Name: Alta resolución volumen imágenes de neuronas por la exclusión de uso de fluorescencia método y dispositivos microfluídicos dedicada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a medir volúmenes neuronales in vitro con resolución submicrométrica mediante exclusión de fluorescencia y microfluidos PDMS. Este método permite analizar dinámicas de neuritas y conos de crecimiento en tiempo real.

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Los autores quieren reconocer ChiLab, materiales y laboratorio de microsistemas - Politecnico di Torino - DISAT, en la persona del Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza y Dr. S L Marasso, por su precioso apoyo en el proceso de desarrollo y fabricación del dispositivo. Agradecemos a Víctor Racine de Quantacell para la discusión y apoyo en el tratamiento de la imagen. Agradecemos a Isabelle Grandjean y Manon Chartier de la facilidad Animal del Instituto Curie por su apoyo para los ratones y Pablo Vargas y Ana María Lennon (Instituto Curie) por facilitarnos los ratones LifeAct de GFP. Agradecemos a Olivier Thouvenin del Institut Langevin y Clotilde Cadart, Larisa Venkova y Matthieu Piel de Instituto Curie - 144 UMR, por su ayuda en la comprensión de la exclusión de fluorescencia método. Por último, agradecer a la plataforma tecnológica de Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) por su apoyo en microfabricación. Este trabajo fue apoyado en parte por el Europeo investigación Consejo Advanced Grant no. 321107 "CellO", Université de PSL (proyecto SwithNeuroTrails), ANR Investissement Avenir y la empresa Labex IPGG y Equipex.

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</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Proyección de imagen de volumen de neuronas constituye un reto para la técnica de grandes debido a las extensiones de estas células largas y delgadas. Este protocolo describe las variantes del mismo tipo de dispositivo de microfluidos dedicada a la proyección de imagen de la neurona.
Al lado de los aspectos de diseño microfluídico, la elección del objetivo es fundamental para la proyección de imagen de exclusión de la fluorescencia e implica un compromiso entre la resolución lateral y la claridad de la imagen. Se ha demostrado en el 13 que un NA alta conducen a una profundidad de foco más pequeño que la altura de cámara no era perjudicial para la precisión de la medición de volumen si se realizó la proyección de imagen en foco y si se deja un margen suficiente entre el contorno del objeto del os intereses y los límites de la superficie de integración. Sin embargo, el uso de una cámara muy superior a la profundidad del foco impide la claridad de la imagen debido a la difusión del fotón, que suaviza los bordes de los objetos de interés. La fabricación de una cámara alta de 3 μm redujo este desenfoque lateral y proporciona imágenes excepcionalmente definidas exclusión fluorescente con NA alto (0,8) 40 X objetivos visualizar ramas neuronales con alta resolución lateral.
Chip de montaje es un paso crítico, en particular en el caso de alta cámaras de 3 μm, pero manipulación cuidadosa tal como se describe en el punto 4.1.2 evita el colapso del techo. La superficie alta al cociente del volumen asociado a estas cámaras delgadas también planteó la cuestión de la estabilidad de la concentración de dextranos en el tiempo. Hemos comprobado que la absorción superficial del dextrán después de una noche de incubación era insignificante: después de reemplazar el dextrano por PBS, la diferencia de intensidad entre el pilar y el fondo era de 1 por 1000 del contraste de intensidad inicial entre estas dos regiones en presencia de dextrano. Nota que las neuronas pueden adherirse sobre el cubreobjetos de la parte inferior y en el techo PDMS. Este efecto desaparece cuando usando modelado cubreobjetos (es decir, cuando no incubar adhesivo moléculas dentro de la cámara PDMS), como la capa es por lo tanto estrictamente localizada en la parte inferior de la cámara.
Aparte de su morfología desafiante, las neuronas son más bien adecuadas para grandes debido a que uno de la gran limitación del método, es decir, endocitosis de dextrano, es muy limitado en estas células. Elegimos un 10 kDa formulación para suprimir a largo rango (horas) cualquier fenómeno de endocitosis visible.
En conclusión, la simplicidad conceptual de FXm es balanceada por un conjunto de temas experimentales que han sido resueltos por el presente Protocolo, tales como rugosidad nanométrica de PDMS y altura de cámara micrométrico o corrección de fondo para corregir las irregularidades de el techo de PDMS entre pilares. Sin embargo, el uso de una cámara estrecha microfluídicos para limitar el medio fluorescente produce algunas limitaciones como la necesidad de pilares de apoyo, que reduce la superficie efectiva disponible para la adhesión celular, o la necesidad de excluir el soma de la central cámara para observar extensiones neuronales con la mayor claridad, que limita las regiones de la célula accesible a la observación de alta resolución. Una posible evolución de este método sería deshacerse de este confinamiento físico, para ser reemplazado por una óptica. El nuevo desarrollo de la microscopía de luz de hoja puede combinarse ventajosamente con grandes en el futuro.

