Name: Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a extraer ADN tumoral de alta calidad mediante citología de impresión táctil para análisis genético en investigación oncológica. Este método simplifica el enriquecimiento celular y facilita la secuenciación de próxima generación.

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Agradecemos a todo el personal médico y auxiliar del hospital y los pacientes para consentir a participar. Agradecemos a Gabrielle blanco lobo, PhD, de Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de un proyecto de este informe. Este estudio fue apoyado por una subvenciones para proyecto de investigación del genoma de la Prefectura de Yamanashi (Y.H. y M.O.) y una beca de la YASUDA médica Fundación (albergue).

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<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+and+exome+sequencing+identified+somatic+mutations+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+two+amplicon-based+sequencing+panels+of+different+scales+in+the+detection+of+somatic+mutations+associated+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer.</a> BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+HER2+V777L+mutation+mediates+resistance+to+trastuzumab+in+a+breast+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient.</a> Med Oncol. 34 (1), 3(2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+BRCA1+and+BRCA2+germline+mutations+in+Japanese+population+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigene+panel+analysis+identified+germline+mutations+of+DNA+repair+genes+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).</li>
<li>Lièvre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+status+is+predictive+of+response+to+cetuximab+therapy+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).</li>
<li>Mok, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+or+Platinum-Pemetrexed+in+EGFR+T790M-Positive+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+rep%22%5BJournal%5D)">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci rep. 13 (3), 3493(2013).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, se presenta un método alternativo para la obtención de tumor ADN de especímenes patológicos clínicos utilizando TIC. Preparación de TIC es muy simple y necesita menos tiempo en comparación con métodos FFPE, sin la necesidad de instrumentos especiales10. Todos los procedimientos de la preparación de TIC para la extracción de ADN se pueden terminar dentro de dos días (figura 1). Este método por lo tanto acorta el tiempo de respuesta para realizar prueba...

Última generación tecnología de secuenciación ha proporcionado los investigadores avances significativos en el análisis de información del genoma en las variaciones genéticas, enfermedad mendeliana, predisposición hereditaria y cáncer 1,2,3 . El Atlas de genoma del cáncer (TCGA) y el Consorcio Internacional del genoma del cáncer (ICGC) han seguido la identificación de alteraciones genéticas en algunos tipos de cánceres comunes4. Cientos de genes de la conductor de cáncer esenciales han sido correctamente identificados y algunas de estas moléculas se apunta para drogas desarrollo1,5,6.
En el ajuste clínico, muestras FFPE comúnmente se utilizan para diagnosis patológica y moleculares para varias enfermedades, incluyendo cáncer. Sin embargo, durante el proceso de fijación con formalina, ADN-proteína o DNA-DNA Cross-linking ocurre y se induce la fragmentación del ADN. Así, muestras de ADN de FFPE no son siempre adecuadas para análisis genético debido a baja calidad y cantidad de ADN7,8,9. Además, tarda varios días para preparar a las muestras FFPE y habilidad técnica es necesario preparar correctamente las secciones. Por lo tanto, es conveniente desarrollar un método simple y rápido para obtener ADN intacto de alta calidad.
La citología es un método alternativo para el diagnóstico patológico. Preparación de la muestra citológica es un más simple, menos costoso y más rápido acercamiento comparado con FFPE preparación10. La técnica TIC se ha realizado sobre los nodos de linfa del centinela y los tejidos marginales de pacientes de cáncer de mama para el diagnóstico rápido intraoperatorio para algunos años11,12. Sin embargo, hay algunos informes que han examinado si el ADN genómico de alta calidad puede extraerse muestras TIC y utilizado para el posterior análisis genético. Las muestras citológicas son comúnmente teñidas con Papanicolaou (Pap) o tinción de Giemsa, y divulgado previamente que la cantidad y calidad del ADN extraído de muestras TIC (especialmente Giemsa-manchada las muestras) son superiores a las muestras obtenidas de FFPE los tejidos13. En comparación con la tinción de Papanicolau, tinción de Giemsa tiene una ventaja que requieren menos procedimientos de tinción. En la tinción de Pap, después las muestras se han fijado y teñido, debe ser montados con montaje medio (e.g., Malinol) para distinguir el contenido de la muestra, tales como las células tumorales, las células normales y células inflamatorias bajo un microscopio. Si la muestra de Pap está preparada sin el paso de montaje, es casi imposible observar las células bajo un microscopio porque la muestra se seca. En comparación, la coloración de Giemsa se observan en el estado seco, por lo tanto, el paso de montaje no es necesario para la rápida evaluación celular. Para microdisección, tinción de Giemsa es más conveniente porque requiere a especímenes secos.
En este informe, introducir un método simple y rápido para la preparación de especímenes TIC con la tinción de Giemsa y demuestran que el TIC es una mejor fuente de ADN en comparación con especímenes FFPE.

