Visualización dinámica de lignificación en plantas con la química Click: doble etiquetado es felicidad!

El objetivo general de esta metodología de etiquetado dual es observar las zonas de lignificación activa de los tejidos vegetales. En este flujo de trabajo, la estrategia del reportero químico se aplica utilizando dos reporteros químicos distintos en una combinación secuencial de reacciones químicas de clic bioortogonales. Este método puede ayudar a descifrar preguntas clave en el campo de la biología vegetal, como determinar qué factores regulan la formación espacial o temporal de lignina dentro de las plantas y las paredes.

La principal ventaja de esta técnica es que se dirige exclusivamente a la lignina que se produce durante la incorporación metabólica. Lo diferencia de cualquier lignina preexistente en la muestra. Aunque originalmente desarrollamos este método para estudiar las banderas de lignificación, podría usarse con otras especies como la arabidopsis, el álamo o cualquier otra planta que produzca lignina.

Para presentar esta técnica, tenemos a Clemence Simon, estudiante de doctorado que trabaja en la interfaz entre la química y la biología, y que está utilizando esta técnica para estudiar la dinámica de la lignificación. Primero, prepare una solución de reportero químico de 300 microlitros que contenga diez micromuller de reportero G marcado con alcinas. Y diez micromuller de H reportero marcado con azida y medio estéril líquido 1/2 MS.

Agite la solución en vórtice y transfiérala a un pocillo de una placa de 48 pocillos con una pipeta de transferencia. Prepare una solución de control negativo de 300 microlitros que contenga diez micromuller de G y diez micromuller de H y un medio líquido estéril de 1/2 MS. Agite la solución en vórtice y transfiérala a un segundo pocillo de la misma placa de 48 pocillos.

Con una cuchilla de afeitar limpia, corte el tallo de una planta de lino de dos meses a diez centímetros sobre el nivel del suelo. Prepare diligentemente 50 secciones transversales del tallo a mano alzada con la cuchilla de afeitar y colóquelas inmediatamente en un medio de 1/2 MS. A continuación, seleccione secciones transversales enteras e intactas y distribuya al azar diez de ellas en el pocillo lleno de la solución reportera química, teniendo cuidado de no dañar el tejido.

Las secciones transversales deben cortarse firme y limpiamente, y la sección transversal debe ser recta. Necesitas una mano firme y una hoja de afeitar afilada para mantener los tejidos intactos. Se aconseja practicar de antemano.

Después de distribuir diez secciones transversales intactas en la solución de control negativo, incube la placa a luz continua en una cámara de crecimiento a 20 grados centígrados durante 20 horas. Al día siguiente, retire la solución monoligninal de cada pocillo con una micropipeta. Agregue 500 microlitros de medio 1/2 MS a cada pocillo y revuelva suavemente durante diez minutos.

A continuación, retire la solución de enjuague con una micropipeta. Prepare un mililitro de una solución de cicloadición de azida-alcina promovida por cepa. Contiene cinco micromuller de colorante fluorescente marcado con cicloocteno y medio estéril líquido 1/2 MS.

Luego, vórtice la solución. Después de los pasos finales de lavado del protocolo de incorporación metabólica, retire el medio 1/2 MS y agregue 300 microlitros de la solución SPAAC a cada pocillo con una micropipeta. Proteja la placa de 48 pocillos de la luz colocándola en una caja.

Luego, agite suavemente la placa en un agitador mecánico durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de esto, lave cada pocillo cuatro veces con 1/2 MS medio como se describió anteriormente, mientras mantiene la placa en la oscuridad. Prepare un mililitro de solución de cicloadición de alcina azida catalizada por cobre que contiene ascorbato de sodio, sulfato de cobre y colorante fluorescente marcado con azida, y medio líquido estéril 1/2 MS.

A continuación, vórtice la solución. Después de retirar la 1/2 MS del medio, coloque la placa en una caja y añada 300 microlitros de la solución de CuAAC a cada pocillo con una micropipeta. Revuelva suavemente la placa en una coctelera mecánica durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente.

