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Las interacciones proteína-proteína juegan un papel importante en una amplia variedad de funciones biológicas. La mayoría de las interacciones proteína-proteína y sus efectos biológicos aún no se han identificado. La coinmunoprecipitación, o CoIP, y los ensayos pull-down son dos métodos estrechamente relacionados para la identificación de interacciones estables proteína-proteína. Este video cubrirá los principios de los dos ensayos, sus procedimientos generales de laboratorio y las aplicaciones de estas técnicas.
Los ensayos CoIP y pull-down son variantes de la inmunoprecipitación, un método para aislar selectivamente una especie de proteína de una solución compleja. En un experimento de inmunoprecipitación, se permite que un anticuerpo específico contra una proteína diana forme un complejo inmunitario con esa diana en la muestra. A continuación, el complejo se captura en un soporte sólido, normalmente proteína A unida a una perla de sepharose. Las proteínas no capturadas se eliminan mediante pasos de centrifugación. A continuación, la proteína se libera del anticuerpo y del soporte sólido mediante la ebullición en el tampón reductor de carga de muestras SDS-PAGE.
La coinmunoprecipitación se lleva a cabo de la misma manera, excepto que los complejos de proteínas intactos se capturan en el soporte sólido. El anticuerpo se une a la proteína diana, que, a su vez, se une a otra proteína que no es objetivo del anticuerpo. Al igual que en la inmunoprecipitación, el complejo proteico se libera del anticuerpo y del soporte sólido mediante la ebullición en el tampón de carga de muestra SDS-PAGE, que reduce.
Los ensayos pull-down son similares a la coinmunoprecipitación, diferenciándose solo en el uso de una proteína "cebo", en lugar de un anticuerpo. A través de técnicas de biología molecular, esta proteína de cebo se diseña con una etiqueta de afinidad, como una serie de residuos de histidina. Estas etiquetas de afinidad se describen en "Separaciones de biomoléculas basadas en cromatografía". A continuación, la proteína se captura en un ligando de afinidad inmovilizado específico para la marca. A continuación, la proteína capturada se incuba con una muestra que contiene proteínas que forman complejos con el "cebo". El complejo proteico se libera del soporte de afinidad mediante el lavado con una solución que contiene un analito competitivo específico para la etiqueta en la proteína "cebo". Los ensayos pull-down son útiles para confirmar las interacciones de proteínas predichas por coinmunoprecipitación y para descubrir interacciones de proteínas desconocidas.
Ahora que se han discutido los principios de la co-inmunoprecipitación y los ensayos pull-down, echemos un vistazo a sus procedimientos de laboratorio.
En primer lugar, hablemos de la coinmunoprecipitación. A una serie de tubos de microfuga se les añade: tampón PBS y una solución al 50% de proteína A-sepharose, un complejo resina-proteína que se une al anticuerpo. Los tubos de microfuga se giran para garantizar una distribución adecuada, y luego la resina se lava con tampón PBS adicional. El lisado celular, que contiene la proteína deseada, y 2 μg de anticuerpo se añaden a los tubos de microfuga, y la mezcla se rota durante 1 h a 4 μC. Las perlas se granulan por centrifugación, el sobrenadante se desecha y las perlas se vuelven a lavar tres veces con tampón para eliminar las proteínas no unidas. Las perlas que contienen el complejo anticuerpo-proteína se encuentran en el tampón reductor de carga de muestras SDS-PAGE, para la eliminación del complejo del anticuerpo y para el análisis mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia.
Ahora discutiremos el procedimiento para los ensayos pull-down: La proteína "cebo" se expresa en un plásmido con la etiqueta de afinidad adecuada. Después de alcanzar el crecimiento en fase logarítmica, las células se lisan y luego se centrifugan. Las perlas suspendidas de estreptavidina-sefarosa, que capturan la proteína "cebo" marcada con biotina, se pipetean en un tubo de microfuga. A continuación, las perlas se centrifugan y el sobrenadante se elimina cuidadosamente por aspiración. A continuación, las perlas se lavan con tampón, se centrifugan y se elimina el sobrenadante.
Las células que contienen la proteína "presa" putativa, que tiene afinidad por la proteína "cebo", se recolectan por centrifugación. A continuación, el sobrenadante se añade al tubo de microfuga que contiene la resina y se incuba a 4 ? C durante 3 h en una coctelera. A continuación, la resina se centrifuga, se elimina el sobrenadante y se lava la resina para eliminar las proteínas no unidas. Se añade tampón de elución a la resina y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador. A continuación, la resina se centrifuga y el sobrenadante que contiene el complejo deseado se analiza mediante inmunotransferencia.
Ahora que hemos revisado los procedimientos, veamos algunas de las aplicaciones útiles de la coinmunoprecipitación y los ensayos pull-down.
La coinmunoprecipitación puede ser útil para comprender mejor el mecanismo de acción de las enzimas. Las proteínas de resistencia a los mixovirus, o Mx, inhiben una amplia gama de virus, incluida la gripe A, cuyo mecanismo no se conoce bien. Se utilizó la coinmunoprecipitación para estudiar la interacción entre la proteína Mx1 del ratón y la nucleoproteína de la gripe.
Los ensayos pull-down han demostrado ser útiles para estudiar los efectos de los segundos mensajeros, que son proteínas que comunican una señal desde el entorno celular. Son un componente de una vía de señalización en la que múltiples proteínas interactúan en respuesta a señales ambientales. Los iones de calcio actúan como mensajeros secundarios al unirse a la calmodulina, que, a su vez, se une a una amplia variedad de proteínas, mediando muchos tipos de respuestas biológicas. Sin el calcio, la proteína no puede unirse a la calmodulina. Se llevó a cabo un ensayo pull-down para probar la capacidad de las proteínas para unirse a la calmodulina en presencia o ausencia de iones de calcio.
Los ensayos de coinmunoprecipitación y pull-down se utilizan generalmente para analizar interacciones proteicas estables o fuertes, pero no transitorias. Un desarrollo reciente en los ensayos pull-down, el HaloTag, ha simplificado el estudio de las interacciones transitorias de las proteínas; HaloTag es una etiqueta de fusión de proteínas codificada genéticamente, fusionada con la proteína de interés, capaz de reaccionar químicamente con un soporte sólido de haloalcano. Si se desea un análisis funcional, el complejo proteico, menos la etiqueta, en su totalidad podría aislarse mediante incubación con la proteasa del virus del grabado del tabaco.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la coinmunoprecipitación y los ensayos pull-down. Este video describe los principios de los dos métodos, los procedimientos generales de laboratorio y algunas de sus aplicaciones.
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