Name: Co-cultivos de neurona y macrófagos para activar macrófagos secretando factores moleculares con actividad Neurite consecuencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a activar macrófagos mediante co-cultivos con neuronas DRG usando cAMP para inducir factores que promueven el crecimiento de neuritas. Este método revela interacciones celulares clave para la regeneración nerviosa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este protocolo es apoyado por una subvención de NRF-2015R1A2A1A01003410 del Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro, República de Corea.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso Comité de Ajou University School of Medicine.
1. cultura preparación de neurona disociado DRG adultos
<ol><li>Antes de configurar la cultura, la capa de una placa de 6 pozos con poly-D-lisina y laminina. Incubar una placa de 6 pozos con 0.01% poly-D-lisina a 37° C por 2 h o a 4° C durante la noche. Luego, lave la placa dos veces con agua destilada.</li>
	<li>Incube la placa con solución de laminina en una concentración de 3 μg/mL en 2 h a temperatura ambiente y lavar la placa dos veces con agua destilada. Secar la placa a temperatura ambiente al menos 1 h.</li>
	<li>Eutanasia a un ratón en una cámara de2 CO transparente conectado a una bombona de gas comprimida de CO2 . Haga una incisión en la piel que cubre la columna vertebral con una cuchilla quirúrgica y disecar los músculos paravertebral bilateral para exponer los huesos vertebrales. Quitar los huesos vertebrales meticulosamente con una pinza quirúrgica con punta estrecha hasta que en el GRD se expone completamente. Nota: Las neuronas DRG adultos se obtienen de ratones machos adultos C57BL6 entre 8 semanas a 12 semanas de edad.</li>
	<li>Retire el DRGs bilateralmente el S1 hasta el nivel de C1 con iridectomía tijeras y pinzas de punta fina con un microscopio de disección. Intente cortar las raíces de GRD para reducir al mínimo la contaminación de las células de Schwann o fibroblastos.</li>
	<li>Guarde los DRGs disecadas en un 60 mm placa de Petri que contiene 5 mL de frío de Dulbecco modificado Eagle medio (DMEM) en hielo hasta que todos los GRD se recoge. Nota: Es crítico para disecar el GRD lo antes posible. La colección de los DRGs de un ratón no debe tardar más de 30 min 30 min después de la eutanasia, dejar de recoger los DRGs y proceder al paso siguiente si todavía siguen GRD.</li>
	<li>Transferencia de los DRGs a un tubo Eppendorf utilizando una pipeta azul (1000 μL) con un final de corte de 1,5 mL. Retire el DMEM después de una vuelta rápida por varios segundos utilizando una mini centrífuga. Añadir 1 mL de DMEM que contenía 125 colagenasa de XI de tipo U/mL e incubar el tubo durante 90 minutos con una rotación suave (35-40 rpm) usando un agitador de twister en una incubadora de 37 ° C. Inmovilizar el tubo en el piso de coctelera con la cinta.</li>
	<li>Descarte que contienen colagenasa DMEM y añadir 1 mL de DMEM fresco. Espere hasta que el GRD flotante hundirse completamente en la parte inferior y retire el DMEM con los restos de tejido. Repita este paso de lavado por lo menos seis veces. Nota: No trate de descartar completamente el sobrenadante. Tenga cuidado de no eliminar cualquier DRGs con DMEM sobrenadante.</li>
	<li>Transferencia de los DRGs a un tubo cónico de 15 mL, utilizando una pipeta azul (1000 μL) con un final de corte. Luego pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente por lo menos 15 veces con una punta azul (1000 μL) para hacer una suspensión homogénea. Evitar hacer burbujas y tratar de no tocar el fondo de tubo cónico con una punta de pipeta.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 239 x g durante 3 min y cuidadosamente descarte el sobrenadante con flotante de residuos. Añadir 1 mL de Neurobasal suplementado con B27 (2.0% v/v) y resuspender el precipitado de células mediante pipeteo suavemente arriba y abajo de 5 a 10 veces.</li>
	<li>Pasar la suspensión celular a través de un tamiz de celular 70 μm overlaid encima de un tubo cónico de 50 mL. Espere 2 minutos y luego vierta medio Neurobasal/B-27 en el filtro con un aspirador.</li>
	<li>Todos recogidas neuronas DRG (un total de aproximadamente 2 x 106 DRG las neuronas de un ratón) en dos pozos de la placa de 6 pozos de la placa. Las neuronas DRG de un ratón adulto cubren dos pocillos de una placa de 6 pozos. Luego coloque la placa en un incubador de CO2 a 37 ° C hasta que el macrófago Co culturas.</li>
</ol>2. la cultura de los macrófagos peritoneales rimary P en A cultura de célula introducir
Nota: Establecer las culturas Co 4 h después de la chapa inicial de las neuronas DRG disociadas
<ol><li>Macrófagos peritoneales primarios son preparados de ratones machos adultos C57BL6 entre 8 semanas a 12 semanas de edad. Eutanasia a un animal en una cámara de CO2 . Haga una incisión en la piel abdominal con delicadeza, exponer el peritoneo y evitar cortar el peritoneo para evitar una fuga del líquido de lavado.</li>
	<li>Punción del peritoneo utilizando una jeringa con una aguja de 22G e inyectar 10 mL de helado salin con tampón fosfato (PBS) en la cavidad peritoneal. Masajee suavemente el peritoneo durante 1-2 minutos. Entonces, saque la aguja y exprimir el PBS a través del sitio de punción de aguja y recoja el líquido de lavado en un tubo cónico de 50 mL. Nota: Antes de usarlo, ponga la jeringa en el hielo para mantener la frialdad de la PBS.</li>
