Name: Un modelo de ratón preclínica de Osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre Tumor y las células madre mesenquimales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo preclínico en ratón para estudiar la comunicación mediada por vesículas extracelulares entre tumores y células madre mesenquimales. Este método permite analizar la progresión tumoral y la formación de metástasis in vivo.

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S.R. Baglio fue apoyado por una beca por la Associazione Italiana por la Ricerca sul Cancro (AIRC) cofinanciado por la Unión Europea. Además, este proyecto ha recibido no financiación del programa de investigación e innovación de horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Convenio de subvención de Marie Sklodowska-Curie 660200 (a S.R. Baglio).

Tejidos adiposos humanos para aislamiento de células madre mesenquimales fueron obtenidos del Departamento de cirugía plástica del Hospital de Tergooi (Hilversum, Holanda) después de la aprobación por el Comité institucional de ética y consentimiento informado por escrito. MSCs adiposos GFP-positivas fueron obtenidos del Departamento de medicina y Ciencias quirúrgicas para niños y adultos (Universidad de Modena y Reggio Emilia).
Los experimentos con animales se realizaron conforme a la Ley holandesa sobre experimentación animal, y el protocolo fue aprobado por la Comisión de experimentación animal del centro médico universitario VU, Ámsterdam, Países Bajos.
1. aislamiento de las vesículas extracelulares secretadas por el Tumor.
<ol><li>Preparar EV-agotado fetales de bovino suero (FBS) por centrifugación FBS a 70.000 x g durante la noche (16 horas), sin freno, a 4 ° C utilizando un rotor cubo ultra que hace pivotar (esperar 1 h para la desaceleración). Recoger cuidadosamente el sobrenadante (EV-agotado FBS) sin perturbar el pellet. Filtro de la FBS EV-agotado con un filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Preparar medio de cultivo EV-agotado por suplir medio (IMDM modificado Dulbecco de Iscove) con 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100, glutamina 2 mM (1 x P/S/G) y 5% FBS EV-agotado.</li>
	<li>3 x 106 143B células en2 frascos de 175 cm de la semilla y de la cultura en EV-agotado el medio de cultivo en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Cuando las células confluentes de 80-90% (normalmente después de 36 h a 48 h), recoger el sobrenadante de 8 x 175 cm2 frascos (28 mL/frasco) para el aislamiento de EV.</li>
	<li>Pre-eliminar el sobrenadante de células para eliminar las células y restos celulares por centrifugación diferencial (centrifugación el sobrenadante de la vuelta anterior cada vez) según el siguiente protocolo:<ol>
<li>Centrifugar el sobrenadante dos veces a 500 x g por 10 min.</li>
		<li>Centrifugar el sobrenadante dos veces a 2000 x g durante 15 minutos.</li>
		<li>Centrifugar el sobrenadante dos veces a 10.000 x g por 30 min.</li>
		<li>Realizar todos los centrifugados a 4 ° C con máxima aceleración y desaceleración velocidad ajustes. Después de cada paso, recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene el EV, dejando alrededor de 1 mL. Proceder inmediatamente al paso 1.5 o tienda previamente despejado acondicionado medio a-80 ° C hasta aislamiento de EV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislar EVs por centrifugación el medio condicionado previamente despejado una vez a 70.000 x g durante 1 h, lento freno, a 4 ° C en tubos de centrífuga de ultra (volumen final 38.5 mL/tubo) usando un rotor de cubo ultra que hace pivotar.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante, dejando alrededor de 1 mL detrás, resuspender los pellets que contiene EV en el volumen restante, piscina todo en un tubo de ultracentrífuga y agregar solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta tubo completa (volumen final mL 38,5).</li>
	<li>Centrifugar nuevamente a 70.000 x g durante 1 h a 4 ° C, sin freno (esperar 1 h para la desaceleración). Cuidadosamente Quite el sobrenadante sin perturbar el sedimento y dejar 100-200 μl.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de EV y ajustar el volumen final a 200 μL con PBS (estandarizado para todo EV-aislamientos). Utilice la preparación EV inmediatamente o almacenar a-80 ° C hasta uso22. Nota: EVs puede ser almacenado 6 meses a-80 ° C.</li>
