Name: En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprende a rastrear moléculas individuales in vivo en terminales presinápticas de Drosophila melanogaster mediante microscopía PALM. Este método permite visualizar la dinámica de proteínas sinápticas con alta resolución.

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Agradecemos a Jean-Baptiste Sibarita y Daniel Choquet (IINS, CNRS y la Universidad de Burdeos) por su apoyo con el análisis de una sola molécula. Agradecemos especialmente a Nick Valmas y Jessica Mcgaw (QBI, Universidad de Queensland) para su ayuda con el video grabación, voz en OFF, así como diseño gráfico de la figura. Este trabajo fue financiado por el proyecto de descubrimiento de Consejo de investigación australiano (AR) (DP170100125 a F.A.M.), la Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864 a F.A.M.), beca del futuro (FT100100725 a B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 a F.A.M). y proyecto de NHMRC (APP1103923 a B.V.S.). F.A.M. es NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).

1. diseño de transgénicos Drosophila expresando las proteínas con etiqueta mEos2
<ol><li>Seleccione la proteína a ser etiquetados con la proteína mEos2. Para aumentar la tasa de éxito de imagen, seleccione las proteínas con un dominio de transmembrana en la membrana plasmática neuronal14 (p. ej., sintaxina-1A), proteínas de vesículas sinápticas o autophagosomes26,27 (p. ej., Synaptobrevin-2), o proteínas citosólicas con estrecha interacción con las proteínas de la membrana plasmática neuronal (por ejemplo, Munc18-1).</li>
	<li>La construcción de los transgenes que codifican la proteína mEos2-la etiqueta (figura 1). Diseño de los cebadores para la proteína y mEos2 hacia adelantados y hacia atrás. Nota: La secuencia de codificación de mEos2 puede ampliarse desde el plásmido pmEos2-N1, que está diseñado para fundirse en el c-término de la proteína de interés. La clonación puede realizarse por ejemplo por la recombinación en vivo en Saccharomyces cerevisiae mediante el pFL44S-attB-MCS-w + vector de14,28, alternativamente se podrían utilizar otros métodos de clonación como Gibson Protocolo de Asamblea29.<ol>
<li>Alinear el vector con BamHI y XbaI y co se transforman en células de levadura ura3- junto con los fragmentos PCR codificación mEos2 y la proteína de interés. Inyectar la construcción para generar una línea de mosca transgénica30embriones de Drosophila .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posterior de las culturas mosca transgénicas en medio estándar de levadura y melaza o algunos otros sustituto adecuado contenidas en frascos de plástico. Para garantizar el sano y bastante grande de botones sinápticos31, evitar hacinamiento moscas en los frascos y tapa vuela a viales nuevos después de cada día de la puesta de huevos; de esta manera las larvas de tercer estadio se alimentan bien y alcanzan el tamaño adecuado en el momento en que comienzan vagando en el medio. Levantar la mosca transgénica a temperatura ambiente (25 ° C). Nota: Botones sinápticos más grandes tienden a producir mayor cantidad de proteínas visualizadas durante proyección de imagen.</li>
</ol>2. disección de la Larva de tercer estadio
<ol><li>Hacer un ≤20 base cilíndrica o semicilíndrica forma polydimethylsiloxane (PDMS) mm de diámetro y ≤20 mm de altura usando un kit de elastómero de silicona adecuado (figura 2A). Mezcla de elastómero de silicón con una silicona de endurecimiento a agente a una relación de 10:1.<ol>
<li>Removemos la mezcla durante 5 minutos, verter la mezcla en un molde con los dimsensions mencionada. Dejar endurecer en el horno a 100 ° C por 45 min. La base PDMS servirá como la base sobre la que realizar la disección. Asegúrese que la base PDMS se en el pozo de una placa de cultivo con fondo de cristal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione un errante tercera larva de estadio de la pared del frasco. Usar un microscopio estéreo óptico aumento 4.5 para visualizar la larva a la base cilíndrica de PDMS con el lado dorsal hacia arriba.</li>
