Alta resolución volumen imágenes de neuronas por la exclusión de uso de fluorescencia método y dispositivos microfluídicos dedicada

El objetivo general de este procedimiento es permitir la medición de campo completo del volumen neuronal in vitro con la resolución axial submicrométrica necesaria para el análisis de neuritas en estructuras dinámicas implicadas en el crecimiento neuronal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia celular con respecto a la dinámica de los cambios de volumen a escala subsidiada durante la degeneración no creciente o axónica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una resolución axial submicrométrica combinada con una observación de ajuste completo y una escala de tiempo a horas o días.

Para comenzar el procedimiento, desmolde el bloque de PDMS bajo una cubierta química vertiendo isopropanol sobre él. A continuación, colócalo en el banco de acero inoxidable de la campana. Corta alrededor de la oblea de silicona y desmolda la réplica de PDMS.

Luego, corta alrededor de la astilla y deja un margen de dos milímetros con un bisturí o una cuchilla de afeitar. Perfore la entrada presionando firmemente el perforador de 1,5 milímetros de diámetro y actívelo para cortar y tallar el orificio de la entrada. Haga lo mismo en las cuatro zonas dedicadas del chip donde se inyectará el líquido.

Después, limpie el chip pegando y despegando la cinta adhesiva en el lado microestructurado. Espolvorea isopropanol por ambos lados. A continuación, seque la viruta con nitrógeno presurizado utilizando una pistola de aire.

En este procedimiento, coloque cada cubreobjetos en un spin-coater ubicado en un entorno de sala limpia. Aplique una gota de fotorresistencia positiva para cubrir aproximadamente el 75% del cubreobjetos y centrifugar a 4000 rpm durante 30 segundos para alcanzar un espesor final de 0,45 micrómetros. Coloque los cubreobjetos en una placa calefactora con una temperatura superficial de 115 grados centígrados durante un minuto.

Usando un alineador de mascarillas, exponga cada cubreobjetos a una longitud de onda de 435 nanómetros a través de la mascarilla dedicada de acuerdo con los parámetros del fabricante. A continuación, prepare dos platos de cristalización de vidrio, uno que contenga el revelador sin diluir y el otro que contenga agua desionizada. Sumerja los cubreobjetos uno a uno en el revelador durante un minuto mientras revuelve continua y suavemente el plato de cristalización.

Luego, sumerja la oblea en agua desionizada durante unos cinco segundos. Transfiera la oblea a un papel absorbente y séquela con nitrógeno presurizado usando una pistola de aire comprimido. Coloque el chip PDMS y el plato de vidrio en el que se unirá a la cámara de plasma para la activación de la superficie.

A continuación, deposite una gota de agua en un portaobjetos de cristal de microscopio grueso rectangular y pegue el cubreobjetos en el portaobjetos de cristal por capilaridad. Bajo un microscopio, marque la ubicación de las rayas fotorresistentes en la parte posterior del portaobjetos de vidrio. Coloque el cubreobjetos de vidrio estampado en el soporte de la mascarilla del alineador de mascarillas.

Confíe en la marca hecha para centrar los objetos de referencia fotorresistentes. Para aumentar el contraste óptico, coloque una oblea de silicio debajo del chip PDMS. La oblea de silicona debe permanecer firmemente adherida al mandril durante el proceso de alineación.

A continuación, coloque el chip PDMS en el soporte de sustrato móvil del alineador de mascarillas. Posteriormente, levante el mandril lo suficiente como para visualizar tanto el chip como el conjunto de franjas fotorresistentes ubicadas en el cubreobjetos mientras permanece detrás del contacto mecánico. Realice la alineación y logre el contacto mecánico entre el chip y el cubreobjetos levantando el mandril hasta que la superficie de los pilares del PDMS toque el cubreobjetos de vidrio.

Después de eso, baje el mandril. Retire el cubreobjetos adherido al chip del soporte de la mascarilla. Luego, coloque el dispositivo en una placa de Petri de 35 milímetros y transfiera todo al horno durante cinco a diez minutos para aumentar la fuerza de unión.

Treinta minutos después de la unión, coloque una punta de pipeta de diez microlitros llena de solución de PLO en la entrada. Luego, cargue el líquido hasta formar una gota encima. Repita la misma operación en la salida y los depósitos.

Posteriormente, agregue PBS en la placa de Petri alrededor del chip. Selle la placa de Petri con una película de parafina e incube a temperatura ambiente con un mínimo de cinco horas. Luego, presione ligeramente un cono de punta de diez microlitros en cada orificio de inyección y aspire el exceso de líquido.

A continuación, reemplace el PLO y el PBS que rodea el chip por el medio de cultivo. Después, coloque el chip en la incubadora regulada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que las neuronas se siembren con un mínimo de cinco horas de tiempo de incubación. En este procedimiento, extraiga el medio de cultivo a partir de la viruta.

Recoja dos o tres microlitros de la solución celular recién resuspendida e inyéctela en la entrada. Repita inmediatamente la misma operación en la salida. Inyecte aproximadamente el mismo volumen de medio de cultivo en cada depósito.

Observe rápidamente el chip bajo el microscopio para comprobar la densidad de las células. El orden de magnitud de la densidad óptima de celdas corresponde a unas cinco a diez celdas dentro de la superficie cuadrada delimitada por cuatro pilares. Repita el procedimiento de inyección de 0,5 a 1 microlitro de suspensión celular para alcanzar la densidad celular objetivo.

Para la obtención de imágenes, sustituya el medio de cultivo por el medio de obtención de imágenes. Luego, coloque el chip bajo un microscopio de epifluorescencia. Adquiera imágenes de células de una a varias imágenes sucesivas en el caso de experimentos de lapso de tiempo.

Aquí se muestran las observaciones representativas de una banda fotorresistente de calibración y neuronas. Las imágenes de mayor aumento y las secciones transversales de estos objetos se muestran a la derecha. Aquí se muestran las neuritas representativas y una cámara central de tres micrómetros de altura.

El volumen de la rodaja de neurita se puede calcular en función del ancho de la neurita. Y aquí están los conos de crecimiento representativos y una cámara central de tres micrómetros de altura. Sus subestructuras emergen claramente de un ruido óptico de fondo de unos 20 nanómetros.

Observaciones de lapso de tiempo de neuronas de acto de vida sembradas en una cámara de 12 micrómetros de altura para seguir el ciclo de contracción y reactivación del cono de crecimiento dentro de una escala de tiempo de unas pocas decenas de minutos. Al intentar este procedimiento, es importante tener acceso a un equipo de grabado iónico profundo para fabricar el lodo de silicona. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo alinear un cubreobjetos de vidrio estructurado con un chip PDMS.

Una vez dominada, esta técnica puede aplicarse de forma reproducible a la cuantificación de la neurología en 3D. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la farmacología exploraran el efecto de varios medicamentos con calibre real, todos en forma de cono cerrado. No hay que olvidar que trabajar con neuronas primarias requiere muchos cuidados para evitar contaminaciones y roturas.

Sea siempre amable y rápido al cambiar de medio para limitar el tiempo que pasan fuera de la incubadora.