</ol>2. EV caracterización.
EVs purificadas pueden visualizarse por microscopía electrónica (TEM) de transmisión23.
<ol><li>Prepara mezcla EV con un volumen igual de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato.</li>
	<li>Capa 200 malla rejillas de níquel TEM Formvar recubiertas de carbón con 5 μl de la suspensión de la EV por 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para fijar las muestras EV en rejillas TEM con glutaraldehído al 1% en tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7.0), contraste con oxalato de uranilo (pH 7.0) e integrar en una mezcla de 4% uranilo acetato y 2% metil celulosa en una proporción de 1:9 en el hielo.</li>
	<li>Quitar las rejillas con aros de acero inoxidable y secar el exceso de líquido con papel de filtro para garantizar un adecuado espesor de la película de celulosa de metilo.</li>
	<li>Después del secado, examinar las rejillas con un microscopio electrónico de transmisión y captura imágenes con una cámara digital juntada con el correspondiente software de imagen.</li>
</ol>3. Educación de MSCs por tumor derivado de la EVs.
<ol><li>Preparar medio de cultivo MSC por suplir medio esencial mínimo de alfa (alfa-MEM) con 4% EV-agotado humano lisado plaquetario (hPL)24, heparina (10 U/mL) y 1 x P/S/G. Nota: EV-agotado hPL se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en el punto 1.1.</li>
	<li>Semillas 1.4 x 106 origen adiposo MSCs cada frasco de 75 cm2 y cultura EV-agotado MSC-medio de cultivo en un incubador a 37 ° C y 5% de CO2.</li>
	<li>Cuando las células alcanzan confluencia de 70%, añadir 143B osteosarcoma - o control de fibroblastos humanos (hf)-EVs, 10 μl EV preparación/cm2 del frasco de cultivo. Incubar durante 24 horas y agregar la misma cantidad de EVs para 6 horas adicionales. Nota: Fibroblastos humanos se cultivan en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) 10% FBS y EVs están aislado como se describe en la sección 1.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante MSC, Centrifugue 1 x a 500 x g durante 5 min a 4 ° C (con máxima aceleración y ajustes de la velocidad de desaceleración), transferir a un tubo nuevo y guarde el sobrenadante despejado a-80 ° C para permitir el análisis del futuro del cytokine (sección 5).</li>
	<li>In vivo experimentos (sección 6), educar GFP-positivas MSCs25 descrito en las secciones 3.1 a 3.3, recoger las células y les vuelva a suspender en PBS a una concentración final de 106 células por 100 μl. mantener las células en hielo hasta la inyección.</li>
</ol>4. EV internalización ensayo.
Para visualizar la absorción EV por MSCs, EVs con un tinte verde fluorescente vinculador (GFLD) (comercialmente disponible) siguiendo el protocolo del fabricante de la etiqueta:
<ol><li>Brevemente, añadir 180 μl de diluyente a la preparación de EV de 200 μl. Diluya 1 μl de colorante GFLD en 50 μl de diluyente y añadir 20 μl de colorante diluido a la preparación EV diluida.</li>
	<li>Suavemente mezclar mediante pipeteo e incubar 3 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Añadir 5 mL de 0.1% de BSA en PBS, transferencia a tubos de centrífuga de ultra y llenar el tubo con PBS (volumen final 38.5 mL/tubo).</li>
	<li>Centrifugar 1 x 70.000 x g durante 1 h a 4 ° C, sin freno (esperar 1 h para la desaceleración). Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de EV etiquetado en un volumen final de 200 μl (ajustar volumen con PBS).</li>
	<li>Añadir el etiqueta EVs a la cultura MSC o almacenar a-80 ° C. Después de la incubación durante la noche, evaluar la interiorización de la vesícula por microscopía de fluorescencia y flujo cytometry7.</li>
</ol>5. evaluación del perfil de expresión de citoquinas MSC.
<ol><li>Para la cuantificación múltiplex de Interleucina-8 (IL-8), interleucina-1β (IL-1β), interleucina 6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), factor de necrosis tumoral (TNF) y los niveles de la proteína interleucina - 12p 70 (IL - 12p 70) en el MSC acondicionado medio (ver paso 3.4), utilizar un matriz de grano cytometric comercialmente disponibles (CBA) de las citoquinas inflamatorias humanas siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Brevemente, el conjugado de anticuerpo de captura los granos de la mezcla y añadir a todos los tubos de ensayo. Añadir las diluciones estándar de citocinas o las muestras de medio condicionadas a los tubos.</li>
