Caracterización de células del Tumor mediante un alambre de médico para la captura de circulación de las células del Tumor: un enfoque 3D basada en la inmunofluorescencia y DNA FISH

El objetivo general de este protocolo es combinar la tinción de inmunofluorescencia con la hibridación in situ de ADN fluorescente en un alambre funcionalizado en 3D e identificar el inmunofenotipo y las señales FISH en el soporte utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio convencional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la caracterización de las células tumorales secretoras, como la identificación de objetivos relacionados con la terapia en células circulantes de cáncer de pulmón de células no pequeñas. La principal ventaja de este protocolo es que permite la identificación simultánea de parámetros fenotípicos como la positividad de EpCAM y alteraciones citosomáticas como el estado del gen ARC para detectar CTC putativas.

Aunque este método fue diseñado exclusivamente para proporcionar características CTC de cáncer con insulina in situ, también se puede aplicar al estudio de otros cánceres como el cáncer de mama. Desarrollamos este protocolo mientras manejamos el alambre para el inmunofenotipado directo y la detección de CTC. Para obtener más datos, asociamos un protocolo de inmunofenotipado con un protocolo de hibridación in situ de fluorescencia de ADN.

Manejar el alambre no es fácil, principalmente porque la punta funcionalizada es frágil. Una demostración visual hará que los lectores reproduzcan los pasos. Para comenzar el experimento, vuelva a suspender todo el contenido de un matraz T75 que esté al 80% de confluencia en un vial de cinco mililitros utilizando cuatro mililitros de medio completo.

A continuación, retire el alambre de su embalaje de vidrio. Sumerja la parte dorada funcionalizada del alambre en el vial, asegurándose de que el tapón de alambre sea hermético para un vial de cinco mililitros. Selle el alambre con una película de laboratorio.

Luego, incube el alambre en un rotador de tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la rotación, enjuague el alambre tres veces en una solución de PBS de un solo pliegue usando tres viales limpios diferentes y espere a que el alambre se seque. Después de secar al aire el alambre durante 10 minutos en una campana, fije las celdas sumergiendo el alambre en una solución de acetona al 100% en un tubo de cinco mililitros durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Asegúrese de que no haya rastros de acetona en la punta funcionalizada. Seque el alambre al aire durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, en un tubo de cinco mililitros, lave el alambre dos veces en un PBS de un pliegue.

Incubar el alambre en tampón de dilución de anticuerpos. Prepare 150 microlitros de mezcla de anticuerpos con una dilución de anticuerpo primario monoclonal conjugado con fluorocromo y tampón de dilución de anticuerpos especificado en la hoja de datos. Luego, use una punta P200 para extraer el alambre del tapón de alambre e inserte suavemente el alambre a través del orificio más grande de la punta.

Inserte primero el extremo no funcionalizado y tire lentamente del alambre a través del orificio más pequeño hasta que la parte dorada esté justo más allá del orificio más grande. Agregue suavemente 150 microlitros de la mezcla de anticuerpos en la punta. Para evitar el riesgo de formación de burbujas, gire suavemente el alambre hasta que el extremo funcionalizado esté completamente sumergido.

Selle el orificio de la punta y envuelva la película de laboratorio alrededor del orificio. Incube el alambre verticalmente durante la noche en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Al segundo día, bloquee la incubación de anticuerpos lavando el alambre dos veces en PBS de un pliegue.

Vuelva a insertar el cable en su tapón de alambre. Tres horas antes del protocolo DNA-FISH, configure el horno de hibridación a 75 grados centígrados y configure el horno de calor seco a 37 grados centígrados. Enfríe la solución de SSC 0,4 veces a cuatro grados centígrados.

Lave el alambre tres veces en una solución helada de SSC de 0,4 veces. Seque el cable en la oscuridad debajo del armario de la campana extractora durante 10 minutos. Después de 10 minutos, haga girar la sonda durante cinco segundos.