	<li>Centrifugar el líquido del lavado a 239 x g por 10 min a 4 ° C para que sedimenten los componentes celulares. Resuspender el precipitado con 3 mL del tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) por 3 min a temperatura ambiente. Luego Centrifugue la suspensión de células en 239 x g por 10 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado con 3 mL de PBS y Centrifugue la suspensión de células otra vez para eliminar cualquier resto tampón de lisis RBC. Nota: Asegúrese de que el tampón de lisis RBC se quita totalmente. De lo contrario tampón de lisis RBC restante puede ser tóxica para los macrófagos cultivados.</li>
	<li>Resuspender las células concentradas en 1 mL de medio de Neurobasal/B-27. La mitad de todos los macrófagos recogidos (un total de 3 × 106 a 6 x 106 células) en un cultivo celular insertar con el área efectiva de 4,2 cm2, que se coloca en la parte superior del pozo de la placa disociado DRG. Nota: Durante el período de la cultura, los macrófagos se cultivan en medio de cultivo de neuronas de Neurobasal/B-27. Adecuada sobrevivencia de macrófagos bajo esta condición fue confirmada.</li>
</ol>3. tratamiento del campo de la Db y colección de macrófagos CM
Nota: Iniciar el tratamiento de la db-campo 4 h después de los co-cultivos de neurona-macrófago.
<ol><li>Añadir 2 μl de solución de db-campo de 100 μm a los co-cultivos de neurona-macrófago. Añadir el mismo volumen de PBS para un experimento de control.</li>
	<li>Después de 24 h, llenar un pozo vacío con 1 mL de medio de cultivo de macrófagos en la misma placa de 6 pozos. Transferencia del célula cultura inserto en las culturas de la neurona y macrófagos al pozo vacío con medio de cultivo de macrófagos. Mantener las células en la misma condición durante 72 h sin cambiar el medio. Nota: Agregamos sólo 1 mL de medio de cultivo de macrófagos durante colección de CM para hacer concentrado CM. Durante la colección de CM, si es necesario, agregamos más para cubrir completamente los macrófagos dentro de la inserción.</li>
	<li>Después de 72 h, centrifugar el macrófago CM a 239 x g durante 5 min eliminar los componentes celulares. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0.2 μm para eliminar los residuos celulares restantes. Almacenar el CM recogida a-70 ° C hasta su uso.</li>
</ol>4. Neurite consecuencia ensayo recogido cm
<ol><li>Antes de configurar una cultura de neuronas DRG adultos separada, la capa de una diapositiva 8-pozo cámara siguiendo el mismo procedimiento descrito en 1.1 y 1.2.</li>
	<li>Obtener disociado adulto neuronas DRG Neurobasal suplementado con B27 utilizando los mismos métodos descritos de 1,3 a 1.10. Placa de 5 x 104 células por pocillo en la diapositiva de cámara 8-bien prelacado.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos de la cámara en una incubadora de 37 ° C por 2 h, permitiendo que las células en las partes inferiores. Luego, sustituir el medio de cultivo con el CM descongelada que es precalentado a 37 ° C. Nota: Tenga cuidado de no tocar la parte inferior de la diapositiva 8-pozo cámara al retirar el medio de cultivo y agregar los centímetros recogidos.</li>
	<li>15 h después de la primera chapa, quitarlo del medio y lavar las células con PBS una vez. A continuación, añadir 200 μL de solución de paraformaldehído al 4% helada a los pozos e incubar las células con la solución de paraformaldehído por 20 min a 4 ° C Nota: La cultura de neuronas DRG para ensayo de neurite consecuencia debería restringirse precisamente a 15 h. Bajo esta condición, no hay ninguna consecuencia apreciable de la neurita.</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS helado y luego realizar el bloqueo con 10% suero normal de cabra (NGS) con 0,1% Triton-X 30 min incubar las células fijas con solución de anticuerpo primario (anti-Tuj-1) diluida con 10% NGS (en una concentración de 1 μg/mL) durante 4 h en la sala de temperatura o durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS y luego incubar las células con solución de anticuerpo secundario (cabra anti ratón) por 2 h a temperatura ambiente. Luego, Lave dos veces con PBS y Monte la corredera de la cultura con un cubreobjetos (24 × 50 m m) con solución de montaje.</li>
	<li>Tomar imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia para visualizar la consecuencia del neurite.</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
<li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury%3A+an+increasingly+philosophical+debate%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li>
<li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li>
<li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li>
<li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li>
<li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li>
<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios pasos fundamentales para la generación de este sistema de co-cultivo. Es importante asegurarse de que las neuronas de ratón DRG y macrófagos peritoneales están preparados frescos y saludables. Hemos experimentado disminución neurite consecuencia actividad del CM cuando la disección de los DRGs tomó más de 30 minutos. Además, la contaminación de los componentes de la sangre en los macrófagos peritoneales también condujo a una disminución de la actividad de consecuencia del neurite en el CM. Con el fin de genera...