	<li>Añadir el reactivo de detección e incubar 3 horas a TA.</li>
	<li>Lavar los granos con la solución de lavado suministrado. Medir las muestras usando un citómetro de flujo y analizar los datos según las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>6. generación de un modelo de ratón de Orthotopic xenoinjerto de Osteosarcoma.
<ol><li>Permiten ratones Athymic Nude-Foxn1nu seis semanas de edad, mujer, para aclimatarse al menos una semana antes de iniciar los procedimientos experimentales.</li>
	<li>Un día antes del procedimiento quirúrgico y como analgesia perioperatoria añadir paracetamol para el agua potable. "Solución de paracetamol para niños" diluido (véase Tabla de materiales) con agua para obtener una concentración final de 2 mg/mL. Basado en un consumo promedio de agua de 150 mL/kg/día, y un peso promedio de 20 g, esta dosis es suficiente para llegar a una dosis de 6 mg/ratón/día (300 mg/kg/día).</li>
	<li>Continuar tratamiento analgésico hasta 24 horas después de la operación, o más si los animales muestran signos de dolor.</li>
	<li>En el día de la intervención quirúrgica, recoger luciferase-positivo (Fluc) 143B las células cultivadas (previamente generadas por transducción lentivirales) por centrifugación a 300 x g durante 10 min y resuspender las células a una concentración de 2 x 105 células/μl de PBS. Mantener la suspensión de células en hielo 6 horas.</li>
	<li>Equipo quirúrgico de la autoclave. Preparar y limpiar la zona de trabajo y las tijeras estériles y pinza en hojas estériles. 20 min antes del procedimiento quirúrgico (paso 6.8), se inyectan los animales por vía subcutánea con buprenorfina (0,05 mg/kg, diluido en solución salina al 0.9%) como analgésico usando jeringas de insulina 0,5 mL (aguja de calibre 29).</li>
	<li>Justo antes de anestesiar cada animal, llene una jeringa de 10 μl con al menos 1 μl de la suspensión concentrada de células (Fluc) 143B (ver paso 6.4).</li>
	<li>Anestesiar el animal con la anestesia de inhalación isoflurano (2-3% de oxígeno). Compruebe el nivel de anestesia del dedo del pie-pellizcando el animal. Cuando el animal no reacciona a pellizcos, es decir, que es profundamente anestesiado, aplicar ungüento en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.</li>
	<li>Colocar el animal sobre su espalda con la cabeza en una máscara de la anestesia y con las piernas hacia el operador. Flexión de la rodilla izquierda. Limpie la piel con etanol al 70% y aplicar lidocaína (2%) con una punta de algodón 3 veces como analgésico local.</li>
	<li>Use un cuchillo quirúrgico estéril para hacer una pequeña incisión (de aproximadamente 5 mm) en la piel justo debajo de la rodilla para exponer la tibia. Perfore un agujero de alfiler en la tibia, aproximadamente 2 mm por debajo de la rodilla usando un taladro de torcedura micro 0,8 mm. Tener cuidado no a perforar ambas corticales de tibia.</li>
	<li>Inyectar la suspensión de células de 1 μl (aproximadamente 2 x 105 células) lentamente (en aproximadamente 5 segundos) en el agujero con una aguja de calibre 26. Cerrar el orificio con una gota de pegamento de tejido para evitar el contraflujo de la suspensión.</li>
	<li>Cierre la piel con suturas monofilamento y una gota de pegamento de tejido. Deje que el animal se recupera en un ambiente bien climatizado (uso de una lámpara de calor). No descuide los animales hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Sólo después de que los animales se recuperan totalmente de la anestesia, devolverlos a sus jaulas.</li>
	<li>Dos días después de la inoculación del tumor, inyectar EV educado o ingenuo GFP-positivas MSCs (106 células en 100 μl de PBS, vea paso 3.5) por vía intravenosa con una jeringa de insulina de 0,5 mL en la vena de la cola de los ratones.</li>
	<li>Seguir el crecimiento del tumor por bioluminiscencia imagen26 dos veces a la semana. Para ello, inyectar el i.p. de ratones con 150 μL de D-luciferin (30 mg/mL) con una jeringa de insulina. Diez minutos después de la inyección, la posición de los animales en la bioluminiscencia sistema de imagen y medir el flujo de fotones generado por las células tumorales.</li>
