectadas KM100 sobre células infectadas con mofa; seleccionaron 24 de estos genes para la validación secundaria. De los 24 genes, 8 genes fueron confirmados en la pantalla secundaria con uno de ellos ser SRSF2 (arginina-serina/rico empalmar factor 2) que posteriormente fue confirmado mediante un experimento de rescate genético durante la validación terciario. El grupo pasó a identificar un ADN inhibidor de la topoisomerasa quimioterapéutico que reduce la fosforilación de la SRSF2 y demostró que el tratamiento combinado de KM100 de HSV-1 con el plomo de este inhibidor a la prolongada supervivencia de ratones con tumores TUBO.
En los estudios antes mencionados, fue seguido un flujo de trabajo similar. Cada uno comenzó con una pantalla de ARNi genoma principal seguida por una pantalla secundaria en un número selecto de aciertos identificados en la pantalla principal. Esto fue seguido por el terciario validación estudios, confirmando que el golpe era en blanco realizando genética rescate de experimentos in vitro con validación definitiva realizada por manipular el objetivo gen producto en vivo. En este artículo, ofrecemos primero un protocolo general para el desarrollo y validación de un ensayo de siRNA-proyección de alto rendimiento, que consiste en determinar las condiciones óptimas de la transfección, cantidad de virus y la longitud de la infección. También ofrecemos un protocolo detallado para la realización de una primaria, una pantalla de siRNA de alto rendimiento así como una descripción general del método para realizar validación de pantalla secundario y terciario validación.

<table><tbody><tr><td>Consumibles</biblioteca ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td> fuerte <td>GE Dharmacon</td><td>G-005005-02</td><td></td></tr><tr><td>Corning Placa de 384 pocillos Corning</td><td></td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placa de 384 pocillos</td><td>Becton Dickinson</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SMARTpool PLK1</td><td>GE Dharmacon</td><td>M-003290-01</td><td></td></tr><tr><td>AllStars Control negativo siRNA</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>siGenome Pool de siRNA no objetivo #2</td><td>GE Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ALTA glucosa</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F15051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución HEPES (1M)</td><td>Sigma</td><td>H3535-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina 100X</td> GE <td>Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modificado</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778100</td><td></td></tr><tr><td>Oligofectamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1225011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica Resazurin</td><td>Sigma</td><td>R7017-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído (37% en peso)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-4</td><td></td></tr><tr><td>botellas de 500 ml</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430282</tr><tr><td>Película de sellado adhesiva para microplacas</td><td>Excel Scientific</td><td>361006007</td><td></td></tr><tr><td>Lámina de sellado térmico pelable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3720</td><td></td></tr><tr><td>BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-625</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalogo Número</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td>MicroFlo Select (dispensador de líquidos)Fisher Scientific 11120621 Lector de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas BioTek Synergy HT Biotek</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opera Instrumento de imagen y análisis</td><td>PerkinElmer</td><td>HH10000115</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brazo robótico KiNEDx</td><td>Análisis y automatización de picos (anteriormente Peak Robotics)</td><td>KX-300-660</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora automatizada de la serie Cytomat 24C</td> Estación de trabajo automatizada <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50080227</td><td></td></tr><tr><td>JANUS</td><td>PerkinElmer</td><td></td> Carrusel de placas AJI4M01 <td></td></tr><tr><td></td><td>Análisis y automatización de picos (anteriormente Peak Robotics)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Selladora</td> <td>de placas Alps 3000Termo Fisher Scientific</td><td>AB-3000</td><td></td></tr></tbody></table>

detección del genoma-ancha de rnai para identificar los host factores que modulan la terapia de virus oncolíticos

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Tecnología de proyección de alto rendimiento genoma ARNi (ARN de interferencia) ha sido ampliamente utilizada para descubrir factores de huésped que afectan la replicación del virus. Aquí presentamos la aplicación de esta tecnología para descubrir destinos host que modulan específicamente la replicación de Maraba virus un rhabdovirus oncolíticos y virus de la vacuna con el objetivo de mejorar la terapia. Mientras que el protocolo ha sido probado para su uso con oncolíticos Maraba virus y virus de la vaccinia oncolíticos, este enfoque es aplicable a otros virus oncolíticos y también puede ser utilizado para la identificación de objetivos de host que modulan la replicación del virus en células de mamíferos en general. Este protocolo describe el desarrollo y validación de un ensayo para la detección de alto rendimiento RNAi en células mamíferas, las consideraciones claves y pasos de preparación importantes para la realización de una pantalla principal de ARNi de alto rendimiento y una guía paso a paso para realización de una pantalla principal de ARNi de alto rendimiento; Además, describen ampliamente los métodos para llevar a cabo estudios de validación terciaria y secundaria pantalla validación. El beneficio de alto rendimiento RNAi es que permite catalogar, de una manera amplia e imparcial, factores de huésped que modulan cualquier aspecto de la replicación del virus para el cual uno puede desarrollar un ensayo en vitro como la infectividad, explosión de tamaño, y la citotoxicidad. Tiene el poder para descubrir imprevistos bioterapéuticos objetivos basados en el conocimiento actual.

Un resumen del flujo de trabajo para la identificación de objetivos de host para mejorar la terapia de virus oncolíticos se presenta en la figura 1.
Como se ilustra en la figura 1, el primer paso crítico a la realización de una pantalla de alto rendimiento RNAi es desarrollo de ensayos. Figura 2A proporciona un diseño de placa de muestra pa...

