En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Seguimiento in vivo de una sola molécula en la terminal nerviosa motora presináptica de Drosophila. Esta técnica describe cómo se pueden rastrear e obtener imágenes de proteínas individuales in vivo en las terminales nerviosas motoras de las larvas de Drosophila de tercer estadio. La principal ventaja de esta técnica es que permite obtener imágenes, rastrearlas y localizarlas proteínas individuales a altas resoluciones similares a las observadas en los sistemas in vitro.

Diseño de Drosophila transgénica. La proteína sináptica de interés está marcada con un fluoróforo fotoconvertible, y esto se expresa en Drosophila melanogaster. Disección de la larva de Drosophila de tercer estadio.

Coloque una larva errante de tercer estadio en una base de Sylgard de forma cilíndrica o semicilíndrica. Añade 40 microlitros de Schneider's Insect Medium sobre la larva. Bajo un microscopio de disección, se clava un alfiler minucioso en la cabeza y otro en la cola de la larva para inmovilizarla.

Para proporcionar acceso, use un alfiler de minutién para hacer una incisión estrecha en la línea media del lado dorsal de la región abdominal de la larva. Desde este punto de incisión, con unas tijeras de resorte, corte a lo largo de la pared del cuerpo en la dirección anteroposterior. Retire los órganos internos de la larva con la ayuda de pinzas finas y tijeras de resorte.

Lave la larva diseccionada con el medio para insectos de Schneider. Pegue dos alfileres minuciosos a través de cada una de las dos solapas de la pared del cuerpo para producir una preparación de larva disecada en forma de hexágono. Use unas tijeras de resorte para separar el cerebro de la larva del cordón nervioso ventral.

Con unas pinzas curvas, empuje los alfileres minuciosos en la base de Sylgard. Microscopía de localización fotoactivada de seguimiento de una sola partícula. Invierta la base Sylgard de la larva en un plato de cultivo con fondo de vidrio lleno de dos mililitros de medio para insectos de Schneider a temperatura ambiente.

Aplique agua sobre el objetivo de inmersión en agua 63x de un microscopio ELYRA PS.1 y luego coloque el plato en la plataforma. Encienda la luz transmitida y utilice el ocular para localizar la larva en la base Sylgard con la ayuda del objetivo aéreo 10x. Cambie al objetivo de inmersión en agua de 63x e identifique el músculo seis, utilizando la iluminación de campo brillante.

Con el software de adquisición ZEN Black, seleccione la configuración de fluorescencia de reflexión interna total, TIRF. Cambie el láser de 488 nanómetros para visualizar eMos2 en verde. Localice las uniones neuromusculares, que parecen cuentas en una cuerda, y adquiera una imagen TIRF de baja resolución, encienda simultáneamente el láser de 405 nanómetros y el láser de 561 nanómetros para fotoconvertir e obtener imágenes de las especies rojas eMos2.

Utilice una potencia láser muy baja para el láser de 405 nanómetros para permitir fotoconversiones estocásticas moderadamente constantes. Aquí, un láser de 405 nanómetros funciona al 0,09%mientras que un láser de 561 nanómetros funciona al 50%En las opciones de ángulo TIRF del software, deslice ligeramente el ángulo crítico TIRF. Ajusta el tiempo de exposición a 30 milisegundos.

Adquirir una serie temporal de imágenes de la unión neuromuscular. Aquí se adquirió una película de 15.000 fotogramas. Guarde la película como un archivo en formato czi.

análisis de datos. Analice las películas adquiridas con un software analítico de seguimiento molecular único adecuado. Localice las coordenadas x e y de la localización de cada proteína fluorescente mediante el ajuste gaussiano de la función de dispersión del punto de intensidad.

Para trazar la trayectoria de cada localización, establezca un umbral de un mínimo de ocho apariencias continuas de fotogramas diferentes para cada localización y un máximo de tres píxeles de movilidad entre cada fotograma. Obtenga la imagen de trayectoria, el desplazamiento cuadrático medio, así como el coeficiente de difusión de todas las localizaciones rastreadas. Resultados representativos.

Se graficó el desplazamiento cuadrático medio de las trayectorias individuales de Syntaxin-1A-eMos2 desde múltiples uniones neuromusculares en tres larvas diferentes, como media más menos error estándar de media. También se graficó el área bajo la curva de desplazamiento cuadrático medio. El coeficiente de difusión de la sintaxina-1A-mEos2 se obtuvo de manera similar a partir de múltiples uniones neuromusculares y se trazó como un histograma de la distribución de frecuencia relativa.

El umbral del coeficiente de difusión reveló dos poblaciones de Syntaxin-1A, una móvil y otra inmóvil. Se calculó la relación entre las poblaciones móviles e inmóviles de sintaxina-1A-mEos2. Conclusión. Este video debería proporcionar una comprensión de cómo se puede llevar a cabo el seguimiento de una sola proteína en la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila.

La técnica proporciona una forma para que los investigadores en el campo de la comunicación neuronal visualicen y observen la movilidad y organización de proteínas individuales a altas resoluciones in vivo.