Reacciones de la cascada enzimática para la síntesis de aminoalcoholes quirales de L-lisina

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar y purificar aminoácidos quirales, que son compuestos con una amplia gama de aplicaciones, desde auxiliares quirales para síntesis orgánica hasta terapia farmacéutica. Este es un medidor de rendimiento total para obtener acceso al aminoalcohol quiral, derivado del aminoácido natural, lisina, en dos o tres pasos enzimáticos en un procedimiento de una sola parte. Las principales ventajas de este procedimiento es la simplicidad del protocolo y la eficiencia de los pasos de purificación.

Aurelie Fossey-Jouenne, la técnica de mi laboratorio, será la encargada de demostrar el procedimiento. Para sintetizar el derivado de lisina dihidroxilado, agregue tampón hepes, l-lisina, ácido glutárico alpaquita, ascorbato de sodio y más sal a un matraz erlenmyer de 250 ml. A continuación, añadir agua hasta un volumen final de 10 ml, teniendo en cuenta el volumen de la solución enzimática que se va a añadir.

Añadir la desoxigenasa KD-01 hasta una concentración final de 0,075 mg por ml. Agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente a 300 rpm durante el tiempo adecuado. Después de mezclar, transfiera 10 mcl de la mezcla de reacción a un tubo Ependorf de 1,5 ml.

A continuación, añada la solución de bicarbonato sódico de aquias, etanol y 2,5 mg por ml de solución de DNFB en etanol. Cierre el microtubo y agite la solución durante 1 hora a 1000 rpm y 65 grados centígrados. Cuando termine, use una mini centrífuga para asentar la solución.

Apague la mezcla de reacción con 10 mcl de ácido hidrocromático 1M. Agite la solución en vórtice y luego use una mini centrífuga para asentarla. Con una jeringa de señuelo de 1 ml, filtre la mezcla sobre un filtro de jeringa no estéril de 4 mm de diámetro, con una membrana de fluoruro de polivinilideno hidrófilo de 0,22 mcm de tamaño de vertido.

A continuación, coloque la muestra de mezcla de reacción derivada en un instrumento de HPLC. Inyecte 10 mcl en la columna C-18 mediante una detección UV, a 400 nanómetros para analizar el producto. Cuando el monitoreo de la reacción indique una reacción completada, agregue ácido glutárico alfaquita, ascorbato de sodio y más sal al matraz.

Añadir la desoxigenasa KD-02 hasta una concentración final de aporoximato de 0,5 mg por ml. Calculada a partir del volumen de reacción inicial. Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente a 300 rpm, durante 18 horas.

Cuando el monitoreo de reacción indique una reacción completa, agregue 100 mcl de DTT de 100 milimolares a la mezcla de reacción. Más 100mcl de PLP de 100 milimolares. Añadir descarboxilasa Dccpin purificada a una concentración final aproximada de 0,5 mg por ml.

Se calcula a partir del volumen de reacción inicial. Luego, agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente a 300 rpm durante 18 horas. Una vez completada la reacción, enfríe la mezcla colocando el matraz en un baño de hielo.

Agregue con cuidado 0,25 ml de HCL 6 molares y agite suavemente la mezcla de reacción en frío durante la adición. Ahora, transfiera la mezcla ácida a un tubo de centrífuga de fondo cónico de 50 ml, utilizando una pipeta de vidrio para pastos. Centrifugar la mezcla a 1.680 veces la gravedad y 4 grados centígrados durante 15 minutos.

Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un matraz de fondo redondo de 250 ml. A continuación, agregue 10 ml de agua desionizada al tubo de centrífuga que contiene el pellet. Vórtice para volver a suspender el pellet.

Después de centrifugar la muestra, transfiera el sobrenadante al matraz de fondo redondo, que contiene el primer sobrenadante. Congele los sobrenadantes recolectados, emergiendo del matraz en nitrógeno líquido con un remolino constante de la mano. Transfiera el matraz inmediatamente a un liofilizador de sobremesa para evitar que el material se descongele.

Una vez finalizado el proceso de liofilización, retire el matraz del liofilizador y lleve a cabo los pasos de purificación. Para la descarboxilación biocatalítica de L-lisinas mono-hidroxilo, el DC de S Rhumerentium, mostró actividad hacia todas las mono-hidroxilisinas. Donde la mejor conversión observada para los tres y cinco deriva de las hidroxi-diaminas quirales correspondientes.

Como se esperaba, Dccpin resultó ser el más adecuado para la descarboxilación de la 4R-hidroxi-L-lisina 2. En condiciones de reacción estándar, la conversión de 3S-hidroxi-L-lisina 1 en su contraparte descarboxilada 5, con DCcpin fue baja. Y no se observó actividad hacia la 5R-hidroxi-L-lisina.

Para la descarboxiilación biocatalítica de dehidroxi-L-lisinas, solo 3R, 4R, dihidroxi-L-lisina 3 se convirtió cuantitativamente en la dihidroxi-diamina 7 correspondiente en las condiciones de reacción estándar. La conversión de 45-dihidroxi-L-lisina 8 fue moderada, pero mejoró al aumentar la carga enzimática. Ninguno de los PLP-DC fue activo frente a la 35-dihidroxi-L-lisina 9.

Las reacciones enzimáticas en cascada que exhiben una conversión cuantitativa determinada por el monitoreo de HPLC, se ampliaron con éxito. Los aminoalcoholes se purificaron a partir de mezclas complejas de reacciones enzimáticas y excelentes yeilds, y se caracterizaron por RMN. Una vez dominada esta cascada enzimática, la síntesis y posterior purificación se puede realizar en 48 horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que una buena oxigenación de la reacción principal es esencial para las reacciones dioxigenadas. Así como un seguimiento cuidadoso, para asegurar que se consume toda la lisina antes de añadir la dicarboxidasa. El principal inconveniente de este protocolo son los limitados rangos subsidiados de la enzima dioxigenasa y descarboxilasa.

Sin embargo, la síntesis biochatalítica de varios aminoácidos alcohol, a partir de aminoácidos, se puede explorar mediante el uso de un conjunto diferente de enzimas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una reacción enzimática en cascada y cómo purificar aminoácidos a partir de mezclas de reacción complejas. No olvide que trabajar con DNFB puede ser peligroso y que se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal y la realización de la reacción en una campana extractora.