Una variedad de estudios han intentado mejorar la regeneración del axon de CNS después de las lesiones de la médula espinal o el cerebro. Las reacciones inflamatorias, que inevitablemente acompaña a las lesiones en el sistema nervioso, tradicionalmente se cree que participan en procesos patológicos secundarios conduce a resultados deletéreos de1,2. De hecho, metilprednisolona que puede suprimir las reacciones inflamatorias es la única terapia aprobada para lesiones de médula espinal aguda3. Sin embargo, estudios más recientes han proporcionado evidencia que los macrófagos, un tipo de célula inflamatoria representante, pueden participar en la regeneración o la reparación del sistema nervioso lesionado4,5,6. Por ejemplo, infiltrarse en los macrófagos tras un lente lesiones producen pro renovables las moléculas para promover la regeneración de las neuronas ganglionares de la retina7,8. Además, trasplantado las neuronas DRG aumentaron en el crecimiento del axón hasta la región donde fueron activados los macrófagos por el zymosan9. Por otra parte, los macrófagos en el sitio de la lesión pueden crear un entorno permisivo crecimiento de nervios periféricos lesionados10.
Nuestro trabajo también proporcionó evidencia fuerte que los macrófagos pueden contribuir a la capacidad de regeneración de axones en las neuronas adyacentes. Hemos demostrado que la activación de los macrófagos en los ganglios de raíz dorsal (GRD) es esenciales para mejorar la capacidad regenerativa de DRG neuronas sensoriales siguiendo un preacondicionamiento periférica del nervio lesión11. Una investigación similar fue reportada independientemente de otro laboratorio12. También demostramos que intraganglionic inyección de cyclophosphate amperio cíclico (campo de db), que es una molécula conocida para mejorar la capacidad de regeneración del axón13, inducida por la activación de los macrófagos. La desactivación de los macrófagos suprimió los efectos de la db-campo de actividad de consecuencia del neurite. Obras posteriores identificaron expresión inducida por la lesión de CCL2 en las neuronas como una señal para estimular macrófagos con un fenotipo pro-regenerativa14,15.
Basado en los resultados experimentales anteriores, hemos establecido un modelo en vitro que se asemeja a los eventos moleculares que ocurren en los DRGs siguiendo un preacondicionamiento lesiones modelo11,14. En este modelo, db-campo se aplica a las neurona-macrófago co-cultivos obtención de señalización que conduce a la activación de macrófagos con un fenotipo pro-regenerativa intercelular. Aquí, describimos protocolos detallados que podemos generar los macrófagos que secretan factores moleculares que promueven neurite consecuencia (figura 1). Este modelo experimental ilustra un concepto que los macrófagos pueden ser estimulados o inducidos para apoyar la regeneración del axón siguiendo las lesiones al sistema nervioso. Nuestro modelo también será útil en el estudio de mecanismos de señalización intercelular que conduce a la activación de los macrófagos pro-regenerativa.

