Name: Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a descelularizar corazones fetales y adultos de ratón para comparar propiedades de la matriz extracelular en 3D. Este método estandarizado facilita estudios de biología cardiovascular y regeneración tisular.

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Los autores están en deuda con todos los miembros del laboratorio de Pinto-Ó relevante discusión crítica. Este trabajo fue apoyado por el Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) en el proyecto "ingeniería CARDIOSTEM los tejidos cardiacos y terapias basadas en células madre para aplicaciones cardiovasculares" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. es un beneficiario de una beca FCT [SFRH/BD/88780/2012] y M.J.O. es miembro de la FCT (FCT-investigador 2012).

Todas las metodologías descritas fueron aprobadas por el i3S Comité de ética Animal y Direção Geral de Veterinária (DGAV) y están de acuerdo con Parlamento Europeo Directiva 2010/63/UE.
1. preparación de las soluciones de descelularización
Nota: Todos descelularización soluciones deben ser filtradas a través de un filtro de membrana de 0,22 μm y almacenadas por un máximo de 3 meses, excepto se especifique lo contrario.
<ol><li>De 1 x PBS: mezclar 8 g de NaCl, 1,01 g de Na2HPO4 200 mg de KCl y 200 mg de KH2PO4 con 900 mL de agua desionizada (agua desionizada). Ajustar el pH de la solución a 7.5 y el volumen de solución final hasta 1 L. filtro, autoclave y tienda la solución a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Para el tampón hipotónico (10 mM Tris, EDTA 0,1%): disolver 1,21 g de TrisBASE y 1 g de EDTA en 900 mL de agua desionizada. Ajustar el pH de la solución a 7.8 con NaOH/HCl y el volumen de solución final a 1 L. filtro, esterilizar en autoclave y almacenar a TA.</li>
	<li>Para la solución de SDS 0,2% (0.2% SDS, 10 mM Tris): Añadir 0,6 g de TrisBASE y 1 g de sulfato de sodio dodecyl (SDS) en 400 mL de agua desionizada y mezclar a 60 ° C hasta disolución completa del soluto. Deje que la solución se enfríe a RT. ajuste solución pH a 7.8 y el volumen de solución final a 500 mL. Esterilizar la solución por filtración. Nota: La solución de SDS se prepara antes de usar. Solución de filtrado sólo tras completar disolución SDS, de lo contrario las partículas insolubles de la SDS saturan el filtro, variando la concentración final de SDS y afectando, en consecuencia, eficacia de descelularización de tejido.</li>
	<li>Para el tampón de lavado hipotónica (10 mM Tris): mezcla de 1,21 g de TrisBASE en 900 mL de DI agua. Ajustar el pH de la solución a 7.8 y el volumen final de 1 L. filtro, esterilizar en autoclave y almacenar a TA.</li>
	<li>Para el tratamiento de DNasa (20 mM Tris, 2 mM de MgCl2, 50 U/mL DNasa): disolver 2,42 g de TrisBASE y 2 mL de 1 M de MgCl2 en 900 mL de agua desionizada. Ajustar pH a 7.8 y el volumen de solución final a 1 L. filtro y esterilizar la solución por autoclave. Almacene la solución en RT. agregar ADNasa I (50 U/mL) antes de usarlo.</li>
	<li>Para DNase stock solución: preparar un tampón de DNasa que contiene 50% glicerol, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl2y se ajustan a un volumen de solución final de 10 mL con agua desionizada. En campana de flujo laminar, agregue la ADNsa I polvo al buffer de DNasa y mezclar suavemente hasta disolución completa. Esterilizar la solución a través de 0.22 μm filtro. Preparar alícuotas de 1 mL y almacenar a-20 ° C.</li>
</ol>2. tejidos y criopreservación
<ol><li>Eutanasia a las hembras embarazadas adultas a los 18 días de gestación (fetos E18) a través de CO2 asfixia. Realizar una cesárea en las mujeres con una tijera quirúrgica y recoger los cuernos uterinos con los ratones fetales a una placa Petri con helada 1 x PBS utilizando dos pinzas dentadas con punta curvada (una pinzas en cada extremo del cuerno).<ol>
<li>Abrir los cuernos uterinos y el saco amniótico para aislar a los fetos. Transferencia de los fetos a una nueva caja Petri con helada 1 x PBS para anestesiarlos y decapitar con una tijera.</li>
		<li>Eutanasia a ratones C57BL/6 machos 7-8 semanas de edad, uso de CO2 asfixia. Realizar una incisión en el pecho de cada ratón y recoge el corazón.</li>
		<li>Enjuague el corazón fetal y adulto con PBS 1 x frío de hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire las aurículas del corazón adulto con la ayuda de un bisturí. Realizar una incisión en el ventrículo derecho y extraerlo con unas tijeras recta pequeñas. Exponer la pared interna del ventrículo izquierdo quitando el tabique. En una nueva placa de Petri, dividir el ventrículo izquierdo libre de la pared en tiras longitudinales con 2 mm de espesor y retirar el músculo papilar usando un bisturí y pinzas dentadas con puntas curvas.<ol>
<li>Impuestos especiales explantes pequeños de tejido con la ayuda de un bisturí con una cuadrícula de 2 x 2 mm (Descripción detallada en el suplementario figura 15). Enjuague explantes de tejido con PBS 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 250 μl de la temperatura de corte óptima (OCT) compuesta para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL esterilizado. Transfer corazones todo fetal y adulto explantes cardíacos a los tubos con 250 μl de OCT y congelar con isopentano enfriado con hielo seco y conservar a-80 ° C (hasta un máximo de 6 meses). Nota: El uso de explantes de tejido cardiaco congelados por más de 6 meses reducirá significativamente la eficiencia de la descelularización, especialmente en los explantes de tejido del corazón adulto.</li>
</ol>3. descelularización tejido
Nota: Descelularización de tejido cardiaco se realiza en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con una muestra por pozo. 1 mL de cada solución de descelularización se añade a cada pocillo. Todos los pasos de descelularización deben realizarse con agitación a 165 rpm (coctelera de la incubadora con un diámetro orbital de 20 mm) y a 25 ° C, a menos que se especifique lo contrario. Para más detalles, consulte el esquema de la figura 1A. Anfotericina B (fungizonepor ejemplo ) y gentamicina son recién añadidos a todas las soluciones de descelularización antes del uso a una concentración final de 2,5 μg/mL y 0.01 μg/mL, respectivamente. Cuantificar la cantidad de ADN conservado dentro de los tejidos decellularized, la muestra masa deben determinarse antes de iniciar el protocolo de descelularización. El protocolo de cuantificación de ADN es más detallada en 5.1.
