Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

El objetivo general de este ensayo de agregación es evaluar la unión del receptor Notch con transligandos y su inhibición por cis-ligandos. Este método puede ayudar a responder una pregunta clave: ¿Cómo afectará el factor genético o farmacológico a la unión del receptor Notch a su ligando, y a alterar la señalización? La principal ventaja de esta técnica es que permite evaluar la unión trans y cis del receptor Notch con su ligando.

Curiosamente, sin implicar el efecto de superposición del ligando endógeno. Comience la evaluación girando las celdas receptoras de señales y resuspendiéndolas en el medio de Schneider. Cuente las células manualmente con un hemacitómetro.

Placa cinco veces 10 hasta la quinta S2 y celdas estables S2-Notch en cada pocillo de una placa de seis pocillos, en un mililitro por pocillo del medio de Schneider. A continuación, añada 7,5 microgramos de ARN bicatenario a cada pocillo e incube las células a 25 grados centígrados durante 24 horas. Añadir 0,7 milimolares de sulfato de cobre para inducir la expresión de Notch, e incubar las células a 25 grados centígrados durante tres días.

Después de la incubación, cuente las células emisoras de señales manualmente con un hemacitómetro. Y placa cinco veces 10 a la sexta celdas estables en cada pocillo de una placa de seis pocillos, en un mililitro por pocillo de Medio de Schneider suplementado. A continuación, se añaden 0,7 milimolares de sulfato de cobre para inducir la expresión de ligandos, y se incuban las células a 25 grados centígrados durante tres horas.

Coseche las células S2-control y S2-Notch tratadas con ARN bicatenario mediante un pipeteo suave. Y placa 2,5 veces 10 a la quinta celda por pocillo en una placa de 24 pocillos. Agregue cinco veces 10 a la quinta célula estable de tomate S2-Delta o S2-Serrate para un volumen total de 200 microlitros de medio de Schneider suplementado.

Coloque la placa en un agitador orbital a 150 rpm. Después de un minuto, mezcle el contenido de cada pocillo y saque 20 microlitros para contar la cantidad de agregados. Al mismo tiempo, tome una imagen representativa bajo un microscopio compuesto invertido con un aumento de 10x.

Para visualizar las células, coloque la cámara en el microscopio y conéctese con el software para adquirir la imagen. Cuente manualmente los agregados con un hemacitómetro. Coloque el plato en la coctelera.

Repita la adquisición y el conteo de imágenes después de cinco minutos y 15 minutos de agregación. Realice la cuantificación de la transunión calculando el número de agregados por mililitro entre las células S2 y las células de tomate S2-Delta o S2-Serrate como control de fondo, y el número de agregados por mililitro entre las células de tomate S2-Notch y S2-Delta o S2-Serrate. Prepare las celdas receptoras de señal colocando cinco veces 10 a la quinta celda S2 en cada pocillo de una placa de seis pocillos, en un mililitro por pocillo de Medio de Schneider suplementado.

Agregue 7,5 microgramos de ARN bicatenario a cada pocillo e incube la placa a 25 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, cotransfecte las células tratadas con ARN bicatenario para obtener una concentración total de ADN de dos microgramos por pocillo utilizando un reactivo de transfección comercial. Incubar las células S2 transfectadas transitoriamente a 25 grados centígrados durante 24 horas.

Al día siguiente, agregue 0,7 milimolares de sulfato de cobre para inducir la expresión de Notch y los ligandos, e incube a 25 grados centígrados durante tres días. Prepare las celdas emisoras de señales como se describe en la sección anterior. Y, por último, realizar la agregación entre las células emisoras y receptoras de señales, como se ha descrito anteriormente.

Se observó un fuerte aumento en el número de agregados entre uno y cinco minutos. Luego, el número de agregados continuó aumentando hasta 30 minutos, a un ritmo más lento. Las imágenes que muestran la agregación en tres puntos de tiempo demuestran que las células S2-Notch tratadas con ARN bicatenario de EGFP formaron agregados con células S2-Delta, que aumentan en número con el tiempo.

Por el contrario, las células S2-Notch tratadas con ARN bicatenario formaron agregados más rápido, y los agregados fueron cada vez más grandes en número. Lo que indica que la disminución de los niveles de simulacros mejoró la transunión de Notch con Delta. La transfectación de cantidades iguales de construcciones de expresión Notch y Delta en las células S2 disminuye drásticamente el número de agregados formados entre estas células y las células S2-Delta.

Además, la disminución de la cantidad de cis-Delta da como resultado un aumento en el número de agregados. Lo que indica que en el rango de proporciones Notch/cis-Delta utilizadas en estos ensayos, cis-Delta puede inhibir la unión entre Notch y trans-Delta de manera dependiente de la dosis. La cuantificación de la agregación relativa mostró una inhibición comparable de la agregación tras el tratamiento con EGFP y ARN bicatenario.

Una vez que todos los reactivos están preparados, este ensayo es sencillo y se puede ejecutar en unas pocas horas.