Visualizar leucocitos del balanceo y adherencia en angiotensina II-infundido ratones: técnicas y trampas

El objetivo general de este protocolo de microscopía de video intravital de epifluorescencia, o IVM, de vasos sanguíneos, es visualizar y cuantificar el balanceo y la adhesión de los leucocitos en las arterias corroídas en la hipertensión inducida por angiotensina II en ratones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la patología de la disfunción vascular y la hipertensión arterial, como el mecanismo de interacción entre los leucocitos y, en particular, los lisosomas y las células positivas, y el trabajo de los vasos. La principal ventaja de esta técnica es que podemos ver las interacciones in vivo entre las células sanguíneas circulantes y la comprensión vascular.

Preparar un ratón macho para la cirugía después de siete días de tratamiento con angiotensina dos con una bomba osmática según el texto protol. Aplique ungüento oftálmico sobre los ojos para protegerlos durante el procedimiento. Colocar al animal anestesiado en decúbito dorsal sobre una placa quirúrgica de 39 grados centígrados e insertar una sonda rectal para mantener la temperatura.

Use un hisopo de algodón para esparcir y frotar la crema depilatoria en el cuello hasta que el vello comience a caerse. Luego, después de 2 minutos adicionales, use una espátula para eliminar los pelos y la crema. Luego, desinfecte la piel usando un antiséptico cutáneo alcohólico.

A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, realice una incisión longitudinal de 1 a 1,5 cm en la piel del cuello, a 1 cm de la tráquea. Luego, haga 2 incisiones perpendiculares en cada extremo de la primera incisión. Retire con cuidado el tejido justo debajo de la piel y retire el trozo de piel que cubre la vena yugular izquierda y la tráquea.

A continuación, utilice dos pinzas curvas para aislar cuidadosamente las glándulas corroídas sublingual y submaxilar de la zona de interés. Mientras tiene cuidado de no cortar o dañar las glándulas, colóquelas para permitir el mejor acceso a la vena yugular y a las correcciones. Luego, para aislar la vena yugular, inserte pinzas delgadas entre el vaso y el tejido circundante, y abra y cierre lentamente el instrumento para liberar suavemente la vena del tejido.

Una vez que la vena yugular esté completamente limpia, coloque las pinzas debajo del vaso y coloque dos suturas 7-0 de 10 cm de largo debajo. Haz dos nudos para cerrar la sutura proximal a la cabeza y con la segunda sutura, prepara un nudo, pero no lo cierres. Ahora, con pinzas en una mano, sostenga el catéter lleno de solución salina estéril a 37 grados centígrados, luego, con la otra mano, use tijeras o una aguja curva de calibre 26 para hacer una pequeña incisión en el vaso.

Inserte el catéter en la vena yugular y cierre el nudo dos veces. A continuación, cierre la sutura proximal a la cabeza sobre el catéter para asegurar una inmovilización completa. Para aislar y preparar las arterias corroídas, use pinzas curvas delgadas para diseccionar el área que cubre la tráquea.

Luego, una vez que los corroídos estén libres de los tejidos circundantes, retire el nervio vegas del vaso sin cortarlo, cerrando y abriendo lentamente las pinzas delgadas, si es necesario, para movilizar suavemente el nervio. Una vez que ambas arterias estén completamente limpias, coloque las pinzas debajo de la primera arteria corroída y, teniendo cuidado de no estirar demasiado el vaso, coloque un pequeño soporte de recipiente de plástico negro de 3 mm por 2,5 cm debajo del vaso. Una vez que el soporte del vaso esté en su lugar, asegúrese de que el flujo sanguíneo esté presente.

Para evitar estirar el vaso, la mano del operador debe moverse lo menos posible con un solo movimiento de las primeras pinzas para aislar la arteria corroída y la ayuda de las segundas pinzas para hacer un agujero debajo del vaso. Cuando el soporte del recipiente esté colocado correctamente, coloque la segunda arteria sobre el dispositivo. Si el ratón no se coloca directamente bajo el microscopio, vuelva a colocar las glándulas sobre la tráquea y aplique solución salina estéril a 37 grados centígrados para evitar que la zona se seque.

En una jeringa de 1 mL, prepare una dilución de 1 a 4 en solución salina estéril de una solución madre descongelada de 2 mg por ml de naranja de acridina. Proteja la jeringa de la luz. Para llevar a cabo las mediciones, coloque el ratón bajo un microscopio de florescencia de campo amplio y alta velocidad utilizando un condensador de larga distancia y un objetivo de inmersión en agua 10x con un monocromador, un divisor de haz y una cámara CCD.

Adquiera imágenes en tiempo real enfocando el objetivo en el centro de la arteria corroída en la superficie endotelial. Inyecte lentamente 50 mL de naranja de acridina. A continuación, configure el software para que grabe 100 imágenes, con un tiempo de exposición de 120 milisegundos por imagen.

Grabe cuatro videos por arteria corroída en diferentes lugares de la arteria para cada video. Si la señal fluorescente disminuye, inyecte otros 50 mL de naranja de acridina. Para probar diferentes condiciones, inyecte la naranja de acridina directamente en la vena lateral de la cola si no se insertó un catéter yugular y realice la misma adquisición de imágenes.

Como control, registre las mediciones de florescencia de ratones positivos para lys-Mcre e IRG positivos sin inyectar. Cuantifique las celdas de rodadura y adherencia en una vista rectangular de 200 micras por 250 micras colocadas en el centro del recipiente para cada video, que se muestran a una velocidad de 10 imágenes por segundo. Cuente las celdas de rodadura y adherencia.

Las células de adherencia se definen como células que no se mueven ni se separan del endotelio en el video de 10 segundos. Para simplificar la cuantificación, elimine el canal con la fluorescencia roja y use solo la fluorescencia verde para contar las células rodantes y adheridas. En este estudio, se observaron los corroídos de ratones lis-mCre positivos, IRG positivos infundidos con angiotensina 2, utilizando IVM.

Como se observa aquí al inicio, la presencia de un catéter yugular dio lugar a la adhesión de células fluorescentes lis-M-positivas. Después de la inyección de naranja de acridina, las células endoteliales también fueron fluorescentes. Luego, la reducción del fondo para limitar la fluorescencia relacionada con el endotelio, reveló que todas las células nucleadas adheridas eran lis-M positivas.

En este experimento, después de una semana de infusión de angiotensina 2, se obtuvieron imágenes y visualizaron por IVM, con o sin inyección de naranja acridina, a través de un catéter yugular yugular o a través de la vena de la cola. Sin ningún catéter o inyección, el rodamiento de las células lis-M positivas aumentó significativamente después de la infusión de angiotensina 2, en comparación con los ratones no tratados. Y también se incrementó la adherencia.

La inyección de naranja de acridina con catéter yugular aumentó la adherencia y el rodadura en ratones tratados con angiotensina 2, en mayor medida en comparación con los ratones sin catéter. Finalmente, como se ve en estos paneles, la inyección de naranja de acridina en la vena de la cola, conduce a una adhesión y rodadura similares en comparación con los ratones que no recibieron inyección de naranja de acridina. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en treinta minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe dañar los tejidos que rodean los vasos. Tras su desarrollo, esta técnica abre el camino para que los investigadores del campo cardiovascular y hemostático exploren in vivo la adhesión de leucocitos y plaquetas a la pared vascular. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo limitar el impacto de la inyección de tinte y la cirugía en la MIV.

No olvide que trabajar con tintes fluorescentes intercalados puede ser extremadamente peligroso, y debe evitarse el contacto de la piel con el tinte con el material adecuado, como guantes.