	<li>Además, mida el diámetro del tumor de hueso primario con una pinza. Calcula el volumen del tumor (en mm3) ancho x largo2 x 0.5.</li>
	<li>Nota: Criterios de valoración humanas se definición como diámetro tumoral > pérdida de 15 mm o peso > 15%.</li>
</ol>7. evaluación del número de nódulo pulmonar
<ol><li>Cuando uno de los animales alcanza el extremo humano definido en el paso 6.14 (en aproximadamente 3-4 semanas), terminar el experimento y recoger y analizar todos los tejidos correspondientes.</li>
	<li>Diez minutos antes euthanization, inyectar 150 μL D-luciferin (30 mg/mL) con una jeringa de insulina de 0,5 mL.</li>
	<li>Anestesiar los animales con la anestesia de inhalación isoflurano (ver paso 6.7). La profundidad de la anestesia para confirmar la ausencia de reacciones del ratón a pellizcos del dedo del pie. Eutanasia a los ratones por dislocación cervical27.</li>
	<li>Recoger los pulmones, hígado, bazo y riñones con pinzas y tijeras estériles. Lave los órganos en el PBS para eliminar restos de sangre y ponerlos en una placa Petri.</li>
	<li>Coloque el plato Petri con los órganos en la bioluminiscencia sistema de imagen. Medir la señal de la bioluminiscencia en ambos lados de los órganos. Inmediatamente después de medir, sumergen a los órganos en formol al 4% para los fijar (24-72 horas, a temperatura ambiente) para futuro análisis histológico.</li>
	<li>Procesar las imágenes obtenidas con software de imagen apropiado por umbralización manual. Contar el número de nódulos pulmonares en cada fotografía. Contar el número total de nódulos pulmonares en ambos lados de los pulmones.</li>
</ol>8. histológico análisis
<ol><li>Para el análisis histológico de los tejidos pulmonares:<ol>
<li>Integrar los órganos fijados con formol en parafina y preparar los portaobjetos de tejido de 6 μm.</li>
		<li>Deparaffinate el tejido pulmonar las diapositivas y realizar recuperación de antígeno hirviéndolos durante 15 minutos en tampón de citrato de 0.01 M (pH 6).</li>
		<li>Incube los portaobjetos horizontal a temperatura ambiente con anti-humanos vimentina anticuerpo (200 μg/mL) diluido 1: 150 en anticuerpo-diluyente (disponible comercialmente) y posteriormente con el anticuerpo secundario, marcado con HRP (0.5 mg/mL, dilución 1: 500). Manchar los tejidos con 3'-diaminobenzidina (DAB) y tinción de hematoxilina contador.</li>
		<li>Observe los portaobjetos de tejido manchado usando un microscopio óptico acoplado a la cámara correspondiente y el software de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evaluar la presencia de GFP-positivas MSCs en tibias de ratón:<ol>
<li>Descalcifique la tibia en ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 0,24 M, pH 7.2-7.4. Actualizar tampón EDTA cada otro día hasta que los huesos se convierten en flexibles (aproximadamente 1 semana).</li>
		<li>Deshidratarse osificados e infiltrarse con parafina. Incrustar las tibias (incluyendo tejido de osteosarcoma) en bloques de parafina.</li>
		<li>Utilizar un micrótomo para preparar secciones de parafina de 6 μm. Coloque las secciones de parafina en portaobjetos de vidrio. Después de secar, almacenar diapositivas durante la noche a temperatura ambiente.</li>
		<li>Realizar recuperación de antígeno mediada por calor con tampón citrato (ver 8.1.2) y teñir los tejidos con el anticuerpo anti-GFP (antisuero entero) en una dilución de 1:900 en diluyente de anticuerpos. Contratinción los tejidos con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>Observe los portaobjetos de tejido con un microscopio de fluorescencia juntado al software de proyección de imagen correspondiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Vesículas extracelulares secretadas por el tumor (EVs) pueden alterar la fisiología de las células mesenquimales locales y distantes para generar un ambiente propicio para el tumor. Aquí se describe la generación de un modelo de ratón preclínica de osteosarcoma que permite la disección de las interacciones mediadas por EV entre células tumorales y células madre mesenquimal (MSCs) en vivo. Nos muestran que la inyección sistémica de tumor humano educado EV MSCs en ratones fuertemente xenoinjertos de osteosarcoma p...