El conocimiento preciso del volumen celular ha atraído mayor atención en los últimos años, impulsado por el tema de la homeostasis del tamaño celular en solos-celled microorganismos 1 y en general en las células mitotic 2. Sin embargo, es pertinente también para las células post mitóticas, para que las neuronas constituyen un ejemplo paradigmático la cuestión del volumen de la célula.
Volumen es una importante firma de eventos fisiológicos y patológicos en diferentes escalas y puntos de tiempo en la vida neuronal, de la deformación axonal transitoria asociada a actividad eléctrica (escala de milisegundos) 3 a la irreversible neuronal de la hinchazón que ocurre durante la fase asintomática de neurodegenerativas enfermedades (años en los seres humanos) 4. Sin embargo, el mayor cambio de volumen se produce en una escala de tiempo intermedio de días o semanas (dependiendo el organismo considerado) durante el crecimiento neuronal. La prolongada y compleja morfología de neuronas plantea cuestiones múltiples, entre los que la regulación del tamaño celular. Diámetro y longitud axonal son de hecho fuertemente regulado en vivo, con valores específicos para cada tipo neuronal 5,6.
Estos temas, complejos de abordar en vivo, también pueden abordarse de manera simplificada in vitro. En ese objetivo, un método dedicado a la medición de volumen rápido lo suficiente como para seguir la dinámica de crecimiento (es decir, en una escala de tiempo de minutos) y compatible con la observación durante horas o días se requiere. Varios métodos se han desarrollado sobre los años para proporcionar un acceso directo o indirecto a volumen celular in vitro. Reconstrucción de la célula de proyección de imagen confocal es uno de ellos, pero este método implica el etiquetado y repetidas exposiciones a la luz al tiempo que muestra una limitada resolución axial de aproximadamente 500 nm 7. Tenga en cuenta que estos dos últimos inconvenientes son parcialmente inundados por un método más sofisticado y reciente llamado enrejado de la microscopia de luz-hoja 8. Microscopía de fuerza atómica ha utilizado 9 pero este método de análisis es por esencia lenta y tediosa. Por otra parte, el contacto físico que requiere la célula podría interferir con la medición teniendo en cuenta la extrema suavidad de neuronas 10. Método indirecto utilizando la impedancia o resonancia han sido empleados para 11tipos de células diferentes, pero son insuficientes para extendido adhesivo células como las neuronas.
Uno de los métodos más prometedores se basa en la medida del volumen excluido de las células en una cámara estrecha llenado de un colorante fluorescente. El método de exclusión de la fluorescencia (FXm) es simple en su principio, ya que no requiere etiquetado y es adecuado para imágenes ópticas rápido, de largo plazo de poblaciones celulares con una resolución axial potencialmente el óptica. Más precisamente, la resolución en z depende de la intensidad de la fluorescencia máxima en el compartimiento de la cultura (es decir, en la región carente de células) dividida por el rango dinámico de la cámara, aunque varias fuentes de ruido de limitan esta última resolución. Este método ha sido muy fuerte el volumen de la migración de células adherentes 12 o para el estudio de cambio de volumen durante la mitosis de células de mamífero, como bien se describe en el 13. Sin embargo, las neuronas constituyen un desafío metodológico para grandes teniendo en cuenta su extensa ramificación en procesos sub-micrométricas.
Aquí presentamos un método que conduce a la fabricación de cámaras grandes lisas para obtener con alta precisión el volumen y la altura de ramas neuronales y estructuras dinámicas en crecimiento neuronal como conos de crecimiento.
Cámaras deben tener alturas similares que el objeto a medir con el fin de optimizar la resolución axial. Por lo tanto, hemos diseñado diferentes dispositivos de FXm caracterizados por cámaras de medición central de tres alturas diferentes. El más delgado (3 μm de altura) se dedica a la medición de neurita: esta altura baja excluye soma, que permanecen en la cámara intermedia alta cerca de 15 μm. Cámaras central más gruesos (10 a 12 μm) son lo suficientemente altas para seguir el crecimiento de células enteras. El dispositivo incluye también dos embalses situados a ambos lados de la cámara central. Cuatro agujeros de inyección (IH) así se implementan y se señalan como sigue: la entrada y salida sirven para introducir las suspensiones celulares en el chip, mientras que los otros dos alimentan a los embalses.
Tenemos primera calibración fabricados cubreobjetos para mediciones de altura con fotoresistencia estructuras de geometría conocida. Entonces hemos reflejado las neuronas cada vez más libres, pero también morfológicamente limitadas neuronas en micropatrones de adhesión.

