$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Las enzimas son catalizadores bioquímicos esenciales para la vida. Los ensayos enzimáticos se utilizan para estudiar las propiedades cinéticas de las reacciones enzimáticas, dilucidando los efectos catalíticos de las enzimas. Este video cubrirá la cinética y los ensayos de enzimas, repasará un procedimiento general y mostrará algunas aplicaciones.
Las enzimas son proteínas, o con menos frecuencia ARN, que actúan sobre un reactivo específico, denominado sustrato. Una enzima reduce la energía de activación necesaria para iniciar una reacción bioquímica, lo que hace que la reacción ocurra a un ritmo más rápido.
Las reacciones enzimáticas se pueden dividir en tres componentes elementales. La primera es la formación del complejo enzima-sustrato, formado por la unión del sustrato al sitio activo de la enzima. El complejo puede descomponerse en sus componentes originales. Esta es la segunda reacción elemental. Alternativamente, el complejo puede formar el producto y recuperar la enzima, la tercera reacción elemental.
La cinética de una reacción elemental viene dada por la ecuación de la ley de la tasa elemental. Las ecuaciones de la ley de velocidad dan la tasa en términos de la concentración de los reactivos y una constante de velocidad. Cada una de las reacciones elementales tiene una ecuación de ley de velocidad individual, con su propia constante de velocidad. Estas ecuaciones se pueden resumir en un modelo cinético conocido como la ecuación de Michaelis-Menten. Esto da la velocidad de reacción en términos de la concentración de sustrato; que se pueden determinar experimentalmente. Algunas tendencias generales de las reacciones enzimáticas se pueden identificar utilizando la ecuación de Michaelis-Menten. A una alta concentración de sustrato, se alcanza un punto de saturación, llamado Vmax. Aquí, la tasa está limitada por la concentración total de la enzima y el número de moléculas de sustrato que una enzima convierte en producto en un tiempo dado, también conocido como kcat. En la cinética de Michaelis-Menten, kcat es una de las dos constantes que gobiernan la velocidad de reacción. La otra constante, KM, se conoce como constante de afinidad. KM también es equivalente a la concentración donde la velocidad de reacción es equivalente a medio Vmax . Una enzima con una mayor afinidad tendrá un KM más bajo y alcanzará la Vmax más rápido, mientras que una enzima con una afinidad más baja tendrá un KM más alto y tardará más en alcanzar la Vmax. Conocer kcat y KM permite comparar enzimas. Para ello, utilizamos una relación llamada eficiencia enzimática. Un kcat más alto y un KM más bajo dan como resultado eficiencias más altas, mientras que un kcat más bajo y un KM más alto dan como resultado una menor productividad.
Los factores utilizados para dilucidar la cinética de las enzimas deben determinarse experimentalmente. Estos ensayos generalmente se realizan mezclando una solución de enzima y sustrato en un entorno controlado. Las observaciones se realizan midiendo los cambios en la concentración del sustrato, producto o subproductos con respecto al tiempo.
El cambio en la concentración a lo largo del tiempo se utiliza para determinar la velocidad de reacción. Para determinar la cinética, se deben obtener datos de dosis a múltiples concentraciones. Si un gráfico de la tasa inicial inversa frente a la concentración inicial inversa, conocido como el diagrama de Lineweaver-Burk, es lineal, entonces la reacción sigue la cinética de Michaelis-Menten. La pendiente y la intersección de la línea permiten la determinación de los parámetros cinéticos KM y Vmax, que luego se pueden utilizar para calcular kcat y la eficiencia de la enzima.
Ahora que se han discutido los principios de la cinética de las enzimas, veamos cómo se realiza un ensayo enzimático típico.
En este procedimiento se demuestra un ensayo colorimétrico. ? El primer paso es generar una curva estándar, que correlacionará la absorbancia con la concentración de sustrato. Las soluciones de concentración conocida se preparan junto con una muestra de control. Se añade una solución reveladora que reacciona con el sustrato para producir un compuesto coloreado. La absorbancia se mide y se traza en función de la concentración para generar la curva estándar.
Para realizar el ensayo, se prepara una concentración conocida de sustrato junto con la cantidad adecuada de enzima. La enzima y el sustrato se mezclan y se dejan incubar durante un intervalo de tiempo determinado. El pH y la temperatura se controlan con soluciones tampón y bloques calefactores. Se agrega un agente de enfriamiento para detener la reacción. A continuación, se añade una solución de revelador a las reacciones y se mezcla. A continuación, las soluciones se colocan en cubetas y se mide la absorbancia. La cantidad de sustrato consumido se determina comparando la absorbancia medida con la curva estándar. Con los datos recopilados, las velocidades de reacción iniciales se determinan trazando la concentración a lo largo del tiempo. Finalmente, con los datos de tasa y concentración, se realiza el diagrama de Michaelis-Menten. Esto permite determinar las propiedades cinéticas de la enzima, como el número de rotación y la eficiencia de la enzima.
Ahora que hemos revisado un procedimiento de ensayo, veamos otras formas en que se realizan los ensayos y sus aplicaciones.
En este procedimiento, el análisis FRET se utiliza para estudiar la cinética de una proteasa que hidroliza un enlace peptídico de una proteína. Estas emisiones se pueden medir, lo que permite un análisis continuo y cuantitativo del consumo y la producción de sustrato, lo que ayuda a determinar la cinética de la reacción.
Los ensayos enzimáticos se pueden utilizar en ciencias ambientales para determinar los niveles de actividad enzimática extracelular en el medio ambiente. Las aguas, los suelos y los sedimentos pueden recogerse del medio ambiente y procesarse en el laboratorio. La actividad enzimática extracelular de estos materiales se puede caracterizar mediante ensayos enzimáticos. Esta es una herramienta útil para comprender cómo el medio ambiente procesa la materia orgánica.
El mecanismo de reparación del ADN de una célula se puede evaluar mediante el estudio de la cinética de las enzimas que se encuentran en el núcleo. La velocidad a la que una enzima elimina las lesiones o daños en el ADN se puede medir utilizando balizas moleculares fluorescentes, que solo emiten fluorescencia cuando se unen a secuencias de ADN únicas. El nivel de reparación del ADN se puede medir en tiempo real mediante la detección de los productos de escisión marcados con fluorescencia.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la cinética y los ensayos enzimáticos. Este video explicó la cinética de las enzimas, cubrió los conceptos de los ensayos, repasó un procedimiento general y describió algunas aplicaciones.
¡Gracias por mirar!