<table><tbody><tr><td>Inserto de cultivo celular membrana PET transparente 0.4&mu; m tamaño de poro</td><td>Corning,Falcon</td><td>353090</td><td>Membrana PET transparente con 0.4-&mu; m tamaño de poro, para placa de 6 pocillos</td></tr><tr><td>70-&mu; m colador de células de nylon</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de cultivo de 8 pocillos</td><td>Biocoat</td><td>354632</td><td>con una aplicación uniforme de Poly-D-Lisina</td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>21103-049</td><td>Contiene un 1% de glutamax y un 1% de penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>B-27 suplemento, sin suero</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>solución extracelular</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lisina Hidrobromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 3', 5'-monofosfato cíclico, N6,O2'-dibutiril-, sal de sodio</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10% Suero de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Chemical and Metal Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>Anti y beta; III tubulina (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>Anticuerpo monoclonal</td></tr> de <tr><td>ratón Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón</td><td>de cabra Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Marienfeld-Superior N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular CO2 incubadora</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td> <td>de disecciónCarl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td> giratorio <td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Sorvall</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Suero fetal bovino)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>16021-14</td><td>Acero inoxidable, 14 cm, curvado, acción de una sola junta</td></tr><tr><td>Tijeras finas - Carburo de tungsteno & ToughCut</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>14558-11</td><td>afilado, dentado</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #7 FST</td><td>(Fine Science Tools)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0,07 x 0,04 mm, curvo</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>15000-00</td><td>recta, 3 mm de filo, afilada</td></tr><tr><td>Microcentrífuga Qualitron DW-41</td><td>Grupo de Tecnología Artesanal</td><td>DW-41</td><td>Voltaje de entrada: 115VAC</td></tr></tbody></table>