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Para realizar DRIE</td></tr><tr><td>Alineador de mascarillas MJB4</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 Fotolitografía</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Alineador de mascarillas</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Fotolitografía asociada a DRIE</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo celular</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora 37 &deg; C 5% CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe Incubadora</td><td></td>de CO2</tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Horno entre 65 y 80 &deg; C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfilador mecánico</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>Perfilador óptico</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>Desecador de vacío</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>Diámetro 200 mm</td></tr><tr><td>Sonicador de baño ultrasónico</td><td>Labo Moderne SHE1000</td><td></td><td>Volumen de la bañera: 0,8 litros</td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Stuart SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>Masks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>Datos complementarios</td></tr><tr><td>Su8 Mask 1</td><td></td><td></td><td>Datos complementarios</td></tr><tr><td>Su8 Mask 2</td><td></td><td></td><td>Datos complementarios</td></tr><tr><td>Su8 Mask 3</td><td></td><td></td><td>Datos complementarios</td></tr><tr><td>Calibración S1805 rayas</td><td></td><td></td><td>Datos complementarios</td></tr><tr><td><fuerte>Pequeño equipo de laboratorio</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>perforadora de 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (referencia en EE. UU.)</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí o cuchilla de afeitar</td> Espátula plana de acero inoxidable de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9" con cuchara</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>Para desmoldar PDMS</td></tr><tr><td>Labio superior Manipulación de obleas</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva</td><td>FST</td><td>Dumont #7 Pinzas - Standard / Dumoxel</td><td>Para manipular cubreobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>Sustratos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mm cubreobjetos de vidrio</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td>Fotorresistentes y reveladores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 fotorresistencia positiva</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Antes del proceso DRIE, espesa 1,8 y micro; m</td></tr><tr><td>AZ 351B revelador</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Para desarrollar AZ 1518 fotorresistente positivo</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA revelador</td><td>Technic</td><td></td><td>Para desarrollar SU-8 fotorresistente negativo</td></tr><tr><td>Microposit S1805 resiste</td><td>Chimie Servicios</td><td></td> técnicos <td>Fotorresistencia positiva utilizada para obtener 0.5&micro; m de alto estructuras</td></tr><tr><td>MF 26A revelador</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Para desarrollar un positivo S1805 fotorresistente<</td></tr><tr><td>fuerte>Consumibles de laboratorio</fuerte></td>Pipeta de plástico desechable 3 mL LifeTechnologies - ThermoFisher P100 Placas de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Jeringa de 20 mL Terumo SS+20ES1 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta</td><td></td><td></td><td></td>adhesiva transparente</tr><tr><td>Toallitas cuadradas</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>Película de parafina plástica</td></tr><tr><td><fuerte>Químicos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-metacriloxipropil)triclorosilano</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS y agente de curado Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>poli-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>3-metacriloxipropil-trimetoxisilano</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML</td><td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>ácido</td> <td>acéticoSigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10kW conjugado con Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Absoprtion a 488 nm</td></tr><tr><td>Dextran 10kW conjugado con Alexa647</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Absoprción a 647 nm</td></tr><tr><td>Culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>Suero para caballos</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200</td><td>mM LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio GIBCO 100</td><td>mM LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal sin rojo fenol</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td>Routine en Matlab para la normalización en <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>segundo plano</td><td>Quantacell</td><td>Contacto Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Para seleccionar el ROI específico para análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Rutina</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Datos complementarios</td></tr><tr><td>Rutina</td><td>Matlab</td><td></td><td>Datos complementarios</td></tr></tbody></table>

alta resolución volumen imágenes de neuronas por la exclusión de uso de fluorescencia método y dispositivos microfluídicos dedicada

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volumen es un parámetro importante en cuanto a características fisiológicas y patológicas de las neuronas en diferentes escalas de tiempo. Las neuronas son células bastante singular en cuanto a su morfología ramificada extendida y en consecuencia plantear algunos retos metodológicos para la medición de volumen. En el caso particular de en vitro crecimiento neuronal, la metodología solicitada debe incluir sub-micrométrica resolución axial combinada con la observación de campo completo en escalas de tiempo de minutos a horas o días. A diferencia de otros métodos como en la reconstrucción de la forma de la célula usando proyección de imagen confocal, medidas eléctricamente o microscopía de fuerza atómica, el recientemente desarrollado método de exclusión de fluorescencia (FXm) tiene el potencial para cumplir con estos desafíos. Sin embargo, aunque es simple en su principio, aplicación de una alta resolución FXm para neuronas requiere ajustes múltiples y una metodología dedicada. Aquí presentamos un método basado en la combinación de la exclusión de fluorescencia dispositivos microfluídicos múltiples compartimientos de baja rugosidad y finalmente micropatterning para lograr en vitro las medidas de volumen neuronal local. El proporcionado por el dispositivo de alta resolución nos permite medir el volumen local de procesos neuronales (neuritas) y el volumen de algunas estructuras específicas involucradas en el crecimiento neuronal, tales como conos de crecimiento (GCs).