<ol><li>
DÍA 1
	<ol>
<li>Extraer muestras de tejido del congelador de-80 ° C. Dejar 1,5 mL tubos de microcentrífuga en RT hasta OCT se convierte parcialmente derretido. Transferir el bloque de tejido cardiaco del OCT congelado a una placa de Petri con PBS 1 x.</li>
		<li>Después del OCT se derrite, hacia el tejido cardiaco una nueva placa de Petri con PBS 1 x. Las muestras de lavado de 1 x PBS y a 60 rpm con un agitador de 10-15 minutos repetición al menos dos veces.</li>
		<li>Añadir 1 mL de trabajo tampón hipotónico por pozo de una placa de cultivo estériles para tejidos 24-bien. Transferir una muestra por pozo con la ayuda de fórceps.</li>
		<li>Mover la placa de cultivo de tejido de 24 pocillos con las muestras a una coctelera de la incubadora a 25 ° C y comenzar la incubación de 18 h con tampón hipotónico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DÍA 2
	<ol>
<li>Preparar la solución de SDS 0,2% como se describe en la sección 1.3.</li>
		<li>Aspirar el tampón hipotónico y lavar las muestras con PBS 1 x por veces 1 h. repetir 3. Nota: Pausa punto: tejido bajo descelularización puede conservarse en PBS 1 x a 4 ° C por 18 h en condiciones estáticas.</li>
		<li>Retirar el PBS 1 x, agregue 1 mL de solución de SDS recién hecha (paso 1.3) por pozo e incubar las muestras durante 24 horas. Nota: Incubación (CHECK POINT) Post SDS Asegúrese de que las muestras exhiben un blanco de aspecto translúcido. En este paso, SDS tratadas las muestras son bañadas en el ADN, mostrando una consistencia gelatinosa. Eliminar la solución de SDS lentamente para evitar la adherencia de la muestra a la punta de la pipeta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DÍA 3
	<ol>
<li>Lavar las muestras con tampón de lavado hipotónica (1 mL por pozo) por 20 minutos, repetir 3 veces. Nota: En este paso, es normal observar una disminución en el tamaño de la muestra debido a la eliminación de restos celulares. PUNTO de pausa: Tejido bajo descelularización puede conservarse en tampón de lavado hipotónica a 4 ° C por 18 h en condiciones estáticas.</li>
		<li>Añadir 1 mL de solución de tratamiento de DNasa por bien e incubar las muestras durante 3 h a 37 ° C.</li>
		<li>Aspire la solución de tratamiento de DNasa y lavar las muestras con PBS 1 x (1 mL por pozo) por 20 minutos, repetir 3 veces. Realizar un último lavado con PBS 1 x (1 mL por pozo) durante la noche en RT y agitación a 60 rpm.</li>
		<li>(Check point) Después del tratamiento de DNasa, asegúrese de que las muestras decellularized han perdido la consistencia de gelatina. Nota: Después del tratamiento de DNasa, retirar y añadir 1 x PBS suavemente desde muestras pueden ser fácilmente atrapadas y atadas a la punta de la pipeta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. evaluación de la extracción de células de tejido decellularized
<ol><li>Fijar las muestras en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, 1 muestra por pozo, añadiendo 1 mL de tampón neutro recién hecha de formalina al 10% con eosina acuosa 0,03% por 2.5-3 h a TA. Nota: Eosina se agrega al fijador para teñir los tejidos decellularized y para facilitar la visualización de la muestra durante el seccionamiento y la coloración histológica. La adición de la eosina que ni interfieren con las manchas histológicas ni con técnicas de inmunofluorescencia. Por otra parte, la fijación puede realizarse durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Retirar la solución fijadora y añadir 1 mL de PBS 1 x a lavar la muestra.</li>
	<li>Encapsular el bioscaffolds fijo en procesamiento histología gel usando un molde de muestra desechables de vinilo según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Retirar el gel de la histología con la muestra incrustada del molde y la transferencia a biopsia procesamiento/incrustación Cassettes con tapa. Nota: Una alternativa al tejido de incrustar en la histología y tratamiento gel es para procesar cada muestra en dos esponjas de biopsia con poros pequeños. Las muestras deben localizarse en el centro de las esponjas de la biopsia para habilitar la detección. De nota, algunas muestras pueden ser difíciles de localizar utilizando este enfoque.</li>
	<li>Procesar las muestras de parafina inclusión a través de incubaciones sucesivas (30 min por solución) en serie de concentraciones de alcohol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), solución de hidrocarburo alifático isoparaffinic (2 estaciones de incubación) y parafina (incubación 2 estaciones) a 56 ° C.</li>
	<li>Montar las muestras en un bloque de parafina.</li>
	<li>Cortar 3 tramos de parafina μm de espesor en un micrótomo y recoger las secciones sobre portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Secciones de la parafina seca durante la noche a 37 ° C. Nota: Las secciones de parafina (pausa punto) se almacenan a 4 ° C hasta su uso posterior.</li>
	<li>Para verificar la eficacia del Protocolo, realizar hematoxilina y eosina (H & E) y TRICROMICA de Masson (TM) la coloración de las secciones de la muestra decellularized y a las secciones de tejido no manipulados según las instrucciones del fabricante. Nota: H & E tinción manchas celular núcleos azul/violeta, citoplasma rosado/rojo oscuro y colágeno pálido rosado y MT las manchas negras de los núcleos, citoplasma rojo y colágeno y mucina azul. Descelularización eficiente se logra cuando un poroso rosa (H & E, MT) y se observa red azul (MT), en ausencia de una tinción nuclear.</li>
</ol>5. evaluación de remoción de material nuclear de tejido decellularized