co-cultivos de neurona y macrófagos para activar macrófagos secretando factores moleculares con actividad neurite consecuencia

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

Hay fuerte evidencia que los macrófagos pueden participar en la regeneración o la reparación del sistema nervioso lesionado. Aquí, describimos un protocolo en el que los macrófagos son inducidos a producir acondicionado medio (CM) que promueve la consecuencia del neurite. Las neuronas del ganglio (DRG) de adultos raíz dorsal agudo disociadas y plateadas. Después de que las neuronas se unen estable, macrófagos peritoneales son cultivados conjuntamente en una inserción de cultura celular superpuesta en el mismo bien. Cyclophosphate que amperio cíclico (campo de la db) se aplica a las culturas Co durante 24 h, después de que el cultivo celular insertar que contiene los macrófagos se traslada a otro pozo para recoger CM 72 h. La CM de los co-cultivos tratados con db-campamento, cuando se aplica a una cultura de neurona adulta independiente DRG, muestra robusta neurite consecuencia actividad. Los CM Obtenido de los cultivos tratados con db y campamento que consta de un solo tipo de células sólo, neurona DRG o macrófago peritoneal, no mostró actividad de consecuencia del neurite. Esto indica que la interacción entre las neuronas y los macrófagos es indispensable para la activación de los macrófagos que secretaban factores moleculares con actividad de consecuencia del neurite en CM. Así, nuestro paradigma de la cultura también será útil para el estudio de señalización intercelular en la interacción macrófago-neurona para estimular a los macrófagos a ser dotado de un fenotipo pro-regenerativa.

