Un modelo de ratón preclínica de Osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre Tumor y las células madre mesenquimales

El objetivo general de este procedimiento experimental es desarrollar un modelo preclínico de ratón para estudiar el papel de la comunicación mediada por vesículas extracelulares entre células madre tumorales y mesenquimales. Este método puede ayudar a responder varias preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como cómo se comunican las células madre tumorales y mesenquimales por medio de vesículas extracelulares, y si esto apoya la progresión del cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que permite estudiar el papel de la adaptación de las células madre mesenquimales por las VE del cáncer, en la progresión y formación de metástasis in vivo.

La implicación de este procedimiento se extiende a nuestra terapia del cáncer, ya que podemos usar GSA para interferir con la comunicación EV y la señalización de andrógenos para inhibir la progresión del cáncer. Además de proporcionar información sobre la comunicación mediada por EV en el osteosarcoma, este método también se puede aplicar a muchos otros tipos de cáncer. De hecho, la médula ósea derivada de las células madre mesenquimales se recluta fácilmente en más sitios donde pueden diferenciarse en células de apoyo al cáncer.

Comience sembrando ocho matraces de 175 centímetros cuadrados con 3 millones de células 143B cada uno. Cultive las células utilizando medio agotado en EV durante 36 a 48 horas. Cuando las celdas estén confluentes en un 80 a 90%, recoja los sobrenadantes de los ocho matraces para el aislamiento de EV.

A continuación, utilice la centrifugación diferencial para eliminar todas las células y los restos celulares del sobrenadante. Consiste en centrifugaciones repetidas a cuatro grados centígrados, con máxima aceleración y desaceleración. Después de cada paso de centrifugación, recoja el sobrenadante y deje un mililitro del sobrenadante en el tubo de centrifugación.

Ahora, cargue un sobrenadante previamente aclarado en tubos de ultracentrífuga a 38,5 mililitros por tubo. A continuación, aislar los vehículos eléctricos utilizando una ultracentrífuga a 70.000 g durante una hora, con un descanso lento y a cuatro grados centígrados. Después de la ultracentrifugación, retire con cuidado el sobrenadante, dejando aproximadamente un mililitro.

A continuación, vuelva a suspender los gránulos que contienen EV en el volumen restante. Agrupar todas las suspensiones. Y lavar las suspensiones agrupadas con PBS.

Llene el tubo hasta 38,5 mililitros. Luego, repita el ciclo de ultracentrifugación, pero no use descanso. El rotor debería dejar de girar después de aproximadamente una hora.

A continuación, retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet y deje de 100 a 200 microlitros de solución. Por último, vuelva a suspender el pellet EV y ajuste el volumen final a 200 microlitros con PBS. A continuación, las VE pueden caracterizarse mediante TEM, marcarse con colorantes para experimentos de absorción o utilizarse para educar a las células madre mesenquimales para experimentos in vivo.

Es crucial que las MSC primarias tengan la densidad celular adecuada antes de la exposición a las EV cancerosas. La célula debe tener alrededor del 70% de confluente para lograr una relación óptima de EV de la celda y también para prevenir el crecimiento excesivo durante los períodos de educación. Este experimento utiliza ratones adultos Athymic Nude-Foxn1nu aclimatados.

Un día antes del procedimiento quirúrgico, proporcione paracetamol a través del agua potable. El día de la cirugía, prepare células 143B a 200.000 por microlitro en PBS. 20 minutos antes de la cirugía, suministre buprenorfina al animal.

Justo antes de la anestesia, cargue una jeringa de 10 microlitros con las pilas 143B concentradas. Después de confirmar la anestesia adecuada y aplicar ungüento para los ojos, coloque al animal boca arriba con las patas traseras hacia el operador. A continuación, asegure una máscara de anestesia al animal.

A continuación, flexionar la rodilla izquierda y limpiar la piel con tres exfoliantes alternos de etanol al 70% y povidona yodada, y luego aplicar lidocaína al 2% como analgésico local. Ahora, haz una pequeña incisión en la piel justo debajo de la rodilla para exponer la tibia. Luego, usando un taladro microtwister de 0.8 milímetros, haga un agujero en la tibia, aproximadamente 2 milímetros por debajo de la rodilla.