El microambiente tumoral participa activamente en la mayoría, si no todos, los aspectos de la progresión de la tumorigénesis y cáncer, incluyendo la formación de metástasis y el desarrollo de la resistencia a la terapéutica1. Esto subraya la necesidad de modelos de ratón de cáncer preclínico orthotopic que permite la disección de las interacciones del tumor-estroma complejo que ocurre en el lugar del tumor.
Entre los muchos componentes celulares del microambiente tumoral, las células madre mesenquimales (MSCs) fuertemente contribuir a la progresión del cáncer en varios tipos de cáncer como el cáncer de mama, cáncer de próstata, tumores cerebrales, mieloma múltiple y osteosarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs son células multipotentes que residen en varios tejidos adultos y fetales, incluyendo médula ósea, tejido adiposo, placenta, cordón umbilical y otros8,9. En respuesta a señales inflamatorias generadas por cáncer, MSCs migran hacia sitios de tumor, incorporan en el microambiente del tumor y finalmente se diferencian en células de apoyo de cáncer10. Estas MSCs asociada con el cáncer proporcionan factores esenciales (es decir, factores de crecimiento, quimiocinas, citoquinas y mediadores inmunosupresores) para la progresión del tumor actuando sobre las células tumorales y el estroma circundante2, 3 , 11 , 12 , 13. mientras el tumor-promover efectos de MSCs asociada con el cáncer han sido investigados en numerosos modelos de cáncer, son poco conocidos los mecanismos por los cuales las células del tumor reprogramar MSCs para dar forma a un nicho de promoción de cáncer. Aquí describimos la generación de un modelo de xenoinjerto de orthotopic que permite específicamente el estudio de la interacción pro-tumorigenic entre las células de cáncer de hueso y MSCs mediante vesículas extracelulares (EVs).
EVs son mediadores cruciales de la comunicación intercelular entre el tumor y las células stromal14. EVs llevar biomoléculas funcionales de la célula de origen, incluyendo proteínas, lípidos y RNAs reguladoras. Una vez liberado en el espacio extracelular, estas vesículas pueden ser tomadas por las células circundantes o llevaron a sitios distantes por medio de la sangre o la circulación linfática y profundamente pueden influir el comportamiento de la célula blanco. 15 , 16 , 17 por ejemplo, absorción de cáncer EVs por fibroblastos del estromales puede resultar en miofibroblastos diferenciación apoyo angiogénesis y acelerar el tumor crecimiento en vivo18,19, internalización por endotelial las células pueden estimular la angiogénesis tumoral y aumentar la permeabilidad vascular16,20, y la interacción con las células inmunes podría conducir a la supresión de la respuesta inmune antitumoral21.
Recientemente demostramos, usando un modelo de ratón de xenoinjerto bioluminiscente orthotopic del osteosarcoma, que las células tumorales liberan gran cantidad de EVs que MSCs para adquirir un fenotipo pro-tumorigenic y pro-metastásico. Este efecto es debido a un cambio drástico en el perfil de expresión de citoquinas MSC (denominado "Educación MSC") y puede prevenirse mediante la administración de un anticuerpo de terapéutica del receptor de la interleucina 6 (IL-6R)7. Nuestro trabajo demostró que el cáncer EVs son moduladores cruciales del comportamiento MSC, así proporcionando un análisis razonado para enfoques dirigidos a microambiente detener la progresión de osteosarcoma. Adjunto, describimos un protocolo paso a paso para investigar la MSC de tumor EV-mediada interacción en vivo. Este modelo se pretende: 1) específicamente definir las alteraciones de cáncer EV-inducido del comportamiento MSC en el microambiente tumoral, 2) evaluar cómo esta interacción contribuye a crecimiento de tumor de hueso y formación de metástasis y 3) estudio si interferir con la interferencia mediada por EV en vivo previene la progresión del cáncer.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Centrifugadora</td><td>Beckman</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW32Ti</td><td>Beckman</td><td>369650</td><td>Referido en el manuscrito como rotor de cangilón ultra-oscilante</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Zeiss</td><td>EM109</td><td>O similar TEM</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Nikon</td><td>DMX 1200F</td><td>O una cámara similar</td></tr><tr><td>Software de imagen TEM&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>ACT-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D2</td><td>O similar Microscopio de fluorescencia</td></tr><tr><td>Software de imagen FM</td><td>Zeiss</td><td>ZEN Blue</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Nuaire</td><td>4750E</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hettick</td><td>ROTANTA 460R-80</td><td></td></tr> <tr><td>Freezer</td><td>Thermo electro corporation</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td>BD FACScalibur</td><td>O citómetro de flujo similar</td></tr><tr><td>Taladro</td><td>Ferm</td><td>FCT-300</td><td>Con taladro de 0,8 mm</td></tr><tr><td>HSS micro brocas helicoidales, 0,8 mm</td><td>Proxxon</td><td>28 852</td><td>Taladro de 0,8 mm</td></tr><tr><td>Cámara IVIS</td><td>Xenogen</td><td>Ivis Lumina</td><td>Referida en el manuscrito como cámara de bioluminiscencia. Xenogen ahora es parte de Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Living image software2.60</td><td>Xenogen / Igor Por</td><td>n.a</td><td>Xenogen ahora es parte de Perkin Elmer</td></tr><tr><td>10 &micro; L Jeringa</td><td>Hamilton</td><td>Neuros Modelo 1701 Aguja RN</td><td></td></tr><tr><td>: Hamilton RN Aguja para Jeringa, Calibre 26, Pointstyle AS, longitud personalizada 2 cm</td><td>Hamilton</td><td>n.a.Calibrador</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Mitutoyo</td><td>G08004463</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Astell</td><td>n.a.Lámpara</td><td></td></tr> <tr>de <td>calor</td><td>Philips</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Medios de cultivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Hypclona</td><td>RYG35912</td><td></td></tr><tr><td>Lisado de plaquetas</td><td>n.a.n.a.IMDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>medio Lonza</td><td>BE12-722F</td><td></td></tr><tr><td>medio alfa-MEM</td><td>Lonza</td><td>BE02-002F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>pluma/estreptococo/glutamina</td><td>GIBCO</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>heparina</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (10x)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td><Células >fuertes</></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>adiposo fuertes. MSCs deriverd</td><td>n.a.n.a.MSCs</td> <td>GFP-positivas</td><td></td></tr><tr><td></td> n.a.n.a.fibroblastos <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>humanos</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td></td></tr><tr><td>Células 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Células FLUC-143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>Matraces de cultivo transducidos</td></tr><tr><td><fuertes>desechables</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>175 cm2</td><td>CELLSTAR</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos</td> de congelación <td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>Thermoscientific</td><td>377224</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos ultra-transparentes</td><td>Beckman 344058</td><td></td><td>Referidos en el manuscrito como tubos ultra-centrífugos</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m filtro</td><td>Millex</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>200 malla Rejillas de níquel recubiertas de carbono</td><td>EMS (Ciencias de la Microscopía Electrónica)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de insulina de 0,5 mL con aguja 29G</td><td>Terumo</td><td>U-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P7612</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro&nbsp;</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>50363215</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos / kits</</td>paraformaldehído fuerte Alfa Aeser 43368.9M PBS Braun 220/12257974/110 glutaraldehído EMS (Ciencias de la Microscopía Electrónica)16300 oxalato >de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> uranilo EMS (Microscopía Electrónica <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Ciencias)</td><td>22510</td><td></td></tr><tr><td>acetato de urania</td><td>EMS (Ciencias de Microscopía Electrónica)</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>metilcelulosa</td><td>EMS (Ciencias de Microscopía Electrónica)</td><td>1560</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>mini67-1kt</td><td>Referido en el manuscrito como GFLD</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CBA - kit de citocinas inflamatorias humanas</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído 37%</td><td>VWR</td><td>104003100</td><td></td></tr><tr><td>Acero al carbono Cuchillas quirúrgicas</td><td>Swann-Morton</td><td>206</td><td>Referido en el manuscrito como bisturí quirúrgico</td></tr><tr><td>anti-humano anti-humano vimentina anticuerpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>Clon V9</td></tr><tr><td>Diluyente de anticuerpos</td><td>DAKO</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Marcado con HRP anti ratón Anticuerpo IgG Life</td><td>Technologies</td><td>32230</td><td></td></tr><tr><td>DAB-kit</td><td>DAKO</td><td>K500711</td><td></td></tr><tr><td>hematoxilina</td><td>Sigma</td><td>GHS232</td><td></td></tr><tr><td>tampón EDTA</td><td>n.a.n.a.tampón</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>citrato</td><td>n.a.n.a.anticuerpo</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>policlonal anti-GFP</td><td>de conejo Abcam</td><td>n.a.Ab290</td><td></td></tr> <tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paracetamol, jarabe de 120 mg / 5 ml</td><td>Bayer</td><td>n.a.Sinaspril</td><td>, solución de paracetamol para niños</td></tr><tr><td>Isoflurano 1000 mg/g</td><td>Farmacia Vumc</td><td>n.a.Clorhidrato</td><td></td> de</tr> <tr><td>buprenofina, 0,3 mg/ml</td><td>Indivior UK Limited</td> n.a.lidocaína-HCL <td></td><td></td></tr><tr><td>2%</td><td>Farmacia Vumc</td><td>n.a.70</td><td></td></tr><tr><td>% etanol</td><td>VWR</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento para tejidos</td><td>Derma+Flex, cianoacrilato médico formulado</td><td>Vygon</td><td></td></tr><tr><td>LB604060 Colirios: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml</td><td>Bausch+Lomb</td><td>n.a.D-luciferina</td><td></td></tr><tr><td>, sal de potasio</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Thermo scientific</td><td>630-0954</td><td></td></tr><tr><td>Bucles de acero inoxidable&nbsp;</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td></td></tr><tr><td><Experimentos >Ratones ></td><td></td><td></td><td></td>fuertes</Ratones fuertes</tr><tr><td>, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,&nbsp; hembra, 6 semanas a la llegada, estado bacteriano conforme FELASA</td><td>ENVIGO</td><td>n.a.Pulpa</td><td></td></tr> <tr><td>de papel hogar inteligente (enriquecimiento de jaulas)</td><td>Bio Services</td><td>n.a.Material</td><td></td></tr> <tr><td>de cama Alpha-dri</td><td>Shepperd Speciality Papers</td><td>n.a. </td><td></td></tr><tr><td>Alimento para ratones: Teklad global 18% protein roedent diet</td><td>ENVIGO</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Ethicon</td><td>V926H</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>(o similar)</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>(o similar)</td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón preclínica de osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre tumor y las células madre mesenquimales