El resultado del proceso de fabricación descrito en las secciones 1 y 2 se ilustra en las imágenes de la figura 1A-1B y la curva de la figura 1. La tabla de la figura 1 muestra los valores de rugosidad de dos diferentes áreas representativas de la viruta PDMS, es decir, en la central y la cámara intermedia de 20 μm de alto siguiente. Una disminución de la rugosidad por un factor de cerca de 7 se ha obtenido mediante grabado oblea de Si en lugar de photoresist SU-8. Entonces, FXm fue aplicado por primera vez en una franja de la fotoresistencia de geometría conocida (figura 2A) dentro de una cámara alta de 10 μm. Después de procesamiento de imágenes y conversión de altura de intensidad (véase el gráfico de la figura 2B), grandes perfiles en secciones transversales a lo largo de esta banda (figura 2) proporcionan los perfiles de altura deseada (Figura 2D). Figura 2D muestra la comparación entre los perfiles obtenidos mediante perfilometría mecánica y métodos de FXm. Estos perfiles, incluyendo el valor del borde y la meseta, son muy similares, validando el método. Tenga en cuenta que la dispersión de los datos de grandes no es representativa de la resolución final del método, como se evaluó en la figura 3 y figura 4, pero los resultados de la baja intensidad emplean para evitar un posible efecto de la muy débil auto-fluorescencia de photoresist en el canal GFP.
Entonces, observamos neurites de 3 μm y 10 μm alta cámaras (figura 3). La desviación estándar del ruido de fondo es cerca de 18 nm después de intensidad para corrección de conversión y de la antecedentes de altura. Este valor es ligeramente superior a la rugosidad de la física de superficies PDMS casted en superficies silicio (12 nm, consulte la tabla de la figura 1) pero mucho menor que la rugosidad medida en PDMS obtenidas de moldes de SU-8. Estos resultados destacan el valor añadido de la perforación de pozos en obleas de silicio en lugar de abrir agujeros en photoresist SU-8 para pilares. Un valor tan bajo permite una alta señal a ruido y obtener imágenes muy claras en el volumen como la que se muestra en la Figura 3A. Como ejemplo de los datos que pueden ser obtenidos de tales imágenes, calcula el volumen de 1,6 μm (es decir, 10 píxeles) amplia neurita cortar (véase el gráfico de la figura 3B). Uso de un ajuste lineal de estos datos en una primera aproximación da un valor de altura de neurita media de cerca de 400 nm, frente a por ejemplo el diámetro axonal 500 nm encontrados en 10 días cachorros viejo dentro del cuerpo calloso 5. También combinamos FXm con micropatrones de adhesión consisten en serie contrapeados μm 2 y 6 μm rayas anchas de 30 μm de longitud. Nuestro objetivo fue estudiar la influencia de la anchura del neurite en forma 3D. Figura 3 muestra una representación 3D en falso color de una imagen de neurona entera obtenida en una cámara alta de 10 μm. Neuritas se extienden sobre 2 μm y rayas anchas de 6 μm, mientras que el soma se encuentra en la extremidad de la banda más grande. Perfiles de altura fueron dibujados en tres secciones diferentes. En coherencia con el gráfico mostrado en la Figura 3A, la superficie integrada sobre el aumento de cortes transversales con la anchura de la neurita (figura 3D).
También nos enfocamos en las estructuras 3D de crecimiento cono (GC). Figura 4 A-B muestra dos diferentes perfiles GC obtenidos en una cámara alta de 3 μm, que resaltan su estructura ramificada de la sub. Además, se realizaron experimentos de lapso de tiempo para seguir la dinámica del volumen de GCs en una cámara alta de 12 μm. Figura 4 muestra un ciclo de contracción y la reactivación de un GC determinado dentro de una escala de tiempo de unas pocas decenas de minutos. Gracias a la utilización de ratones lifeact de GFP, conos de crecimiento fueron localizados en la longitud de onda de emisión de GFP (510 nm) de la concentración de actina alta. La superficie identificada en la longitud de onda se utilizó para integrar sobre la longitud de onda de emisión de dextrano en 647 nm para calcular volumen de GC. Figura 4 muestra finalmente la distribución del volumen de la GC en diferentes puntos temporales y la ubicación de tres neuronas diferentes, centradas en un valor de alrededor de 6 μm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Figura 1: cámaras de FXm PDMS. Esquemas (A) de las cuatro etapas principales de microfabricación conduce al molde final. Se indica la ubicación de la entrada, salida y embalses. Barras de escala: 1 m m. (B) imagen de la cámara de PDMS FXm obtenida con un Perfilómetro óptico. Esta imagen muestra la cámara central que contiene 3 filas de 10 μm de altos pilares y los compartimientos intermedios de 20, 50 y 90 μm de altura. Barra de escala: 500 μm. (C) vista transversal de la viruta a lo largo de las dos líneas punteadas dibujadas en (B). Amarillo/oro: sección transversal a lo largo de los pilares, azul: sección entre pilares. (D) significa que los valores de la rugosidad PDMS medición en 50 × 50 μm2 zonas moldeadas en silicona y en la cámara intermedia SU-8 alta 20 μm (ver las flechas para la ubicación de estas áreas). Se obtuvieron valores promedios de las mediciones de tres áreas diferentes. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Figura 2: calibración del método de FXm usando una fotoprotector de la raya como objeto de interés. (A) imagen de la fluorescencia de GFP en una cámara alta de 10 μm llena de 10.000 dextrano MW absorbente a 488 nm a 1 mg/mL. (B: fondo, P: Pilar). Observación con objetivo 40 X NA 0.8 seca. Barra de escala: 50 μm. (B) ley de calibración lineal obtenida de la intensidad media de los dos rectángulos coloreados se muestra en el perfil de intensidad de fluorescencia (C) a. obtenido a nivel de la línea discontinua azul en (A), cruzando la fotoresistencia Raya (μm 0.45 alta photoresist positivo). (D) comparación de los perfiles obtenidos de Perfilómetro mecánico (puntos negros) y grandes después de intensidad a la conversión de altura de los datos de (B) (puntos azules). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Figura 3: proyección de imagen de volumen neurita. (A) neurita que extendía en la cámara alta central de 3 μm de soma situado en la cámara intermedia siguiente 15 μm. Proyección de imagen realizada con 10.000 dextrano MW absorbente a 488 nm y 40 X, NA 0.8 seca objetivo. El margen obtenido después de que el uso de la rutina de reducción de fondo destaca los dos neurites y elegido para trazar la gráfica de la derecha. Barras de escala: 30 μm. (B) Neurite rebanada volumen como una función de la anchura de la neurita obtenida de los 22 perfiles (promedio 10 píxeles, es decir, en un 1.6 μm "neurite slice") se muestra en (A). La línea continua representa un ajuste lineal de pendiente 0.4 μm pasa por el origen. (C) imagen de color falso de una neurona con motivos en una banda adhesiva hecho de sucesivas μm 2 y 6 μm ancho tocones (representados en blanco). Las medidas fueron hechas en una cámara alta de 10 μm con 10.000 dextrano MW absorbente en 647 nm y utilizando una NA 40 x 0.8 seca objetivo. (D) perfiles de altura correspondiente a las líneas punteadas color que se muestra en (C), manteniendo el mismo código de color. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Figura 4: proyección de imagen de cono estático y dinámico crecimiento. (A-B) Perfiles de altura de cono de crecimiento obtenidos en una cámara alta de 3 μm después de intensidad a la conversión de altura a lo largo de las líneas amarillas muestran en imágenes asociadas. Observación realizada usando un relleno con 10.000 dextrano MW absorbente a 488 nm y 40 X, NA 0.8 seca objetivo. (C) proyección de imagen de neurona entera en una cámara alta de 12 μm llena de 10.000 dextrano MW absorbente en 647 nm. Observaciones se han hecho en dos canales fluorescentes: GFP para localización del cono de crecimiento (líneas amarillas punteadas) y CY5 para calcular volumen de GC de la exclusión de la fluorescencia. La superficie por líneas amarillas punteadas se utilizó para calcular el volumen de la GC. El gráfico muestra la variación del volumen de la GC en el tiempo y morfologías asociadas en canales de GFP y CY5 en dos momentos diferentes representativos. Todos los datos fueron adquiridos con una NA 40 x 0.8 seca objetivo cada barras de escala de 3 minutos: 10 μm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paso</td>
			<td>Máscara de capa de 1:8 μm</td>
			<td>Máscara 2:30 μm capa</td>
			<td>Máscara 3:40 μm capa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Autoensamblados</td>
			<td>30 s @ 2000 rpm</td>
			<td>30 s a 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocer al horno suave</td>
			<td>3 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min a 65 ° C + 6 min a 95 ° C</td>
			<td>3 min a 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Energía de la exposición</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-exposición cueza al horno</td>
			<td>4 min a 95 ° C</td>
			<td>1 min a 65 ° C + 6 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min a 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desarrollo</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hornear duro (opcional)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: pasos de fotolitografía realizaron para construir un dispositivo que contiene una camara de 12 μm de altura central. Alturas de las cámaras intermedias: 20, 50 y 90 μm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paso</td>
			<td>Máscara 1:10 μm capa</td>
			<td>Máscara 2:30 μm capa</td>
			<td>Máscara 3:40 μm capa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Autoensamblados</td>
			<td>30 s @ 1500 rpm</td>
			<td>30 s a 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocer al horno suave</td>
			<td>3 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min a 65 ° C + 6 min a 95 ° C</td>
			<td>3 min a 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Energía de la exposición</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-exposición cueza al horno</td>
			<td>4 min a 95 ° C</td>
			<td>1 min a 65 ° C + 6 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min a 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desarrollo</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hornear duro (opcional)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Fotolitografía los pasos realizados para construir un dispositivo que contiene una camara de 10 μm de altura central. Alturas de las cámaras intermedias: 20, 50 y 90 μm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paso</td>
			<td>Máscara 1:12 μm capa</td>
			<td>Máscara 2:32 μm capa</td>
			<td>Máscara 3:40 μm capa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de SU-8</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Autoensamblados</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
			<td>30 s @ 2500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocer al horno suave</td>
			<td>3 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min a 65 ° C + 5 min a 95 ° C</td>
			<td>3 min a 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo de exposición</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-exposición cueza al horno</td>
			<td>4 min a 95 ° C</td>
			<td>1 min a 65 ° C + 5 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min a 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desarrollo</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hornear duro (opcional)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Fotolitografía los pasos realizados para construir un dispositivo que contiene una camara de 3 μm de altura central. Alturas de las cámaras intermedias: 18, 50 y 90 μm.
Datos complementarios 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Vista esquemática de las máscaras que se utilizan para fabricar el dispositivo PDMS (DRIE máscara y máscaras 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Información adicional 2: archivo "masks_neuron_volume_chips.dxf". Archivos electrónicos que permiten para fabricar la máscara DRIE y máscaras 1-3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Información adicional 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Archivos electrónicos que permiten para fabricar la máscara utilizada para la fotolitografía de photoresist rayas. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Información adicional 4: archivo conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Datos complementarios 5: importfilevol.m del archivo <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">por favor haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Volumen es un parámetro importante en cuanto a las características fisiológicas y patológicas de las células. Se describe un método de exclusión fluorescente que permite medición de campo completo en vitro volumen neuronal con sub-micrométrica resolución axial necesaria para el análisis de neuritas y estructuras dinámicas implicadas en el crecimiento neuronal.