Coloque 10 microlitros de la sonda en microtubos de vidrio y luego cúbralos con una película de laboratorio. Envuelva los microtubos en papel absorbente seco. Colócalos en un tubo de 50 mililitros y gíralos brevemente.

Coloque con cuidado el alambre seco en el microtubo e inserte el tapón de alambre. Luego, selle el tapón de alambre con cemento de caucho. Coloque el alambre en una cámara oscura y húmeda en el horno de hibridación durante ocho minutos a 75 grados Celsius para obtener la desnaturalización completa del ADN.

Después de ocho minutos, mueva la cámara húmeda a un horno de calor seco a 37 grados centígrados durante la noche. Coloque el frasco de tinción deslizante con una solución de SSC de 0,4 veces en un baño de agua a 72 grados centígrados. Verifique la temperatura de la solución de SSC de 0.4 veces hasta que alcance 72 más o menos un grado Celsius.

A continuación, prepare dos vasos de precipitados de vidrio. Uno con solución doble de SSC más 0,05%Tween y el segundo con agua destilada. Retire la cámara húmeda para el horno de calor seco.

Use pinzas para quitar con cuidado el cemento de goma del tapón de alambre y tire del extremo sin recubrimiento del cable a través del tope del extremo, teniendo cuidado de no dañar la punta funcionalizada. Sumerja el cable en la solución de SSC de 0,4 veces durante dos minutos a 72 grados Celsius. Lave el alambre en una solución de SSC más 0.05%Tween de doble pliegue durante 30 segundos a temperatura ambiente.

Luego, lave el alambre en agua destilada a temperatura ambiente. Seque el cable debajo de la campana extractora durante 10 minutos en la oscuridad. Incubar la punta funcionalizada del alambre con solución de DAPI previamente preparada en un vial de dos mililitros.

Enjuague el alambre dos veces en PBS de un pliegue y seque el alambre al aire. Coloque el cable en el soporte de cable e inserte con cuidado la punta funcionalizada a través del punto de entrada del soporte especial hasta que la punta coincida con el punto de acoplamiento. Coloque el soporte especial en la platina del microscopio.

Ajuste el enfoque del microscopio con una lente de 20 pliegues. Primero, concéntrese aproximadamente en el soporte especial y luego ajuste finamente las celdas que parecen brillantes en el canal DAPI. Enfoca solo las celdas centrales de la lente y adquiere imágenes usando una cámara digital de 12 bits en objetivos de 20x y 40x con filtros apropiados para sondas rojas, verdes y azules.

Finalmente, prepare el alambre para el almacenamiento a largo plazo empacando el alambre junto a la punta funcionalizada e inserte con cuidado el alambre en un tubo de vidrio. Guarde el cable vertical u horizontalmente a menos 20 grados centígrados. La tinción de inmunofluorescencia no interfirió con las señales de ADN-FISH.

Cuando el ensayo inmuno-DNA-FISH se realizó en el alambre funcionalizado de soporte 3D, la tinción de EpCam fue claramente visible. La sonda ALK reveló la deleción del gen. La línea celular NCI-H3122 mostró un estado aberrante del gen LAK en contraste con el NCI-H1975 con un ALKG de tipo salvaje.

Una vez dominado, este protocolo se puede realizar en un total de nueve horas de trabajo durante tres días. Al intentar este procedimiento, es importante no tocar la parte funcionalizada del cable para evitar cualquier daño. Siguiendo este protocolo, se pueden utilizar diferentes anticuerpos y sondas FISH para responder a preguntas adicionales como la identificación de células con otros marcadores fenotípicos y otras alteraciones citogenéticas como la amplificación del gen NAT o HAR2.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo identificar simultáneamente CTC putativas a través de parámetros fenotípicos como la positividad de EpCAM y para detectar alteraciones citogenéticas como el estado del gen ARC. No olvide que trabajar con acetona y horno puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones como el manejo de acetona en la capucha y el uso de guantes protectores al realizar este procedimiento.