<table><tbody><tr><td>FINE FROST blanco20 micro portaobjetos</td><td>de vidrio Matsunami Glass ind, Ltd</td><td>SFF-011</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Portaobjetos de vidrio de membrana</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Solución Cyto Quick</td><td>A Muto Pure Chemicals</td><td>20571</td><td></td></tr><tr><td>Solución Cyto Quick B</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20581</td><td></td></tr><tr><td>Solución May-Grunwald Muto</td><td>Pure Chemicals</td><td>15053</td><td></td></tr><tr><td>Solución Giemsa</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15002</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE kit de tejidos</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Kit de reactivos de detección de ARNasa P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316831</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan de FFPE Ensayo de control de calidad de ADN v2</td><td>Placa de</td><td></td> reacción óptica rápida de 96 pocillos Thermo Fisher Scientific 4324034 <td></td></tr><tr><td>MicroAmp&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Película adhesiva óptica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroMixer E36</td><td>TITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VIIA7-03</td><td></td></tr><tr><td>Himac CF16RXII</td><td>Hitachi-koki</td><td>CF16RII</td><td></td></tr><tr><td>Ion Library Kit de cuantificación TaqMan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4468802</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475346</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4480442</td><td></td></tr><tr><td>Ion Xpress Kit 1-16 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4471250</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Hi-Q View Kit de secuenciación (base 200)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30044</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Ion Chef</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484177</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclador de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Veriti200</td><td></td></tr><tr><td>Ion 318 Chip Kit v2 BC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4488150</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PGM11-001</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Wash 2 Bottle kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25591</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&trade; AMPure&comercio; XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético de 16 posiciones</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga antiadherentes sin RNasa, 1,5 mL (tubo de baja unión)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Placas de reacción ópticas de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Película adhesiva transparente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&trade; AMPure&comercio; XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Etanol(99.5)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08948-25</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (10M)</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>DTU-Neo</td><td>TAITEC</td><td>0063286-000</td><td></td></tr><tr><td>E-36</td><td>TAITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ci-L</td><td>Nikon</td><td>704354</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-2XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014393</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-10XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-100XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014384</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>petit-change</td><td>WAKEN</td><td>MODEL8864</td><td>Mini centrífuga</td></tr><tr><td>petit-incubadora</td><td>WAKEN</td><td>WKN-2290</td><td>Incubadora de aire</td></tr><tr><td>SensiCare Guantes de examen de nitrilo sin polvo</td><td>MEDLINE</td><td>SEM486802</td><td></td></tr><tr><td>Gasa estéril</td><td>Osaki</td><td>11138</td><td></td></tr><tr><td>Frigorífico MediCool</td><td>SANYO</td><td>MPR-312DCN-PJ</td><td></td></tr> CUCHILLA <tr><td>DE CORTE DE PLUMAS</td><td>PLUMA</td><td>No.130</td><td></td></tr><tr><td>CUCHILLA DE CORTE DE PLUMAS</td><td>PLUMA</td><td>No.260</td><td></td></tr><tr><td>PLUMA S PLUMA</td><td></td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3</td><td>IKA</td><td>41-0458</td><td>Mezclador de vórtice</td></tr><tr><td>Pincette</td><td>NATSUME</td><td>A-5</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microtubo</td><td>BIOBIK</td><td>RC-0150</td><td></td></tr></tbody></table>