Nota: Debe realizarse la cuantificación del contenido de ADN en el tejido decellularized en comparación con el tejido respectivo no manipulado.
<ol><li>Antes de descelularización, pesar un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en una balanza digital de alta precisión. Transferir el tejido cardiaco al tubo, retire la cantidad extra de 1 x PBS y pese el tubo con las muestras. Calcular el peso húmedo de las muestras: Pesohúmedo = peso del tubo con muestras – peso tubo vacío
</li>
	<li>Decellularize las muestras como se describe en el paso 3.</li>
	<li>Después de descelularización, recoger los tejidos decellularized en un tubo de microcentrífuga.<ol>
<li>Debido a las pequeñas dimensiones y masa de las muestras individuales cardiacas y kit especificaciones, piscina decellularized los tejidos de cada condición de la muestra (corazón fetal: 5 corazones enteros; adultos LV de explantes: 15 explantes). Realizar el mismo procedimiento con el tejido no manipulado. Nota: (Punto de pausa) las muestras pueden ser almacenadas a-20 ° C hasta que se realizaron la extracción de ADN y cuantificación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte no manipulados y decellularized los tejidos de explantes pequeños con la ayuda de un bisturí en una caja de Petri limpia. Nota: Use un bisturí individual y un plato de Petri por cada muestra. Alteración mecánica de las muestras con un bisturí facilita su posterior digestión enzimática y posterior extracción de ADN.</li>
	<li>Para la extracción de ADN, usar un método de extracción de ADN de vuelta-columna base según las instrucciones del fabricante.<ol>
<li>Recolectar las muestras mecánicamente disociadas de la placa de Petri con el tampón de digestión principal (tampón de digestión y proteinasa K) según las instrucciones del fabricante utilizando una pipeta de amplio orificio. Nota: Lisis de tejido con digestión proteinasa K es más rápido en las muestras de decellularized. Para procesar muestras distintas al mismo tiempo, mantener las muestras sometidas a lisis en hielo, hasta que todas las muestras son sometidas a lisis para minimizar la degradación. Lisis de muestras completas se logra entre 4-6 h.</li>
		<li>Proceder con el protocolo según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Para aumentar los rendimientos de ADN extraído de muestras de tejido decellularized y no decellularized, eluir el ADN en 25-50 μL y 100 μL de tampón de elución, respectivamente. Recoger el ADN eluído y carga la columna de vuelta. Incubar durante 1 min a RT. centrifugar las muestras según las instrucciones del fabricante. Nota: (Pausa punto) el ADN extraído de las muestras puede almacenar a-20 ° C hasta su uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificar el ADN extraído de las muestras con un kit de detección fluorescente dsDNA siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Normalizar el contenido de ADN como nanogramos de ADN por miligramo de peso húmedo de la muestra inicial (antes de descelularización).</li>
</ol>6. celular de andamios decellularized siembra
Nota: Todos los reactivos/soluciones tienen que ser estériles y todo el procedimiento se realiza en condiciones estériles.
<ol><li>Preparar 1 x DPBS con 2.5 μg/mL de anfotericina B y el 1% P/S (100 U.I. penicilina, estreptomicina 100 μg/mL).</li>
	<li>Retire la solución PBS 1 x del última descelularización lavado paso (3.3.3) y agregar 500 μL por pocillo de la recién preparado 1 x DPBS/2.5 μg/mL de anfotericina B/1% P/S solución. Almacenar las muestras a 4 ° C de 1-7 días. Nota: Almacenamiento de las muestras a 4 ° C es importante para mantener la esterilidad.</li>
	<li>Agregar P/S para celular media basal (sin FBS y suplementos) a una concentración final de 1%.</li>
	<li>Aspire 1 x DPBS/2.5 μg/mL de anfotericina B/1% P/S solución de las muestras decellularized. Añadir 500 μL por pocillo de célula basal media/1% P/S y dejar muestras equilibre durante 1 h a 37 ° C o a 4 ° C por más de 1 h.</li>
	<li>Dividir las celdas de interés y preparar pequeñas alícuotas de células en la densidad celular deseado. Nota: La siembra de decellularized tejido debe realizarse en un microscopio estereoscópico y en condiciones estériles. Medios de cultivo celular debe contener 1% P/S.</li>
	<li>Pipetear 3-4 μL de DPBS al centro de un pozo de una placa de 96 pocillos. Con unas pinzas finas y rectas, los andamios decellularized de transferencia a la caída DPBS, quitar la DPBS extra por aspiración y asegúrese de que la muestra no está doblada o arrugada. Que se convierten en los bordes se adhieran a la superficie bien seca. Nota: Andamios separados tienen menor eficiencia de siembra.</li>
	<li>Añadir las células al andamio mediante pipeteo la solución sola célula lentamente contra los bordes del pozo. Nota: por ejemplo, cardiomiocitos neonatales de rata son sembradas con a una densidad de 7.500 células/mm2 y ratón inmortalizado Lin− Sca-1+ cardiaco las células progenitoras (CIPCSca-1) con una densidad de 60 1.500 células/mm2. Ajustar la densidad de célula según la lógica experimental.</li>
	<li>Añadir DPBS a los pozos vecinos para evitar la evaporación rápida de los medios de comunicación.</li>
	<li>24 horas post siembra celular, si el tipo de célula utilizado adherido a las placas de poliestireno de cultivo de tejidos (TCPS), transfiere bioscaffolds a un nuevo pozo. En caso contrario, sustituir el medio para eliminar las células no adherentes.</li>
	<li>Cambie cuidadosamente los medios según los requisitos específicos del tipo de la célula.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La matriz extracelular (ECM) es una red altamente dinámica y compleja de glicoproteínas fibrosas y adhesivas, que consiste en un depósito de numerosos péptidos bioactivos y atrapado los factores de crecimiento. Como importante modulador de la adhesión celular, dinámica del citoesqueleto, movilidad y migración, proliferación, diferenciación y apoptosis, ECM regula activamente el comportamiento y función celular. Sabiendo que el comportamiento celular difiere en 2D y 3D de las culturas, se han hecho esfuerzos para desarrol...