Aquí se describe un protocolo para el empleo de proyección de ARNi de alto rendimiento para descubrir destinos host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos, específicamente rhabodvirus y vaccinia virus terapia, pero puede adaptarse fácilmente a otros oncolíticos plataformas de virus o para descubrir genes de host que modulan generalmente replicación del virus.

Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

El objetivo general de este protocolo es identificar objetivos del huésped que puedan manipularse para mejorar la terapia con virus oncolíticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia con virus oncolíticos, como qué factores específicos del huésped y vías celulares modulan la replicación del virus oncolítico. La principal ventaja de esta técnica es que permite identificar objetivos del huésped que pueden ser manipulados para mejorar la terapia con virus oncolíticos de una manera integral e imparcial.Este protocolo también se puede utilizar para identificar los factores del huésped que modulan la replicación del virus en general. Después de desarrollar un ensayo de detección de alto rendimiento de acuerdo con el protocolo de texto, retire un lote de placas de microtitulación del congelador y deje que se descongelen durante 20 a 30 minutos. Mientras tanto, llene dos botellas con etanol al 70%, luego llene dos tubos cónicos de 50 ml con PBS y uno con agua destilada.Sumerja el tubo del dispensador de líquido en una botella de etanol al 70% y, a continuación, coloque un trozo de cinta adhesiva alrededor del tubo para marcar el punto por debajo del

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Nuevos factores de acogida implicados en la infección viral puede ser identificado a través de celulares basados ​​en el genoma pérdida de la función de detección de RNAi.

RNAi detección de los factores del huésped implicados en Vaccinia Infección del virus utilizando Drosophila Celdas

La Biblioteca de ID de destino es un plásmido basado en el genoma colección de cDNA clonado utiliza para identificar los genes miARN objetivos. Aquí nos demuestran su uso y aplicación.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

Aquí se utiliza una biblioteca LentiPlex humano común y tradicionales métodos de secuenciación de genes para identificar los objetivos de promover la supervivencia celular. Demostramos cómo configurar y deconvolute una pantalla LentiPlex y validar los resultados.

LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

En ensayos in vitro para medir la replicación del virus se han mejorado en gran medida por el desarrollo de virus de ARN recombinantes que expresan luciferasa u otras enzimas capaces de bioluminiscencia. A continuación te detallamos una tubería de cribado de alto rendimiento que combina dichas cepas recombinantes de virus del sarampión y chikungunya para aislar a los antivirales de amplio espectro de bibliotecas químicas.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

Se describen los métodos para evaluar la eficacia y toxicidad de las moléculas de ARN dirigidas a las etapas posteriores a la integración del ciclo de replicación del VIH-1. Estos métodos son útiles para el cribado de nuevas moléculas y la optimización del formato de las existentes.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Presentamos un protocolo para demostrar un sistema de transferencia génica somática novela utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo de ratón para estudiar la función de genes en la metástasis. El retrovirus aviares se entregan intracardiacally para asegurar la transferencia de genes en las lesiones premalignas, no invasivas de las células β pancreáticas en ratones adultos.

Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino

Aquí, presentamos los protocolos para identificar inmunomoduladores 1) virus-codificado que promueven la replicación de arbovirus y host 2) eucariotas factores que limitan la replicación de arbovirus. Estos métodos basados en fluorescencia y luminiscencia permiten a los investigadores obtener rápidamente lecturas cuantitativas de la replicación de arbovirus en análisis simplistas con proporciones bajas de señal a ruido.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

Este protocolo describe un flujo de trabajo detallado para la generación y ex vivo de caracterización de virus oncolíticos para expresión de inmunomoduladores, usando virus de sarampión codificación tienen células T actores como ejemplo. Aplicación y adaptación a otras plataformas de vector y los transgenes acelerarán el desarrollo de nuevos immunovirotherapeutics para la traducción clínica.

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

El cribado de interferencia de ARN (ARNi) de alto rendimiento utilizando un grupo de shRNAs lentivirales puede ser una herramienta para detectar dianas letales sintéticas terapéuticamente relevantes en neoplasias malignas. Proporcionamos un enfoque de detección de ARNt agrupado para investigar los efectores epigenéticos en la leucemia mieloide aguda (LMA).

Cribado agrupado de la biblioteca de shRNA para identificar los factores que modulan un fenotipo de resistencia a los medicamentos

Hemos desarrollado un enfoque de oncogenómica comparativa entre especies que utiliza análisis genómicos y cribados genómicos funcionales para identificar y comparar dianas terapéuticas en tumores que surgen en modelos de ratón modificados genéticamente y el tipo de tumor humano correspondiente.

Perfiles genéticos y cribado de abandono a escala genómica para identificar dianas terapéuticas en modelos murinos de tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos

La mutagénesis insercional es una herramienta esencial en genética avanzada para identificar elementos genómicos funcionales. Aquí, describimos el Cribado basado en la inserción para elementos funcionales y transcripciones (InSET), un método para detectar sitios de integración de lentivirus dentro de una biblioteca de células de mutagénesis de inserción basada en lentivirus.

Identificación de sitios de integración de lentivirus funcionalmente relevantes en una biblioteca de células de mutagénesis insercional

Aprende a realizar un cribado de RNAi de alto rendimiento para identificar factores del huésped que modulan la terapia con virus oncolíticos. Este método permite descubrir dianas celulares que mejoran la replicación viral de manera integral y sin sesgos.

Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

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