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

En el microambiente tumoral, residentes o a las células madre mesenquimales (MSCs) contribuyen a la progresión maligna en varios tipos de cáncer. Bajo la influencia de señales ambientales específicas, estas células madre adultas pueden liberar mediadores paracrinos conduce a crecimiento acelerado del tumor y metástasis. Definición de la diafonía entre tumor y MSCs es de vital importancia para entender los mecanismos subyacentes a la progresión del cáncer y para identificar nuevas dianas para la intervención terapéutica.
Las células cancerosas producen altas cantidades de vesículas extracelulares (EVs), que pueden afectar profundamente el comportamiento de las células Diana en el microambiente del tumor o en sitios distantes. Tumor EVs incluyen biomoléculas funcionales, incluyendo inflamatorios RNAs y proteínas (onco), que pueden educar a células estromales para mejorar el comportamiento metastático de las células cancerosas o para participar en la formación de nichos previamente metastásico. En este artículo, describimos el desarrollo de un modelo de ratón de cáncer preclínico que permite la evaluación específica de la diafonía EV-mediada entre el tumor y las células madre mesenquimales. En primer lugar, describimos la purificación y caracterización de EVs secretada por el tumor y la evaluación de la internalización de EV por MSCs. Entonces hacemos uso de un inmunoensayo multiplex basados en grano para evaluar la alteración del perfil de expresión de citoquinas MSC inducida por cáncer EVs. Por último, ilustramos la generación de un modelo de ratón de xenoinjerto de orthotopic bioluminiscente de osteosarcoma que recapitula la interacción tumor-MSC y mostrar la contribución de la educación EV MSCs a formación crecimiento y metástasis del tumor.
Nuestro modelo ofrece la oportunidad de definir cómo cáncer EVs forma un entorno de apoyo al tumor y para evaluar si el bloqueo de la comunicación mediada por EV entre tumor y MSCs previene la progresión del cáncer.

En este estudio, se analizó la capacidad de osteosarcoma secretada EVs para educar MSCs hacia un fenotipo pro-tumorigenic y pro-metastásico. Demostramos que las células de osteosarcoma liberan exosomas como EVs que se internalizan por MSCs. Mide la alteración del perfil de expresión de citoquinas MSC inducida por cáncer EVs y se evaluó el efecto de las MSCs EV-educado en crecimiento del tumor y la formación de metástasis. La representación general del diseño de estudio se ilustra en la <s...

Inyección directa de vesículas extracelulares derivadas de cáncer (EVs) conduce a la reprogramación de la médula ósea apoyando la progresión del tumor; sin embargo, está claro que las células median este efecto. Adjunto, describimos un protocolo paso a paso para investigar EV-mediada de células madre tumorales mesenquimales (MSC) interacciones en vivo, revelando un papel crucial para MSCs EV-educado en metástasis.