Retire la placa del agitador mecánico y retire la solución de CuAAC de cada pocillo con una micropipeta. Luego, agregue 500 microlitros de medio 1/2 MS y revuelva la placa en el agitador mecánico durante diez minutos en la oscuridad. Después de lavar dos veces más con medio 1/2 MS, agregue 500 microlitros de una solución de metanol y agua 7:3 a cada pocillo.

Revuelva la placa en el agitador mecánico durante una hora en la oscuridad. Luego, retire la solución de los pozos. A continuación, agregue 500 microlitros de medio 1/2 MS a cada pocillo y revuelva en la oscuridad durante diez minutos.

Después de repetir este lavado cuatro veces, mantenga las secciones transversales almacenadas en medio de 1/2 MS, protegidas de la luz. Coloque cinco gotas de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Luego, deposite con cuidado cada sección transversal etiquetada con un reportero químico en el portaobjetos.

Aplica esmalte de uñas en dos lados opuestos del portaobjetos. Cubra el portaobjetos con un cubreobjetos, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire. Luego, retire el exceso de medio de montaje con una toalla de papel.

Después de esto, selle la muestra con esmalte de uñas en los cuatro lados. Después de que el esmalte de uñas esté seco, guarde los portaobjetos a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta que los observe bajo un microscopio confocal. Las secciones de la planta tienden a ponerse crujientes cuando se secan.

Asegúrese de mantenerlos siempre en solución y de sellar los cubreobjetos con esmalte de uñas en todos los lados. Aumenta la vida útil de las guías montadas. Coloque el portaobjetos de muestra en la platina del microscopio debajo de la lente del objetivo.

Observe y gire la muestra para identificar la región deseada del tejido vegetal. A continuación, seleccione el plano más fluorescente en el eje Z. Ajuste la ganancia, el desplazamiento y la potencia del láser para lograr la distribución óptima de la señal a lo largo de todo el rango de niveles de gris para cada canal.

Por último, adquiera imágenes confocales de alta calidad. BLISS proporciona tres mapas de localización de color de la lignina dentro de las paredes celulares de la planta, se dirige exclusivamente a la lignina producida in novo durante la incorporación metabólica y la diferencia de la lignina preexistente en la muestra. Destaca los sitios de lignificación activos dentro de diferentes tejidos de un órgano, dentro de diferentes tipos de células de un tejido, o dentro de diferentes capas de pared o subestructuras de una célula.

Los perfiles de incorporación de indicadores de G y H marcados con alcinas desde el cambium hasta la médula dentro del xilema secundario de lino indican que la lignificación máxima se alcanza rápidamente en las traqueidas de las fibras durante el desarrollo, mientras que las células de raza continúan incorporando lignina en etapas mucho más tardías de su vida. La variación de la proporción de indicadores químicos demuestra que la composición de lignina en los tejidos secundarios del xilema depende directamente de la disponibilidad monoligninal dentro de las paredes celulares. En lugar de en la peroxidasa o la especificidad de la lacasa durante la polimerización de la lignina.

La incorporación de reporteros químicos se limita a las esquinas celulares y a la pared celular primaria de la lámina media de algunas fibras de líber, pero no de todas. En las raíces de lino, los reporteros químicos se incorporan a las paredes de las células endodérmicas donde la banda de casparia está ausente. Para una mejor visualización de la arquitectura de tejidos, también se pueden generar reconstrucciones de pilas Z en 3D.

Después de esta imagen, también se puede realizar un procesamiento de datos completo. Tomando todas las precauciones, es posible obtener resultados constantes por comparación relativa, leyendo una muestra entre diferentes muestras. Se puede hacer además de la localización de líderes activos de diversas áreas.

Este método es una herramienta maravillosa para los biólogos de plantas como yo que estudiamos la pared celular. Una vez que se domina, se puede hacer en unas pocas horas. Es muy sensible y se puede aplicar a toda una gama de diferentes sistemas de modelos experimentales in vitro in vivo.

La aplicación de la estrategia del reportero químico a la lignina allana el camino para que los biólogos químicos exploren la dinámica de la lignificación y descubran qué controla este proceso de polimerización, que en muchos aspectos, todavía constituye un territorio inexplorado.