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Gladstone Institutes, University of California San Francisco
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Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

La matriz extracelular (ECM) es una red dinámica de moléculas que regulan importantes procesos celulares, es decir, decisión de la suerte, proliferación y diferenciación de1,2. La investigación de las interacciones célula-ECM se ha realizado principalmente en dos dimensiones (2D) en vitro culturas recubierto con componentes de ECM, que constituyen una simplificación de las propiedades nativas de ECM en vivo. Descelularización genera acelular bioscaffolds de ECM como 3D que conservan en gran medida la arquitectura extracelular y composición de los tejidos nativos y órganos3,4. Además de servir como andamios bioactivos para ingeniería de tejidos, biomateriales de ECM 3D decellularized surgen como nuevas plataformas para evaluar biología celular-ECM eso paralelo el ambiente en vivo.
Evaluación de la función diferencial de los componentes de la ECM de distintos tejidos, órganos y edad se beneficiará con el uso de protocolos similares de generar bioscaffolds nativo. En el corazón, hemos desarrollado un protocolo versátil de la descelularización de muestras derivadas de adulto y fetales, como una alternativa para realizar estudios comparativos del microambiente de órgano. Utilizando esta metodología, Capturamos el microambiente cardiaco nativo y demostró que la ECM fetal promueve mayores rendimientos de la repoblación de células cardíacas5. Descelularización dispone identificación de residente diferencias estructurales entre ECM fetal y adultos a nivel de la lámina basal y pericelular arreglo de malla de matriz y fibra composición5. Antes de este trabajo, la comparación directa de los tejidos en las diferentes etapas ontogenic utilizando el mismo enfoque de descelularización se ha divulgado solamente para roedores corazones y riñones de mono rhesus. Además, un número limitado de estudios Informe tejido/órgano fetal descelularización propiamente5,6,7. Esto se ha logrado utilizando SDS como agente único descelularización; sin embargo, diferentes concentraciones de SDS se utilizaron para la descelularización de tejido cardíaco fetal y adulto7,8. SDS es uno de los detergentes iónicos más eficaces para la remoción de material citoplásmico y nuclear y ampliamente utilizado en la descelularización de diferentes tejidos y muestras de9,10. Soluciones que contienen altas concentraciones de SDS y largos períodos de exposición se han correlacionado con la desnaturalización de la proteína, pérdida de glicosaminoglicanos (GAGs) y alteración de las fibrillas de colágeno de10,11y por lo tanto un equilibrio entre preservación y celular la eliminación de ECM es necesario. Para aplicar el mismo procedimiento al tejido del corazón fetal y adulto, el protocolo descrito en este documento se divide en tres pasos secuenciales: lisis de células por choque osmótico (tampón hipotónico); solubilización de lípidos y proteínas, DNA-proteína y proteína-proteína interacciones (0.2% SDS); y remoción de material nuclear (tratamiento de DNasa).
Nuestro protocolo muestra varias ventajas: i) la posibilidad de descelularización equivalente de tejidos cardiacos específicos de la edad mediante la aplicación de la misma estrategia de descelularización; II) no hay requisitos para métodos especializados o equipos; III) listo adaptación a otros tejidos y especies como se ha aplicado con éxito con menores alteraciones en las biopsias del intestino humano12 y ratón pulmonar13; y, sobre todo, iv) puede abordar propiedades biomecánicas ECM permitiendo el montaje de las culturas organotypic de 3D como que más imitan muy de cerca las características moleculares del microambiente del tejido nativo.