método simple y rápido para obtener alta calidad tumor adn de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Es fundamental para determinar el estado mutacional en cáncer antes de la administración y tratamiento de drogas específicas moleculares específicas para pacientes con cáncer. En el ajuste clínico, tejidos de (FFPE) parafina-encajado formalina-fijos son ampliamente utilizados para las pruebas genéticas. Sin embargo, FFPE ADN generalmente dañado y fragmentado durante el proceso de fijación con formalina. Por lo tanto, FFPE ADN a veces no es adecuado para las pruebas genéticas debido a baja calidad y cantidad de ADN. Aquí presentamos un método de la citología de impresión táctil (TIC) para obtener ADN genómico de las células cancerosas, que puede ser observado bajo el microscopio. Número de células de cáncer y morfología celular puede ser evaluado utilizando a muestras TIC. Además, la extracción de DNA genómico de muestras TIC se puede terminar dentro de dos días. La cantidad total y calidad de ADN TIC obtenidos mediante este método fue mayor que el de ADN FFPE. Este método rápido y simple permite a los investigadores para obtener ADN de calidad para pruebas genéticas (p. ej., análisis de secuenciación de próxima generación, digital PCR y PCR cuantitativo en tiempo real) y para acortar el tiempo de respuesta para informar los resultados.

La figura 1 muestra el proceso de preparación de muestras TIC para la extracción de ADN. En particular, el procedimiento toma sólo dos días para obtener ADN genómico de muestras TIC. Se evaluaron los efectos de almacenamiento de tumor antes de la elaboración de diapositivas. Encontramos que las células del tumor fueron atadas en el portaobjetos de cristal cuando muestras de tejido fueron inmediatamente tocadas en la diapositiva, y cuando los tejidos se mantuv...

Obtención de ADN genómico de la alta calidad de los tejidos del tumor es un primer paso esencial para el análisis de alteraciones genéticas mediante la siguiente secuencia de generación. En este artículo presentamos un método simple y rápido para enriquecer las células tumorales y obtener ADN intacto del toque de muestras de citología de impresión.

Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

El objetivo general de este protocolo es obtener ADN tumoral de alta calidad a partir de muestras clínicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la ciencia básica y clínica, como la investigación, el diagnóstico y las decisiones de tratamiento del cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener el ADN tumoral de forma más sencilla y rápida que con los métodos anteriores.Para comenzar el protocolo, toque la superficie tumoral de un tejido previamente preparado y resecado en un portaobjetos de vidrio normal varias veces con las manos enguantadas. Confirme visualmente que el área tocada cubre más del 80% del portaobjetos de vidrio. Presione ligeramente el portaobjetos de vidrio normal contra un portaobjetos de membrana de polietileno, naftalato o PEN y frótelo suavemente dos o tres veces con las manos enguantadas.Confirme visualmente que las células se transfieren del portaobjetos de vidrio normal al portaobjetos de membrana PEN. Seque al aire tanto el vidrio como los portaobjetos de membrana PEN durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después del secado, tiña el portaobjetos de vidrio normal para un examen citológico directo.Sumerja los portaobjetos de vidrio en una solución fijadora durante cinco segundos y luego tiña con la solución de tinción Giemsa durante 15 segundos. Evalúe y examine el contenido tumoral y la celularidad en el portaobjetos de vidrio normal completamente con un microscopio para una evaluación rápida. Evalúe las células tumorales en función de varios criterios.Si la muestra muestra una celularidad tumoral superior al 60% mediante una evaluación microscópica rápida de la sección anterior, corte la película tocada por el tumor de los portaobjetos de la membrana PEN para la extracción de ADN con un cuchillo y las manos enguantadas. Transfiera la película cortada a un tubo de microcentrífuga estéril con un juego de alfileres y las manos enguantadas. Guarde el tubo de microcentrífuga que contiene la película a cuatro grados centígrados hasta la extracción del ADN.Abra el software y planifique la condición de ejecución y establezca el parámetro de ejecución dentro del software. Haga clic en la pestaña plan y seleccione plantilla, luego seleccione el método de ejecución adecuado. Seleccione la aplicación y el tipo de técnica y haga clic en siguiente.Seleccione el instrumento, el kit de preparación de muestras, el tipo de kit de biblioteca, el kit de plantillas, el kit de secuenciación, el modo de calibración base, el tipo de chip, la secuencia de control y el conjunto de códigos de barras y haga clic en siguiente. Selecciona los plugins y haz clic en siguiente. Seleccione proyecto y haga clic en Siguiente.A continuación, seleccione la referencia predeterminada y los archivos BED de la región de destino. Escriba el nombre de la muestra, seleccione el código de barras y haga clic en planificar ejecución. A continuación, realice la preparación de la plantilla y la carga de virutas en un instrumento automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Descongele el cartucho de reactivo a temperatura ambiente durante 45 minutos antes de usarlo. Diluya la biblioteca sin diluir con agua libre de nucleasas de acuerdo con la concentración de la biblioteca calculada en el paso 6.8 y haga 20 bibliotecas picomolares. Prepare una biblioteca agrupada para la secuenciación y guárdela en hielo.Añada 25 microlitros de la biblioteca agrupada con una pipeta de 100 microlitros al fondo del tubo de muestra. Encienda la alimentación y abra la tapa del instrumento automatizado. Coloque el chip de secuenciación, el adaptador de chip, el cartucho de enriquecimiento, el cartucho de punta, la placa de PCR, el sello del marco de PCR, el tubo de recuperación, el cartucho de solución y el cartucho de reactivo en la posición adecuada del instrumento automatizado.Toque configurar, ejecutar y paso a paso en la pantalla. Cierre la tapa y toque iniciar verificación en la pantalla. Después del proceso de escaneo de la plataforma, toque siguiente.Verifique el contenido de la pantalla, el tipo de kit, la identificación del chip, la identificación de la muestra, el tipo de chip y los planes. Establezca la hora y toque OK. Después de terminar de cargar el chip, toque siguiente y abra la tapa. Descargue el chip de secuenciación del adaptador de chip con las manos enguantadas.Coloque el chip en el contenedor de chips, envuélvalo con parafilm y almacene el chip a cuatro grados centígrados hasta la reacción de secuenciación. A continuación, retire el cartucho de enriquecimiento, la placa de PCR, el sello del marco de PCR, el tubo de recuperación, el cartucho de solución y el cartucho de reactivo de la posición adecuada del instrumento automatizado con las manos enguantadas. Transfiera un cartucho de punta vacío a la posición de punta de desecho del instrumento automatizado con las manos enguantadas.Toque siguiente y cierre la tapa. A continuación, toque iniciar y limpie el instrumento automatizado con rayos ultravioleta durante cuatro minutos. Disuelva una tableta de clorito de sodio en 1.000 mililitros de agua ultrapura y filtre la solución con un filtro de 0,22 micras.Una vez que el instrumento de secuenciación se haya calentado, toque limpiar y siguiente en la pantalla del instrumento de secuenciación. Limpie el instrumento de secuenciación con 250 mililitros de solución de clorito de sodio esterilizada con filtro, luego 250 mililitros de agua ultrapura. A continuación, toque inicializar y seleccione el kit de secuenciación adecuado en la pantalla.Instale un cargador gris con las manos enguantadas. Inicialice el instrumento de secuenciación con la solución de lavado, la solución de ajuste de pH y la solución estándar de pH. A continuación, agregue 20 microlitros de nucleótidos DATP, DGTP, DCTP y DTTP en tubos de 50 mililitros con una pipeta de 100 microlitros.Instale un cargador gris en el lugar apropiado con las manos enguantadas. Cargue el tubo de 50 mililitros y enrósquelo en el instrumento de secuenciación. Seleccione siguiente en la pantalla para iniciar el paso de inicialización.Después de completar el paso de inicialización, toque ejecutar en la pantalla y seleccione el instrumento de preparación de biblioteca adecuado. Escanee el código de barras bidimensional del chip. Inserte el chip de secuenciación en la posición adecuada.Cierre la pinza de chip y la puerta del instrumento y toque chip check, next y OK en la pantalla para iniciar la ejecución de secuenciación. Después de la reacción de secuenciación, transfiera los datos y realice la canalización de análisis de datos en el servidor de secuenciación. Las cantidades absolutas de ADN y el valor RQ, un indicador del nivel de degradación del ADN genómico, muestran que se logra un mayor rendimiento de ADN utilizando las muestras de TIC en comparación con las muestras de FFPE.Además, los valores de RQ del ADN TIC fueron significativamente más altos en comparación con los del ADN FFPE en diferentes tipos de tumores. APC Q1367* se identificó tanto en FFPE como en TIC DNA extraído del sitio uno y APC S1356*KRAS G12D, y TP53 M237i se detectaron tanto en FFPE como en TIC DNA extraídos de los sitios dos, tres y cuatro, lo que sugiere que las mutaciones somáticas idénticas se identificaron en muestras emparejadas de FFPE y TIC DNA preparadas a partir del mismo sitio tumoral. En particular, se detectaron las mismas mutaciones somáticas entre el cáncer colorrectal primario y dos muestras de cáncer de hígado metastásico, lo que sugiere que los clones del tumor del sitio dos hicieron metástasis en el hígado.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación molecular y médica identificaran los cánceres genéticos.