Alta resolución volumen imágenes de neuronas por la exclusión de uso de fluorescencia método y dispositivos microfluídicos dedicada

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

El objetivo general de este procedimiento es permitir la medición de campo completo del volumen neuronal in vitro con la resolución axial submicrométrica necesaria para el análisis de neuritas en estructuras dinámicas implicadas en el crecimiento neuronal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia celular con respecto a la dinámica de los cambios de volumen a escala subsidiada durante la degeneración no creciente o axónica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una resolución axial submicrométrica combinada con una observación de ajuste completo y una escala de tiempo a horas o días.Para comenzar el procedimiento, desmolde el bloque de PDMS bajo una cubierta química vertiendo isopropanol sobre él. A continuación, colócalo en el banco de acero inoxidable de la campana. Corta alrededor de la oblea de silicona y desmolda la réplica de PDMS.Luego, corta alrededor de la astilla y deja un margen de dos milímetros con un bisturí o una cuchilla de afeitar. Perfore la entrada presionando firmemente el perforador de 1,5 milímetros de diámetro y actívelo para cortar y tallar el orificio de la entrada. Haga lo mismo en las cuatro zonas dedicadas del chip donde se inyectará el líquido.Después, limpie el chip pegando y despegando la cinta adhesiva en el lado microestructurado. Espolvorea isopropanol por ambos lados. A continuación, seque la viruta con nitrógeno presurizado utilizando una pistola de aire.En este procedimiento, coloque cada cubreobjetos en un spin-coater ubicado en un entorno de sala limpia. Aplique una gota de fotorresistencia positiva para cubrir aproximadamente el 75% del cubreobjetos y centrifugar a 4000 rpm durante 30 segundos para alcanzar un espesor final de 0,45 micrómetros. Coloque los cubreobjetos en una placa calefactora con una temperatura superficial de 115 grados centígrados durante un minuto.Usando un alineador de mascarillas, exponga cada cubreobjetos a una longitud de onda de 435 nanómetros a través de la mascarilla dedicada de acuerdo con los parámetros del fabricante. A continuación, prepare dos platos de cristalización de vidrio, uno que contenga el revelador sin diluir y el otro que contenga agua desionizada. Sumerja los cubreobjetos uno a uno en el revelador durante un minuto mientras revuelve continua y suavemente el plato de cristalización.Luego, sumerja la oblea en agua desionizada durante unos cinco segundos. Transfiera la oblea a un papel absorbente y séquela con nitrógeno presurizado usando una pistola de aire comprimido. Coloque el chip PDMS y el plato de vidrio en el que se unirá a la cámara de plasma para la activación de la superficie.A continuación, deposite una gota de agua en un portaobjetos de cristal de microscopio grueso rectangular y pegue el cubreobjetos en el portaobjetos de cristal por capilaridad. Bajo un microscopio, marque la ubicación de las rayas fotorresistentes en la parte posterior del portaobjetos de vidrio. Coloque el cubreobjetos de vidrio estampado en el soporte de la mascarilla del alineador de mascarillas.Confíe en la marca hecha para centrar los objetos de referencia fotorresistentes. Para aumentar el contraste óptico, coloque una oblea de silicio debajo del chip PDMS. La oblea de silicona debe permanecer firmemente adherida al mandril durante el proceso de alineación.A continuación, coloque el chip PDMS en el soporte de sustrato móvil del alineador de mascarillas. Posteriormente, levante el mandril lo suficiente como para visualizar tanto el chip como el conjunto de franjas fotorresistentes ubicadas en el cubreobjetos mientras permanece detrás del contacto mecánico. Realice