Se describe un protocolo que puede generar macrófagos capaces de secretar factores moleculares con actividad de consecuencia del neurite. El macrófago CM obtenida de los co-cultivos tratados con db-campo dio lugar a la consecuencia del neurite robusto cuando se aplica a una cultura separada de neurona DRG (figura 2A). En comparación, CM de co-cultivos tratados con PBS no indujo la consecuencia del neurite en nuestra duración 15h cultura (...

El protocolo actual presenta procedimientos experimentales para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidad para liberar factores moleculares que promueven la consecuencia del neurite. Tratamiento de entrenamiento de los co-cultivos de neurona-macrófago induce a los macrófagos para producir medio condicionado que posee fuerte neurite consecuencia actividad.

Co-cultivos de neurona y macrófagos para activar macrófagos secretando factores moleculares con actividad Neurite consecuencia

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

El objetivo general de este procedimiento es generar macrófagos que puedan secretar factores moleculares que promuevan el crecimiento de neuritas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo las neuronas y los macrófagos interactúan entre sí para activar el fenotipo macrofágico pro-regenerativo para promover una excelente regeneración. La principal ventaja de esta técnica es que utilizamos AMP cíclico, una molécula sérica de adenosina, que es una enzima mucho más fisiológica que se utilizó en estudios previos para estimular macrófagos con el fenotipo pro-regenerativo.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que la activación de los macrófagos es esencial en la mejora de la capacidad de crecimiento de los axiones y que pueden producir excelentes neuronas siguiendo las precauciones en caso de lesión permanente del lóbulo. Antes de configurar el cultivo, precodifique una placa de seis pocillos con licina poli-D y laminina. A continuación, incube la placa de seis pocillos con licina 0,01 poly-D a 37 grados centígrados durante dos horas o a cuatro grados centígrados durante la noche.Después de eso, lave el plato dos veces con agua destilada. A continuación, incubar la placa con solución de laminina a una concentración de tres microgramos por mililitro durante dos horas a temperatura ambiente. Después de esto, lave la placa dos veces con agua destilada y seque la placa a temperatura ambiente durante al menos una hora.Ahora, haga una incisión en la piel que recubre la columna vertebral de un ratón sacrificado con una cuchilla quirúrgica y diseccione el par de músculos vertebrales bilateralmente para exponer los huesos vertebrales. Extirpe los huesos vertebrales meticulosamente con un rongeur quirúrgico de punta estrecha hasta que los DRG estén completamente expuestos. Bajo un microscopio de disección, extraiga el DRG bilateralmente desde S1 hasta el nivel C1 con tijeras de iridectomía y pinzas de punta fina.Transfiera el DRG a un tubo eppendorf de 1,5 mililitros con una punta de pipeta azul con un extremo cortado. A continuación, retire el DMEM después de un centrifugado rápido durante varios segundos con una minicentrífuga. Añadir un mililitro de DMEM que contenga 125 unidades por mililitro de colágeno tipo 11 e incubar el tubo durante 90 minutos con una rotación suave utilizando un agitador twister a 37 grados centígrados.Después, desecha la colagenasa que contiene DMEM y añade un mililitro de DMEM fresco. Transfiera el DRG a un tubo cónico de 15 mililitros con una punta de pipeta azul con un extremo cortado. A continuación, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 15 veces para crear una suspensión celular homogénea.Centrifugar el tubo a 239 g durante tres minutos y desechar con cuidado el sobrenadante con los residuos flotantes. Agregue un mililitro de medio de neuroalbahaca suplementado con B27 y vuelva a suspender el pellet de celda pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo de cinco a diez veces. A continuación, pase la suspensión de celdas a través de un filtro de celdas de 70 micrómetros superpuesto sobre un tubo cónico de 50 mililitros.A continuación, coloque todas las neuronas DRG recogidas en dos pocillos de la placa de seis pocillos. Para preparar macrófagos peritoneales primarios de un ratón adulto, haga una incisión delicada en la piel abdominal para exponer el peritoneo y evite cortar el peritoneo para evitar una fuga de líquido de lavado. A continuación, punción del peritoneo con una jeringa con aguja de calibre 22 e inyecte 10 mililitros de PBS helado en la cavidad peritoneal.Masajee suavemente el peritoneo durante uno o dos minutos. A continuación, saque la aguja y exprima el PBS a través del sitio de punción de la aguja y recoja el líquido de lavado en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, centrifugar el líquido de lavado a 239 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular los componentes celulares.A continuación, vuelva a suspender el pellet con tres mililitros del tampón de lisis de glóbulos rojos durante tres minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a centrifugar la suspensión celular a 239 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender las células peletizadas en un mililitro de medio neurobasil B27.Coloque la mitad de todos los macrófagos recolectados en un inserto de cultivo celular con un área efectiva de 4,2 centímetros cuadrados, que se coloca encima del pocillo de DRG disociado. Cuatro horas después de que el macrófago neurona haya sido cocultivado, agregue dos microlitros de solución de amplificador cíclico DB de 100 micromolares a los cocultivos de macrófagos neuronales. Después de 24 horas, llene un pocillo vacío con un mililitro de medio de cultivo de macrófagos en la misma placa de seis pocillos.Transfiera el inserto de cultivo celular en el cocultivo de macrófagos neuronales al pocillo vacío con medio de cultivo de macrófagos. Después de 72 horas, centrifugar el medio acondicionado con macrófagos a 239 veces g durante cinco minutos para eliminar los componentes celulares. Pase el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier resto de residuos celulares.En este procedimiento, precubra un portaobjetos de cámara de ocho pocillos con licina poli-D y laminina. A continuación, se obtienen las neuronas DRG adultas disociadas y el medio neuroalbahaca, suplementado con B27 utilizando los mismos métodos descritos anteriormente. Coloque la placa cinco veces 10 a las cuatro celdas por pocillo en un portaobjetos de ocho pocillos prerrevestido.A continuación, coloque el portaobjetos de la cámara en una incubadora a 37 grados centígrados durante dos horas, permitiendo que las células se adhieran al fondo. A continuación, sustituya el medio de cultivo por el medio descongelado y acondicionado que se precalienta a 37 grados centígrados. 15 horas después de la siembra inicial, retire el medio y lave las células con PBS una vez, luego agregue 200 microlitros de solución de paraformaldehído al 4% helada a los pocillos e incube las células con la solución de paraformaldehído durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Posteriormente, incubar las células fijas con una solución de anticuerpos primarios diluida con suero de cabra normal al 10% durante cuatro horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Después, tome imágenes con un microscopio de fluorescencia para visualizar el crecimiento de las neuritas. El medio condicionado por macrófagos obtenido de los cocultivos tratados con DB AMP cíclico dio lugar a un crecimiento robusto de neuritas cuando se aplicó a un cultivo de neuronas DRG separado.En comparación, el medio condicionado obtenido de los cocultivos tratados con PBS no indujo el crecimiento de neuritas. Cuando el AMP cíclico DB se trata en el cultivo con macrófagos solos, el medio condicionado no fue eficaz para apoyar el crecimiento de neuritas. Esto sugiere que la interacción de las neuronas macrófagos es indispensable para estimular a los macrófagos y dotarlos de una capacidad pro-regenerativa.También probamos el medio condicionado obtenido a partir del cultivo de solo neuronas tratadas con AMP cíclico DB y no encontramos crecimiento de neuritas. Es importante recordar que las neuronas y las microplacas deben prepararse frescas y saludables. Experimentamos una disminución de la actividad de excrecimiento de neuritas del medio constante cuando la disección duró demasiado tiempo o los macrófagos del peritoneo estaban contaminados con componentes sanguíneos.En este protocolo, las neuronas DRG disociadas se separaron fiscalmente de los macrófagos en el inserto de cultivo celular. Por lo tanto, nuestro sistema de cocultivo permitirá la identificación de factores celulares responsables de la señalización intercelular que median la activación de macrófagos totalmente regenerativos.

neuron-macrophage-co-cultures-to-activate-macrophages-secreting

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Hemos desarrollado una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma de microsistemas para la investigación in vitro de interacción axón-glia del SNC. La plataforma es capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo y se fabrica utilizando un nuevo desarrollo de macro / micro método de fabricación de híbridos.