Un modelo de ratón preclínica de Osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre Tumor y las células madre mesenquimales

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es desarrollar un modelo preclínico de ratón para estudiar el papel de la comunicación mediada por vesículas extracelulares entre células madre tumorales y mesenquimales. Este método puede ayudar a responder varias preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como cómo se comunican las células madre tumorales y mesenquimales por medio de vesículas extracelulares, y si esto apoya la progresión del cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que permite estudiar el papel de la adaptación de las células madre mesenquimales por las VE del cáncer, en la progresión y formación de metástasis in vivo.La implicación de este procedimiento se extiende a nuestra terapia del cáncer, ya que podemos usar GSA para interferir con la comunicación EV y la señalización de andrógenos para inhibir la progresión del cáncer. Además de proporcionar información sobre la comunicación mediada por EV en el osteosarcoma, este método también se puede aplicar a muchos otros tipos de cáncer. De hecho, la médula ósea derivada de las células madre mesenquimales se recluta fácilmente en más sitios donde pueden diferenciarse en células de apoyo al cá

a-preclinical-mouse-model-osteosarcoma-to-define-extracellular

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

El nuevo protocolo reportados en el presente estudio permite la detección selectiva de metástasis pulmonares en la celda de resolución única en ratones por...

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada<em&gt; In-situ</em&gt; La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales

Este video presenta el procedimiento quirúrgico para la resección tumoral guiada por imagen y la implantación de un bio-andamio sembrado con células madre mesenquimales modificadas genéticamente o MSCs que expresan un ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral o TRAIL. Estas MSC terapéuticas tienen el potencial en el tratamiento de tumores cerebrales.

Resección tumoral guiada por fluorescencia e implantación de andamio sembrado con MSC en modelo murino: un procedimiento quirúrgico para administrar células madre mesenquimales terapéuticas en la cavidad de resección de tumores cerebrales en un modelo de ratón

Este manuscrito describe el desarrollo de un modelo animal que permite probar directamente los efectos de la hipoxia tumoral sobre la metástasis y descifrar los mecanismos de su acción. Aunque los experimentos que se describen aquí se centran en el sarcoma de Ewing, se puede aplicar un abordaje similar a otros tipos de tumores.

Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral

Aquí, presentamos un protocolo para la generación de pluripotentes inducidas (iPSCs) de células de fibroblastos derivados pacientes de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciación de iPSCs a través de las células madre mesenquimales (MSCs) y osteoblastos, modelado en vivo tumorigenesis con osteoblastos derivados de paciente LFS.

Modelado de Osteosarcoma usando las células de vástago de Pluripotent inducido derivados del paciente el síndrome de Li-Fraumeni

El modelo de la matriz extracelular (BEM) de hueso para el osteosarcoma (OS) está bien establecida y se muestra aquí. Puede utilizarse como un andamio adecuado para mímico el tumor primario crecimiento en vitro y proporcionando un modelo ideal para el estudio de la heterogeneidad histologic y cytogenic de OS.

Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Aquí se describe el uso de un método de amplificación de sonda específico para metilación para analizar los niveles de metilación de los elementos LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma. También se demuestra la ultracentrifugación, un procedimiento popular para separar vesículas extracelulares del suero bovino fetal.

ANÁLISis de metilación de LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma

Aquí, se describe un implante ortotópico singénico seguido de un procedimiento de amputación del osteosarcoma con metástasis pulmonar espontánea que se puede utilizar para la investigación preclínica de la biología de la metástasis y el desarrollo de nuevas terapias.

Un modelo de rata Sprague Dawley de osteosarcoma ortotópico singénico con amputación para controlar la tasa de metástasis

El presente protocolo describe la inyección de células de osteosarcoma intratibia para generar modelos de ratón con osteosarcoma ortotópico y lesiones de metástasis pulmonar.

Inyección de células de osteosarcoma intratibial para generar osteosarcoma ortotópico y metástasis pulmonar modelos de ratón

El protocolo proporciona un proceso de estandarización detallado de la fórmula de decocción y la técnica de sonda nasogástrica con la decocción de Yiqi Jiedu en el modelo de ratón con osteosarcoma como ejemplo. Describe la protección de los animales y mejora la fiabilidad de los datos de investigación, proporcionando estrategias eficaces para investigar la eficacia terapéutica y los mecanismos moleculares de las fórmulas de decocción in vivo.

Estrategia de sonda nasogástrica para la fórmula de decocción de la medicina tradicional china en ratones modelo de osteosarcoma

El presente protocolo describe el método para establecer un modelo de ratón de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) utilizando tejido de osteosarcoma humano.

Establecimiento de un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de un paciente con tejidos de osteosarcoma humano

Aprende a desarrollar un modelo preclínico en ratón para estudiar la comunicación mediada por vesículas extracelulares entre tumores y células madre mesenquimales. Este método permite analizar la progresión tumoral y la formación de metástasis in vivo.

Un modelo de ratón preclínica de Osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre Tumor y las células madre mesenquimales (Video) | JoVE Journal

Un modelo de ratón preclínica de Osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre Tumor y las células madre mesenquimales

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