<table><tbody><tr><td><Equipo fuerte>< / fuerte></td>Agitador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sobremesa incubado</td><td>Agitadores orbitales</td><td>IKA:3510001</td><td>Fluorímetro recomendado</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo disponible</td></tr><tr><td>Báscula de peso digital</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo disponible</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo disponible</td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo disponible</td></tr><tr><td>Nevera (4&ordm; C)</td> <td>-</td><td></td> <td>Equipo disponible</td></tr><tr><td>Congelador (-80&ordm; C)</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo disponible</td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo disponible</td></tr><tr><td><fuerte>Instrumentos circúrgicos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tijeras de resorte - 2,5 mm de filo</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>5000-08</td><td>Recomendado</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont 5 - Biologie/Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Recomendado</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont 7</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>Tijeras de</td></tr><tr><td>disección recomendadas, rectas</td><td>-</td><td>-</td><td>Herramienta disponible</td></tr><tr><td>Pinzas, dentadas, curvas</td><td>-</td><td>-</td><td>Herramienta disponible</td></tr><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 placas de pocillos, envueltas individualmente</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td>-</td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos, envueltas individualmente</td><td>VWR</td><td>71000-078-Steriflip-GV</td><td></td></tr><tr><td>, 0.22&micro; m, PVDF,</td><td>Millipore</td> radioesterilizado <td></td><td></td></tr><tr><td>SE1M179M6-Eppendorff</td><td>-</td><td>-</td><td>Material disponible</td></tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>430791-50 mL Tubos Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>430829-Four-Compartment Biopsia Procesamiento/Inclusión Casetes con tapa</td><td>Microscopía Electrónica Ciencia</td><td>70075-B</td><td>-</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus de Fisherbrand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>-</td></tr><tr><td>Tissue cryopreservation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryomatrix resina de inclusión</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>6769006-2-METILBUTANO ANHIDRO 99+% (isopentano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258-1L-Hielo</td><td></td></tr> <tr><td>seco</td><td>- </td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td><fuerte>Descelularización</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BDH Prolabo</td><td>27810.364-Na</td><td></td></tr><tr><td>2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-31264-KH</td><td></td></tr><<tr><td>sub>2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100g-KCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8041-1KG-TrisBASE</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G-Dodecil</td><td></td></tr> <tr><td>sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4390-MgCl</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>MERCK</td><td>1.05833.1000-DNAse</td><td></td></tr> <tr><td>I</td><td>AplliChem</td><td>A3778,0050-Gentamicina</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>-</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026-Agua</td><td></td></tr> <tr><td>desionizada (agua desionizada)</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td><fuerte>Histología</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % tampón neutro de formalina</td><td>Prolabo</td><td>361387P-Eosina</td><td></td></tr> <tr><td>Y AQUEOUS</td><td>Surgipath</td><td>01592E</td><td>Puede ser reemplazado por eosina alcohólica</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific HistoGel Gel de procesamiento de muestras</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012-Etanol</td><td></td></tr> alcohol <tr><td>etílico 99,5% anydrous</td><td>Aga</td><td>4,006,02,02,00-Agua</td><td></td></tr> <tr><td>desionizada (agua desionizada)</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Clear Rite 3</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>6915-Shandon</td><td></td></tr> <tr><td>Histoplast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RAS.6774006</td><td>-</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>K182001-Quant-iT PicoGreen&nbsp; dsDNA kit</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>-</td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>VWR</td><td>45000-434-Penicilina-Estreptomicina</td><td></td></tr> <tr><td>Solution 100X</td><td>Labclinics</td><td>L0022-100-Fungizone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026-Medios</td><td></td></tr> <tr><td>de cultivo celular de la célula de interés</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco fetal y adulto como 3d-como plataformas para estudios in vitro