Un compartimiento de Multi-CNS neuronas-glia Co-cultivo de microfluidos Plataforma

Este estudio describe los procedimientos de instalación de un axón neuronal y la novela (astro) glia plataforma de co-cultivo. En este sistema de co-cultivo, la manipulación de la interacción directa entre un solo axón (y células gliales único) se hace factible, permitiendo un análisis mecanicista de la neurona mutuo de señalización gliales.

Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

Este video muestra el co-cultivo de neuronas ganglionares de raíz dorsal murina y macrófagos. Las neuronas se siembran en una placa recubierta, mientras que los macrófagos se recogen de un ratón sacrificado, se tratan y se añaden al inserto de cultivo. El tratamiento con db-cAMP activa las neuronas y hace que los macrófagos adopten un fenotipo pro-regenerativo para apoyar el crecimiento neuronal.

Desarrollo de un cocultivo de neuronas y macrófagos in vitro

Este video muestra un ensayo para promover el crecimiento de proyecciones neuronales conocido como crecimiento de neuritas utilizando el medio condicionado por macrófagos. Co-cultivo de neuronas y macrófagos con cAMP y recolección del medio condicionado derivado de macrófagos. El crecimiento de las neuronas con el medio condicionado promueve el crecimiento de neuritas. Estas excrecencias se marcan con fluorescencia y se visualizan utilizando un microscopio de fluorescencia.

Uso de un medio condicionado por macrófagos para promover las extensiones neuronales

Este video demuestra el establecimiento de un cocultivo de neuronas inducidas humanas (iNs) y células precursoras de oligodendrocitos inducidos (iOPCs). Las iNs se mezclan con iOPCs en un co-cultivo y luego se incuban para apoyar la maduración de ambas iNs en neuronas y de iOPCs en oligodendrocitos. Las neuronas forman conexiones sinápticas con otras neuronas y oligodendrocitos, mientras que los oligodendrocitos desarrollan vainas de mielina alrededor de los axones de las neuronas.

Un método de cocultivo para modelar las interacciones neurona-oligodendrocito

En organismos multicelulares, los factores solubles secretados provocan respuestas de diferentes tipos de células como resultado de la señalización paracrina. Los sistemas de cocultivo de insertos ofrecen una forma sencilla de evaluar los cambios mediados por los factores solubles secretados en ausencia de contacto célula-célula.

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

Este protocolo describe el co-cultivo de neuronas-astrocito indirecta para el análisis de las interacciones neurona compartimentada-glia.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Aquí, presentamos un método utilizando soportes de membrana permeables para facilitar el estudio de la señalización paracrina sin contacto utilizada por las células tumorales para suprimir la respuesta inmune. El sistema es susceptible de estudiar el papel de los factores secretos por tumores en la desactivación de los macrófagos de amortiguación.

Estudio de los efectos de los ligandos paracrinos secretos de tumor en la activación de macrófagos utilizando co-cultivo con soportes de membrana permeable

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

Este protocolo describe un cocultivo microglía-neuronal establecido a partir de células neuronales primarias aisladas de embriones de ratón en los días embrionarios 15-16 y microglía primaria generada a partir de los cerebros de ratones neonatos en los días postnatales 1-2.

Generación y cocultivo de microglía primaria murina y neuronas corticales

Aprende a activar macrófagos mediante co-cultivos con neuronas DRG usando cAMP para inducir factores que promueven el crecimiento de neuritas. Este método revela interacciones celulares clave para la regeneración nerviosa.

Co-cultivos de neurona y macrófagos para activar macrófagos secretando factores moleculares con actividad Neurite consecuencia

Explorar más videos