Evite perforar ambas cortezas tibiales. Proceda inyectando lentamente un microlitro de células en el orificio durante unos cinco segundos. Luego, cierre el orificio con una gota de pegamento para tejidos para evitar el reflujo de la suspensión.

Complete la cirugía cerrando la piel con suturas y una gota de pegamento para tejidos. Dejar que el animal se recupere con calentamiento, y tratarlo con paracetamol durante 24 horas. Dos días después, use una jeringa de insulina de 0,5 milímetros para inyectar las MSC en la vena de la cola.

La administración correcta durante una inyección en la vena de la cola puede confirmarse visualmente. Si aparece un área blanca, o si encuentra resistencia, vuelva a inyectar en un área por encima del sitio de inyección anterior. Luego, dos veces por semana, siga el crecimiento del tumor utilizando bioluminiscencia.

Inyecte a los ratones D-luciferina a través de una jeringa de insulina y, 10 minutos después, mida el flujo de fotones generado por las células tumorales mediante un sistema de imágenes. Cuando el diámetro del tumor de un animal supera los 15 milímetros, o su pérdida de peso supera el 15%, se practica la eutanasia al animal y se recogen todos los tejidos pertinentes. 10 minutos antes de la eutanasia, inyecte D-luciferina, como se hizo antes de la toma de imágenes.

Después de la eutanasia, recoja los pulmones, el hígado, el bazo y los riñones, utilizando tijeras y pinzas esterilizadas. Lave la sangre de los órganos con PBS y colóquelos en una placa de Petri para obtener imágenes. Usando un sistema de imágenes de bioluminiscencia, documente ambos lados de los órganos.

Una vez que se toman las imágenes, fije inmediatamente los órganos para su posterior análisis histológico. Para procesar los documentos fotográficos, simplemente aplique el umbral manual y cuente el número de nódulos en cada foto. Asegúrese de usar el mismo umbral para cada foto y de documentar los tejidos desde todas las direcciones, especialmente los pulmones.

Después de descalcificar la tibia del ratón, proceda con la deshidratación y la inclusión en parafina. Luego, use un micrótomo para preparar secciones de parafina de seis micras y recoja las secciones en portaobjetos de vidrio. Una vez que los portaobjetos se hayan secado, guárdelos durante la noche a temperatura ambiente.

Al día siguiente, realice una recuperación de antígeno mediada por calor, utilizando tampón de citrato. A continuación, tiñe los tejidos con un anticuerpo anti-GFP de uno a 900 y sigue con una contratinción DAPI. Por último, documente las secciones de tejido teñidas mediante microscopía de fluorescencia.

La pureza de los VE aislados se confirmó mediante microscopía electrónica. Las preparaciones contenían vesículas de entre 40 y 100 nanómetros de diámetro. Para evaluar si las VE cancerosas interactúan con las MSC, las VE se marcaron con un tinte enlazador lipofílico fluorescente verde y se incubaron durante la noche con MSC.

De este modo, se confirmó la adopción eficiente de los vehículos eléctricos por parte de los MSC. Se confirmó una propiedad inmunomoduladora de las EV en las MSC mediante un inmunoensayo de citocinas múltiple basado en B. Las EV tumorales causaron un aumento en la producción de IL-8 e IL-6 en las MSC, en comparación con las EV de control de fibroblastos humanos.

A continuación, en un modelo de ratón de osteosarcoma con xenoinjerto ortotópico, se demostró que los ratones tratados con MSC educadas con EV tenían un crecimiento tumoral acelerado. Cuatro días después de la inyección sistémica de MSC que expresan GFP, se detectaron células que expresan GFP en la médula ósea y en el tejido tumoral, lo que demuestra que las MSC se dirigen al sitio del tumor. Las imágenes ex vivo de varios órganos destacaron la formación de nódulos pulmonares.

En última instancia, los ratones que recibieron MSC educadas con EV tuvieron más metástasis pulmonares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo educar células estromales con VE de cáncer ex vivo, y estudiar los efectos de las células estromales educadas in vivo utilizando modelos preclínicos de ratón. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en cuatro semanas, siempre que se disponga de suficientes VE contra el cáncer.

Al intentar este procedimiento, es importante planificar con anticipación y obtener una purificación reproducible de las vesículas extracelulares del cáncer, así como utilizar células madre mesenquimales de baja proliferación de paso.