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Conocimiento actual de la matriz extracelular (ECM)-comunicación celular se traduce en estudios grandes bidimensional (2D) cultivo in vitro donde se presentan componentes de ECM como una capa superficial. Estos sistemas de cultivo constituyen una simplificación de la compleja naturaleza de la ECM que abarca la composición bioquímica, estructura y propiedades mecánicas del tejido. Para imitar mejor la comunicación ECM-la célula que forma el microambiente cardiaco, hemos desarrollado un protocolo que permite la descelularización del corazón entero fetal y tejido adulto ventrículo izquierdo explantes simultáneamente para estudios comparativos. El protocolo combina el uso de un tampón hipotónico, un detergente de características de surfactante aniónico y el tratamiento de DNasa sin ningún requisito de conocimientos especializados o equipos. La aplicación de la misma estrategia de descelularización en muestras de tejido de sujetos de edad diferentes es una alternativa para realizar estudios comparativos. El presente Protocolo permite la identificación de diferencias estructurales únicas en adulto y fetales cardiaca ECM malla y biológico respuestas celulares. Además, la presente metodología muestra una aplicación más amplia siendo aplicada con éxito en otros tejidos y especies con ajustes menores, como en las biopsias del intestino humanas y en pulmón de ratón.

La eficacia de la descelularización debe evaluarse a través de tres técnicas principales: observación macroscópica, la histología y la cuantificación de ADN. El aspecto macroscópico de las muestras post-SDS de trato afecta indirectamente la eficacia de la eliminación de la célula. Después de la incubación de la SDS, las muestras deben aparecer como transparente a blanquecino (figura 1). Fetal (E18) decellularized tejidos se caracterizan por una estructura alt...

La matriz extracelular cardiaca (ECM) es una compleja red de moléculas que orquestar procesos clave en los tejidos y órganos mientras aguantando remodelación fisiológica durante toda la vida. Descelularización estandarizado del corazón fetal y adulto permite estudios experimentales comparativos de ambos tejidos en un contexto 3D mediante la captura de arquitectura original y propiedades biomecánicas.

Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Este método puede ayudar a abordar preguntas importantes en el campo cardiovascular sobre el impacto que tiene la matriz extracelular durante las diferentes etapas fisiológicas y de desarrollo del corazón. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis comparativo entre matrices extracelulares fetales y adultas mediante la aplicación de un método de descelularización similar a ambos tipos de tejido. Así que este método se ha aplicado con éxito a otros órganos como resección quirúrgica de pacientes con cáncer facilitando el estudio de la matriz extracelular en diferentes contextos.Comience enjuagando brevemente los corazones de ratón fetal y adulto con PBS helado. A continuación, coloque los tejidos debajo de un microscopio de disección y use tijeras pequeñas rectas para eliminar las aurículas, el ventrículo derecho y el septo de los corazones adultos del ratón. Transfiera el ventrículo izquierdo a un nuevo plato de Petri y divida la pared libre del ventrículo izquierdo en tiras longitudinales de dos milímetros de espesor.El uso de explantes de ventrículo izquierdo de ratón adulto de un tamaño homogéneo es esencial para una eficiencia de descelularización consistente. Usa el bisturí y las pinzas serradas con punta curvada para eliminar el músculo papilar antes de usar una rejilla de dos por dos milímetros para picar aún más las tiras en fragmentos de tejido más pequeños. Cuando todo el tejido haya sido picado, enjuague brevemente las piezas con suficiente PBS para cubrir los explantes.Y transfiera los corazones fetales y los trozos de tejido cardíaco adulto a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan 250 microlitros de temperatura de corte óptima o compuesto OCT por tubo. Luego, congele las muestras de tejido cardíaco en isopentano enfriado con hielo seco para almacenarlas a 80 grados Celsius negativos. Para decelularizar los tejidos crio-conservados colocar las muestras congeladas en un plato de Petri que contiene suficiente PBS para cubrir completamente los explantes.Después de que el PTU se haya derretido, sumerja las muestras en un nuevo plato Petri de PBS y lave las muestras tres veces en una coctelera durante 10 a 15 minutos a 60 RPM por lavado. Después del último lavado, agregue un mililitro de tampón hipotónico de trabajo a cada pocólite de una placa de cultivo de tejido estéril de 24 pocillos y use fórceps finos para transferir un fragmento a cada pozo. Incubar la placa a 25 grados centígrados durante 18 horas, a 165 RPM seguidas de tres lavados de una hora en un mililitro de PBS por pozo, por lavado.Después del último lavado, agregue un mililitro de dodecil sulfato de sodio recién preparado o solución SDS a cada pozo para una incubación de 24 horas a 25 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague las muestras con tres lavados de 20 minutos en un mililitro de tampón de lavado hipotónico por lavado seguido de la adición de un mililitro de solución de tratamiento DNase a cada pozo para una incubación de tres horas, a 37 grados Centígrados. Al final de la incubación, las muestras decellularizadas deben perder su consistencia similar a la gelatina.A continuación, lave los fragmentos de tejido tres veces con un mililitro de PBS durante 20 minutos por lavado seguido de un lavado nocturno en un mililitro de PBS fresco por pozo a temperatura ambiente y 60 RPM. Para evaluar la eliminación de restos celulares del tejido descelularizado, a la mañana siguiente fijar las muestras en un mililitro de tampón neutro fórmula 10% recién preparado complementado con 0.03%de eosina acuosa por pozo para 2.5 a tres horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las muestras en un mililitro de PBS por pocero.Y utilice un molde de muestra de vinilo desechable para encapsular los fragmentos decellularizados en el gel de procesamiento histológico de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A continuación, transfiera los fragmentos encapsulados a un casete de incrustación de procesamiento de biopsia. Y procesar las muestras para la incrustación de parafina a través de sucesivas incubaciones de 30 minutos en concentraciones ascendentes de etanol, solución de hidrocarburo alifático isoparaffínico y dos 56 grados Celsius parafina emergens.Después del segundo emergente de parafina, monte las muestras en un bloque de parafina y use un microtoma para obtener secciones de tres micrómetros de espesor. A continuación, verifique la eficiencia de la descelularización manchando las secciones con hematoxilina y eosina y las manchas tricromáticas de Masson de acuerdo con los protocolos estándar. Después del lavado nocturno de PBS con agitación, añadir 500 microlitros de DPBS recién preparado, complementado con 2,5 microgramos por mililitro de anfotericina B 1% solución antibiótica a cada andamio.Y guarde las muestras de uno a siete días a cuatro grados centígrados. Antes de colocar las células, sustituya la solución DPBS por 500 microlitros de medio basal celular complementados con antibióticos. Y incubar los andamios durante una hora a 37 grados centígrados.Al final de la incubación, utilice un microscopio para agregar una gota de cuatro microlitros de DPBS al centro de un pozo de una placa de 96 pocillos por andamio. Y usa pinzas rectas delgadas para transferir un andamio decellularizado a la parte superior de cada gota. Retire cualquier DPBS adicional por aspiración y confirme que el andamio no está plegado o arrugado.Cuando los andamios se hayan secado en los bordes, sienta lentamente una suspensión de una sola célula de las células de interés en la parte superior de cada andamio. Los tejidos descelularizados del día 18 embrionarios se caracterizan por una estructura altamente translúcida, mientras que los explantes adultos exhiben un aspecto translúcido a blanco. Las manchas de hematoxilina y eosina y tricomas de Masson confirman una eliminación celular eficiente por la presencia de malla porosa.El material nuclear se reduce aproximadamente un 99,8% después de la descelularización, en comparación con los tejidos no manipulados, lo que es esencial para evitar desencadenar una respuesta inflamatoria no deseada tras la implantación. La viabilidad celular dentro de los andamios sentados se puede controlar durante el cultivo in vitro mediante tinción de calceína. El análisis terminal de la repoblación celular y la distribución a través de andamios, también se puede realizar después del procesamiento de parafina como se observa en estas imágenes representativas de una sección de biosaminosos centrales.Así que esta técnica allanó el camino para los investigadores en la exploración de las propiedades bioactivas de la matriz extracelular a partir de corazones de ratón fetales y adultos, pero también de otros tejidos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video muestra un método de producción de andamios de matriz extracelular descelularizada o ECM mediante la aplicación de perfusión anterógrada de detergentes a través de la vasculatura. Los andamios estructurales de la MEC se pueden utilizar para analizar la remodelación de la MEC asociada a la enfermedad cardiopulmonar.