la alineación y logre el contacto mecánico entre el chip y el cubreobjetos levantando el mandril hasta que la superficie de los pilares del PDMS toque el cubreobjetos de vidrio.Después de eso, baje el mandril. Retire el cubreobjetos adherido al chip del soporte de la mascarilla. Luego, coloque el dispositivo en una placa de Petri de 35 milímetros y transfiera todo al horno durante cinco a diez minutos para aumentar la fuerza de unión.Treinta minutos después de la unión, coloque una punta de pipeta de diez microlitros llena de solución de PLO en la entrada. Luego, cargue el líquido hasta formar una gota encima. Repita la misma operación en la salida y los depósitos.Posteriormente, agregue PBS en la placa de Petri alrededor del chip. Selle la placa de Petri con una película de parafina e incube a temperatura ambiente con un mínimo de cinco horas. Luego, presione ligeramente un cono de punta de diez microlitros en cada orificio de inyección y aspire el exceso de líquido.A continuación, reemplace el PLO y el PBS que rodea el chip por el medio de cultivo. Después, coloque el chip en la incubadora regulada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que las neuronas se siembren con un mínimo de cinco horas de tiempo de incubación. En este procedimiento, extraiga el medio de cultivo a partir de la viruta.Recoja dos o tres microlitros de la solución celular recién resuspendida e inyéctela en la entrada. Repita inmediatamente la misma operación en la salida. Inyecte aproximadamente el mismo volumen de medio de cultivo en cada depósito.Observe rápidamente el chip bajo el microscopio para comprobar la densidad de las células. El orden de magnitud de la densidad óptima de celdas corresponde a unas cinco a diez celdas dentro de la superficie cuadrada delimitada por cuatro pilares. Repita el procedimiento de inyección de 0,5 a 1 microlitro de suspensión celular para alcanzar la densidad celular objetivo.Para la obtención de imágenes, sustituya el medio de cultivo por el medio de obtención de imágenes. Luego, coloque el chip bajo un microscopio de epifluorescencia. Adquiera imágenes de células de una a varias imágenes sucesivas en el caso de experimentos de lapso de tiempo.Aquí se muestran las observaciones representativas de una banda fotorresistente de calibración y neuronas. Las imágenes de mayor aumento y las secciones transversales de estos objetos se muestran a la derecha. Aquí se muestran las neuritas representativas y una cámara central de tres micrómetros de altura.El volumen de la rodaja de neurita se puede calcular en función del ancho de la neurita. Y aquí están los conos de crecimiento representativos y una cámara central de tres micrómetros de altura. Sus subestructuras emergen claramente de un ruido óptico de fondo de unos 20 nanómetros.Observaciones de lapso de tiempo de neuronas de acto de vida sembradas en una cámara de 12 micrómetros de altura para seguir el ciclo de contracción y reactivación del cono de crecimiento dentro de una escala de tiempo de unas pocas decenas de minutos. Al intentar este procedimiento, es importante tener acceso a un equipo de grabado iónico profundo para fabricar el lodo de silicona. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo alinear un cubreobjetos de vidrio estructurado con un chip PDMS.Una vez dominada, esta técnica puede aplicarse de forma reproducible a la cuantificación de la neurología en 3D. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la farmacología exploraran el efecto de varios medicamentos con calibre real, todos en forma de cono cerrado. No hay que olvidar que trabajar con neuronas primarias requiere muchos cuidados para evitar contaminaciones y roturas.Sea siempre amable y rápido al cambiar de medio para limitar el tiempo que pasan fuera de la incubadora.

