Métodos para pupa períodos de prueba y medición de pigmentación de ala de Drosophila guttifera

El objetivo general de este experimento es escenificar los períodos de pupa y medir la pigmentación de las alas de Drosophila guttifera. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología evolutiva del desarrollo, como cómo se desarrollan los patrones de pigmentación en Drosophila. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener información detallada sobre el desarrollo morfológico y el proceso de pigmentación.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo morfológico y el proceso de pigmentación de Drosophila guttifera, se puede aplicar a otras especies de Drosophila. Para comenzar a eliminar el pupario, coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara en un trozo de toalla de papel. Coloque una pupa en la cinta adhesiva de doble cara, con el lado ventral hacia arriba.

Localiza el espacio entre la cara anterior del pupario y la pupa interna. Agarre y extraiga el pupario alrededor de este espacio, usando fórceps. Y exponer la cara anterior de la cabeza de la pupa.

Inserte la punta de una pinza moviéndola paralela al eje antero-posterior. Levante la punta de las pinzas para romper localmente el pupario. Repite esta acción hasta que la rotura llegue a la parte posterior del pupario.

Asegúrese de que se forme un espacio entre el pupario y las patas de la pupa. Y rompe el lado ventral del pupario mientras minimiza el daño a la pupa interna. Después de romper el pupario tanto como sea posible, saque la pupa con un pincel fino.

Coloque la pupa en un trozo de papel de seda humedecido con ddH2O y colocado en una placa de Petri de plástico. Tome fotografías de inmediato, ya que la pupa expuesta es vulnerable y se seca fácilmente. Proceda con la preparación de la imagen y extraiga la porción anterior del pubario con fórceps.

Saca la pupa y colócala en solución salina tamponada con fosfato, o PBS, en una placa de Petri de plástico. A continuación, corta la articulación basal de un ala. A medida que el ala está plegada, colóquela en una placa de Petri de plástico llena de ddH2O para extenderla por presión osmótica.

Recoja los adultos recién cerrados una vez cada 10 minutos de un archivo de stock. Anestesia a una mosca con una almohadilla anestésica de CO2. Confirmar la anestesia por inmovilidad y cortar la articulación basal de un ala.

Deje caer 10 microlitros de PBS en un portaobjetos de vidrio. Coloca el ala en la gota. Y cubra la gota con un cubreobjetos.

A continuación, encienda la luz del microscopio estereoscópico y ajústela al máximo. Ajuste la lente del objetivo a 11,5x y ajuste el diafragma al estado más abierto. Luego, encienda la cámara y configúrela.

Concéntrese en la muestra moviendo la perilla de enfoque del microscopio. Pulse el disparador del mando a distancia para tomar una imagen. Tome una imagen del ala, centrada en un sensilum campaniforme, colocando la parte distal del ala en el lado izquierdo y la parte interior del ala en el lado superior.

Abra una imagen con la mancha sensillum campaniforme en el centro. Haga clic en Imagen, Tipo 1, 8 bits, para convertir la imagen en una imagen de 8 bits. Haga clic en rectángulo en las herramientas de selección de área y dibuje un rectángulo.

Coloque el lado derecho del rectángulo de modo que quede ubicado a la derecha de la mancha campaniforme sensillum. Haga clic en Editar, Selección, Agregar al administrador y, a continuación, marque la columna Mostrar todo. A continuación, haga clic en la herramienta de ángulo en las herramientas de selección de línea.

Dibuja la primera línea en la línea posterior de la tercera vena longitudinal. Establezca los extremos izquierdos de la línea en el vértice del rectángulo dibujado anteriormente. Dibuja la segunda línea en la parte superior del rectángulo.

Presione la tecla M para medir el ángulo entre las dos líneas dibujadas en este paso. Haga clic en la ventana de la imagen en la pantalla de la computadora. Haga clic en Editar, Selección, Agregar al administrador.

Haga clic en rectángulo en las herramientas de selección de área y dibuje un rectángulo de aproximadamente 1/9 del tamaño de la ventana de la imagen. Haga clic en Editar, Seleccionar, Rotar. Escriba los grados negativos del ángulo medido anteriormente en la columna Ángulo y haga clic en Aceptar para rotar el rectángulo dibujado en este paso.

Mueva el rectángulo dibujado con las teclas de flecha y establezca el punto final de la línea posterior de la segunda vena longitudinal en el lado izquierdo del rectángulo. Y el lado inferior del rectángulo, unido a la línea posterior de la tercera vena longitudinal. Confirme que se trazó una línea perpendicular desde el punto final de la segunda vena longitudinal hasta la línea posterior de la tercera vena longitudinal.

Defina el pie de la línea perpendicular como punto A.Registre la coordenada X y la coordenada Y del punto A, indicadas debajo de las herramientas de selección de área al colocar el cursor en el punto A.Abra la imagen con el punto A en el centro. Haga clic en Imagen, Tipo, 8 bits, para convertir la imagen en una imagen de 8 bits. Haga clic en rectángulo en las herramientas de selección de área y dibuje un rectángulo de aproximadamente 1/9 del tamaño de la ventana de la imagen.

Haga clic en Editar, Seleccionar, Especificar. Marque la columna Ovalada y Centrada. Escriba 100 píxeles en las columnas de ancho y alto.

Escriba las coordenadas X del punto A en la columna de coordenadas X y las coordenadas Y del punto A en la columna de coordenadas Y y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, haga clic en Analizar y medir. Si la calibración ya ha finalizado, los OD se indican en la columna Media. La comparación de los datos de múltiples etapas reveló que la etapa P12 es el momento de inicio de la pigmentación y que la pigmentación se completa 12 horas después de la eclosión.

Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología evolutiva del desarrollo exploren las diferencias en el desarrollo de la pupa y el proceso de pigmentación entre las especies de Drosophila.