Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

El objetivo general de este protocolo es obtener ADN tumoral de alta calidad a partir de muestras clínicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la ciencia básica y clínica, como la investigación, el diagnóstico y las decisiones de tratamiento del cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener el ADN tumoral de forma más sencilla y rápida que con los métodos anteriores.

Para comenzar el protocolo, toque la superficie tumoral de un tejido previamente preparado y resecado en un portaobjetos de vidrio normal varias veces con las manos enguantadas. Confirme visualmente que el área tocada cubre más del 80% del portaobjetos de vidrio. Presione ligeramente el portaobjetos de vidrio normal contra un portaobjetos de membrana de polietileno, naftalato o PEN y frótelo suavemente dos o tres veces con las manos enguantadas.

Confirme visualmente que las células se transfieren del portaobjetos de vidrio normal al portaobjetos de membrana PEN. Seque al aire tanto el vidrio como los portaobjetos de membrana PEN durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después del secado, tiña el portaobjetos de vidrio normal para un examen citológico directo.

Sumerja los portaobjetos de vidrio en una solución fijadora durante cinco segundos y luego tiña con la solución de tinción Giemsa durante 15 segundos. Evalúe y examine el contenido tumoral y la celularidad en el portaobjetos de vidrio normal completamente con un microscopio para una evaluación rápida. Evalúe las células tumorales en función de varios criterios.

Si la muestra muestra una celularidad tumoral superior al 60% mediante una evaluación microscópica rápida de la sección anterior, corte la película tocada por el tumor de los portaobjetos de la membrana PEN para la extracción de ADN con un cuchillo y las manos enguantadas. Transfiera la película cortada a un tubo de microcentrífuga estéril con un juego de alfileres y las manos enguantadas. Guarde el tubo de microcentrífuga que contiene la película a cuatro grados centígrados hasta la extracción del ADN.

Abra el software y planifique la condición de ejecución y establezca el parámetro de ejecución dentro del software. Haga clic en la pestaña plan y seleccione plantilla, luego seleccione el método de ejecución adecuado. Seleccione la aplicación y el tipo de técnica y haga clic en siguiente.

Seleccione el instrumento, el kit de preparación de muestras, el tipo de kit de biblioteca, el kit de plantillas, el kit de secuenciación, el modo de calibración base, el tipo de chip, la secuencia de control y el conjunto de códigos de barras y haga clic en siguiente. Selecciona los plugins y haz clic en siguiente. Seleccione proyecto y haga clic en Siguiente.

A continuación, seleccione la referencia predeterminada y los archivos BED de la región de destino. Escriba el nombre de la muestra, seleccione el código de barras y haga clic en planificar ejecución. A continuación, realice la preparación de la plantilla y la carga de virutas en un instrumento automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Descongele el cartucho de reactivo a temperatura ambiente durante 45 minutos antes de usarlo. Diluya la biblioteca sin diluir con agua libre de nucleasas de acuerdo con la concentración de la biblioteca calculada en el paso 6.8 y haga 20 bibliotecas picomolares. Prepare una biblioteca agrupada para la secuenciación y guárdela en hielo.

Añada 25 microlitros de la biblioteca agrupada con una pipeta de 100 microlitros al fondo del tubo de muestra. Encienda la alimentación y abra la tapa del instrumento automatizado. Coloque el chip de secuenciación, el adaptador de chip, el cartucho de enriquecimiento, el cartucho de punta, la placa de PCR, el sello del marco de PCR, el tubo de recuperación, el cartucho de solución y el cartucho de reactivo en la posición adecuada del instrumento automatizado.

Toque configurar, ejecutar y paso a paso en la pantalla. Cierre la tapa y toque iniciar verificación en la pantalla. Después del proceso de escaneo de la plataforma, toque siguiente.

Verifique el contenido de la pantalla, el tipo de kit, la identificación del chip, la identificación de la muestra, el tipo de chip y los planes. Establezca la hora y toque OK. Después de terminar de cargar el chip, toque siguiente y abra la tapa. Descargue el chip de secuenciación del adaptador de chip con las manos enguantadas.

Coloque el chip en el contenedor de chips, envuélvalo con parafilm y almacene el chip a cuatro grados centígrados hasta la reacción de secuenciación. A continuación, retire el cartucho de enriquecimiento, la placa de PCR, el sello del marco de PCR, el tubo de recuperación, el cartucho de solución y el cartucho de reactivo de la posición adecuada del instrumento automatizado con las manos enguantadas. Transfiera un cartucho de punta vacío a la posición de punta de desecho del instrumento automatizado con las manos enguantadas.

Toque siguiente y cierre la tapa. A continuación, toque iniciar y limpie el instrumento automatizado con rayos ultravioleta durante cuatro minutos. Disuelva una tableta de clorito de sodio en 1.000 mililitros de agua ultrapura y filtre la solución con un filtro de 0,22 micras.

Una vez que el instrumento de secuenciación se haya calentado, toque limpiar y siguiente en la pantalla del instrumento de secuenciación. Limpie el instrumento de secuenciación con 250 mililitros de solución de clorito de sodio esterilizada con filtro, luego 250 mililitros de agua ultrapura. A continuación, toque inicializar y seleccione el kit de secuenciación adecuado en la pantalla.

Instale un cargador gris con las manos enguantadas. Inicialice el instrumento de secuenciación con la solución de lavado, la solución de ajuste de pH y la solución estándar de pH. A continuación, agregue 20 microlitros de nucleótidos DATP, DGTP, DCTP y DTTP en tubos de 50 mililitros con una pipeta de 100 microlitros.

Instale un cargador gris en el lugar apropiado con las manos enguantadas. Cargue el tubo de 50 mililitros y enrósquelo en el instrumento de secuenciación. Seleccione siguiente en la pantalla para iniciar el paso de inicialización.

Después de completar el paso de inicialización, toque ejecutar en la pantalla y seleccione el instrumento de preparación de biblioteca adecuado. Escanee el código de barras bidimensional del chip. Inserte el chip de secuenciación en la posición adecuada.

Cierre la pinza de chip y la puerta del instrumento y toque chip check, next y OK en la pantalla para iniciar la ejecución de secuenciación. Después de la reacción de secuenciación, transfiera los datos y realice la canalización de análisis de datos en el servidor de secuenciación. Las cantidades absolutas de ADN y el valor RQ, un indicador del nivel de degradación del ADN genómico, muestran que se logra un mayor rendimiento de ADN utilizando las muestras de TIC en comparación con las muestras de FFPE.

Además, los valores de RQ del ADN TIC fueron significativamente más altos en comparación con los del ADN FFPE en diferentes tipos de tumores. APC Q1367* se identificó tanto en FFPE como en TIC DNA extraído del sitio uno y APC S1356*KRAS G12D, y TP53 M237i se detectaron tanto en FFPE como en TIC DNA extraídos de los sitios dos, tres y cuatro, lo que sugiere que las mutaciones somáticas idénticas se identificaron en muestras emparejadas de FFPE y TIC DNA preparadas a partir del mismo sitio tumoral. En particular, se detectaron las mismas mutaciones somáticas entre el cáncer colorrectal primario y dos muestras de cáncer de hígado metastásico, lo que sugiere que los clones del tumor del sitio dos hicieron metástasis en el hígado.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación molecular y médica identificaran los cánceres genéticos.