Descelularización del complejo cardiopulmonar: una técnica para descelularizar el corazón y los pulmones a partir de un modelo murino

Un método para eliminar rápida y completamente los componentes celulares de un corazón porcino intacta a través de perfusión retrógrada se describe. Este método rinde un sitio específico cardíaco extracelular andamio matriz que tiene el potencial para su uso en diversas aplicaciones clínicas.

Procedimiento para descelularización de corazón porcino por perfusión coronaria retrógrada

En estos estudios, se entrega metodología para la novela, andamios cardiacos neonatales, murinos para su uso en estudios de regeneración.

Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos

Este protocolo describe la descelularización completa del miocardio humano conservando sus componentes de matriz extracelular. Tratamiento posterior de los resultados de la matriz extracelular en la producción de micropartículas y un hidrogel de uno mismo-montaje de citoprotectores.

Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

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Descelularización de todo humano corazón dentro de una bolsa presurizada en una orientación invertida

Este protocolo describe un método neto basado en el molde para crear los tejidos cardiacos libre de andamio tridimensionales satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza.

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

En este trabajo, se optimizó un protocolo de descelularización para obtener matrices descelularizadas del músculo esquelético fetal del ratón. Los mioblastos C2C12 pueden colonizar estas matrices, proliferar y diferenciarse. Este modelo in vitro se puede utilizar para estudiar el comportamiento celular en el contexto de enfermedades del músculo esquelético, como las distrofias musculares.

Preparación de matrices descelularizadas 3D a partir de músculo esquelético fetal de ratón para cultivo celular

Los fibroblastos aislados del corazón humano adulto se cultivaron para confluir en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. Después de la descelularización, este sustrato se puede utilizar para el cultivo y estudio de otras células cardíacas y las interacciones célula-matriz.

Producción de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para el Recubrimiento de Placas de Cultivo

Se presenta un método reproducible para generar tejidos miocárdicos en 3D combinando andamios de escritura por electrohilatura por fusión (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogeles de fibrina con cardiomiocitos y fibroblastos derivados de hiPSC. Esta técnica ofrece un control preciso sobre la arquitectura del andamio y se puede aplicar en pruebas preclínicas de medicamentos y modelado de enfermedades cardíacas.

Generación de tejido miocárdico humano en 3D mediante escritura por electrohilado de fusión de andamios de policaprolactona y células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprende a descelularizar corazones fetales y adultos de ratón para comparar propiedades de la matriz extracelular en 3D. Este método estandarizado facilita estudios de biología cardiovascular y regeneración tisular.

Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro

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