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Investigación

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Cancer Research

Investigación del cáncer

Células tumorales circulantes son aislados de la sangre de pacientes con cáncer sin causar daño celular. El aislamiento de las células tumorales se logra usando una superficie bimolecular de E-selectina además de anticuerpos contra marcadores epiteliales. Un recubrimiento de nanotubos específicamente promueve la adhesión de las células cancerosas que resulta en purezas de captura altas.

Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

Este protocolo describe la detección por qPCR de citomegalovirus en tejido de biopsia fijado en formol e incluido en parafina, que es rápido, sensible, específico y útil para interpretar patrones equívocos de tinción de hematoxilina y eosina o inmunohistoquímicos.

qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

Este protocolo describe la disociación rápida no enzimática de fragmentos de tejido humano fresco para la evaluación cualitativa y cuantitativa de células CD45+ (linfocitos/leucocitos) presentes en varios tejidos humanos normales y malignos. Además, el sobrenadante obtenido del homogeneizado de tejido primario puede recogerse y almacenarse para su posterior análisis o experimentación.

Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

Aquí se describe una estrategia de extracción optimizado y eficiente para la recogida de bio-partículas presentes en "toque de ADN 'muestras, junto con un protocolo de amplificación mejorada que implica un / STR amplificación de un solo paso 5 l micro-volumen de lisis, para permitir la recuperación de repetición corta en tándem (STR) perfiles del donante (s) bio-partícula.

Mejorado el análisis genético de Soltero biopartículas Humanos Recuperadas por simplificado Micromanipulación de Evidencia Forense &#39;Touch ADN&#39;

Este manuscrito describe los protocolos clínicos para dos paneles de secuenciación de próxima generación. Un panel interroga a las neoplasias malignas hematológicas, mientras que el otro panel se centra en los genes comúnmente mutados en tumores sólidos. La clasificación molecular de las mutaciones impulsoras en las neoplasias malignas humanas ofrece información pronóstica y predictiva valiosa.

Siguiente Generación de secuenciación para la detección de mutaciones procesable en tumores sólidos y líquidos

Los tumores cutáneos se descartan a menudo después de la cirugía micrográfica de Mohs. Se describe aquí un protocolo que permite al personal de soporte clínico procesar y almacenar eficazmente muestras de tumores cutáneos ( por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular y melanoma) para aplicaciones de laboratorio aguas abajo sin interferir con las operaciones clínicas.

Establecimiento de un Biorepository basado en la Clínica

Presentamos un nuevo enfoque para caracterizar las células del tumor. Combinamos la inmunofluorescencia con ADN fluorescentein situ-hibridación para evaluar células capturadas por un alambre médico funcionalizado capaz de en vivo enriquecer CTC directamente de sangre del paciente.

Caracterización de células del Tumor mediante un alambre de médico para la captura de circulación de las células del Tumor: un enfoque 3D basada en la inmunofluorescencia y DNA FISH

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Este artículo describe un método para identificar alteraciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes de un paciente dado. Aunque los experimentos descritos aquí se centran en un tipo de tumor específico, el enfoque es ampliamente aplicable a otros tumores sólidos.

Análisis comparativo de lesiones a través de un enfoque de secuenciación dirigida

La caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) es un tema popular en la investigación traslacional. Este protocolo describe un ensayo de inmunofluorescencia semiautomática (IF) para la caracterización y enumeración de CTCs en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Este protocolo presenta un método para aumentar el porcentaje de contenido tumoral de las muestras de tejido incrustadas en parafina fijadas en formalina.

Mejorar el contenido tumoral a través de la macrodisección tumoral

Aprenda a extraer ADN tumoral de alta calidad mediante citología de impresión táctil para análisis genético en investigación oncológica. Este método simplifica el enriquecimiento celular y facilita la secuenciación de próxima generación.

Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil (Video) | JoVE Journal

Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

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