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Aquí se describe un método rápido y sencillo a las células de la imagen marcados con fluorescencia en rodajas de cerebro semi-espesa. Mediante la fijación, corte, limpieza y ópticamente el tejido cerebral se describe la forma de imagen estándar de epifluorescencia y confocal se puede utilizar para visualizar las células individuales y las redes neuronales en el tejido nervioso intacto.

Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

Transporte retrógrado de tinte fluorescente etiqueta a una subpoblación de neuronas en base a la proyección anatómica. Axones etiquetadas pueden orientarse...

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

Una técnica de imagen para el monitoreo de los cambios de potencial de membrana con una resolución temporal sub-micrométrico espacial y sub-milisegundos es descrito. La técnica, basado en una excitación láser de colorantes sensibles a voltaje, permite realizar mediciones de señales en los axones y colaterales axónicas, ramas terminales individuales dendríticas, y las espinas dendríticas.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Este video demuestra cómo las vesículas neuronales se marcan con proteínas fluorescentes específicas para visualizar su movimiento. Primero, un plásmido que codifica para una proteína fluorescente se incuba con un agente de transfección y luego se introduce en un cultivo de neuronas. Posteriormente, se adquieren imágenes de las neuronas y se analizan para rastrear el movimiento de las vesículas.

Visualización de las motilidades de las vesículas en las neuronas mediante imágenes de fluorescencia

Se describe cómo implementar la localización microscopía fotoactivado (PALM) basado en estudios de vesículas en las neuronas cultivadas, fijos. Los componentes clave de nuestro protocolo de etiquetado incluyen vesículas con quimeras fotoconvertible, recogiendo imágenes crudas escasamente muestreados con un sistema de microscopia de super-resolución, y el procesamiento de las imágenes en bruto para producir una imagen de super-resolución.

Super-resolución de imagen de Neuronales vesículas de núcleo denso

Cuatro dimensiones (4D) de formación de imágenes se utiliza para estudiar el comportamiento y las interacciones entre los dos tipos de endosomas en los terminales nerviosos de vertebrados vivían. Movimiento de estas pequeñas estructuras se caracteriza en tres dimensiones, permitiendo la confirmación de eventos tales como la fusión endosoma y la exocitosis.

Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Aquí presentamos un protocolo basado en la microscopía para la proyección de imagen de alta resolución y una reconstrucción tridimensional del ratón unidad neurovascular y barrera blood - brain con secciones libres del cerebro. Este método permite la visualización, análisis y cuantificación de los organelos intracelulares en el BBB.

Alta resolución imagen Confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3D y cuantificación de transcitosis

Este protocolo describe el uso de virutas de plástico a la cultura y compartimentar primarias neuronas murinas. Estos chips son confecciones, fácil de usar y compatible con alta resolución, en directo y la proyección de imagen de la fluorescencia. Este protocolo describe cómo las neuronas hippocampal de la rata dentro de estos chips de la placa y realizar la inmunotinción, axotomía y aislamiento fluídica.

Uso de Chips microfluídicos plástico premontados para compartimentar primarias neuronas murinas

El protocolo proporciona un método detallado de imágenes neuronales en cortes cerebrales utilizando un método de limpieza de tejidos, ScaleSF. El protocolo incluye la preparación del tejido cerebral, la clarificación del tejido, el manejo de rodajas despejadas y la microscopía de escaneo láser confocal de las estructuras neuronales desde los niveles mesoscópicos hasta los microscópicos.

Un método de limpieza de tejidos para imágenes neuronales de escalas mesoscópicas a microscópicas

Cuando se integra con una placa de cabeza y un diseño óptico compatible con microscopios de uno y dos fotones, la lente de microprisma presenta una ventaja significativa en la medición de respuestas neuronales en una columna vertical en diversas condiciones, incluidos experimentos bien controlados en estados de cabeza fija o tareas de comportamiento natural en animales que se mueven libremente.

Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija

Aprende a medir volúmenes neuronales in vitro con resolución submicrométrica mediante exclusión de fluorescencia y microfluidos PDMS. Este método permite analizar dinámicas de neuritas y conos de crecimiento en tiempo real.

Alta resolución volumen imágenes de neuronas por la exclusión de uso de fluorescencia método y dispositivos microfluídicos dedicada (Video) | JoVE Journal

Alta resolución volumen imágenes de neuronas por la exclusión de uso de fluorescencia método y dispositivos microfluídicos dedicada

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