	<li>Curva y ángulo de pinzas palillo minutien alfileres en la cabeza sobre los ganchos de la boca, entre los dos extender espiráculos anteriores y en la cola durante el ano, entre los dos espiráculos posteriores. Agregar 40 μl de medio insectos de Schneider a temperatura ambiente sobre la larva inmovilizada. Nota: Hemolyph-como soluciones (HL3 o HL6) pueden usarse en lugar solución32,33 de Schneider.</li>
	<li>Acceso por el lado dorsal de la pared abdominal del cuerpo de la larva por el uso de un pin minutien para incidir en la línea media de la pared.</li>
	<li>Uso muelle tijeras para cortar la pared del cuerpo se abren desde el punto de incisión. Corte a lo largo de la línea media en la dirección antero-posterior34.</li>
	<li>Usar pinzas finas y tijeras para desentrañar la larva del resorte: retirar los órganos internos, incluyendo las glándulas salivales, tráquea y el intestino. Lave la larva dos veces con medio insectos de Schneider.</li>
	<li>Con pinzas finas, mantener las dos aletas de la pared del cuerpo, suavemente estira hacia fuera y pegar minutien pasadores a cada lado. Esto deberá producir una preparación en forma de hexágono (figura 2A).</li>
	<li>Separar el cerebro de la cuerda ventral del nervio con unas tijeras de muelle para reducir la posibilidad de movimiento de los músculos durante la proyección de imagen; también sirve para mantener la preparación contra el plato de imagen. Utilice las pinzas curvas para empujar los seis pernos de minutien en la base PDMS. Nota: Sólo una pequeña porción de los pernos debe ser embebida dentro de la pared abdominal.</li>
	<li>Para confirmar que la larva ha sobrevivido el procedimiento de disección, empujar ligeramente el cordón nervioso ventral, esto debe provocar una contracción peristáltica de la pared abdominal de la larva.</li>
</ol>3. microscopía de rastreo de la solo-partícula iluminación ligeramente oblicua
<ol><li>Invertir la base disecada larva-PDMS en una placa de cultivo con fondo de cristal. Llene el plato de imagen con 2 mL de insectos medio temperatura ambiente Schneider (figura 2B).</li>
	<li>Localizar las neuronas motoras en los segmentos segundo y terceros con sinapsis en los músculos abdominales 6 y 735 usando el x 63 / 1.2 objetivo de inmersión en agua de NA en un microscopio de fluorescencia (TIRF) fluorescente reflexión interna total.</li>
	<li>Usar los oculares del microscopio para localizar a la larva disecada; identificar el músculo 6 por el uso de la iluminación de campo claro.</li>
	<li>Utilizar el software de adquisición de microscopio (véase Tabla de materiales), en configuración de TIRF. Deslice el ángulo de la cámara de colimador para 1° a aumentar la profundidad de penetración, de lo contrario salir de ángulo crítico TIRF para lograr iluminación oblicua.</li>
	<li>Encienda el láser de 488 nm para visualizar mEos2 en verde. Utilizar una potencia de láser de baja (menos del 5% de 22.8 mW) para evitar el blanqueo de la fluorescencia verde. Localizar a las uniones neuromusculares (que parecen perlas en una cadena) y adquirir una imagen de baja resolución TIRF.</li>
	<li>Al mismo tiempo encienda el 405 nm láser (mEos2 de photoconverts de verde a rojo especies) y 561 nm láser (imagen de la mEos2 de photoconverted rojo) estocástico localizar proteínas fluorescentes solo mEos2. Nota: Se recomienda usar de baja potencia de laser 405 nm (0.005 a 0,9% de 4.78 mW), esto permite una tasa de photoconversion relativamente constante durante la adquisición de película. Entre 50 y 75% de los 561 nm láser (20.1 mW), ya que esto es suficiente para adquirir la fluorescencia de las especies de mEos2 rojo sin afectar la morfología del tejido muscular que rodea la Unión neuromuscular.</li>
	<li>Para cada cadena de la Unión neuromuscular, adquieren un tiempo serie compuesta por Marcos de 15.000 o más a 33 Hz. guardar formato de as.czi para preservar el acompañamiento metadatos de referencia.</li>
	<li>Utilizar ImageJ para convertir archivos de películas de '.czi' 'TIFF'.</li>
	<li>Analizar las películas adquiridas con una sola molécula conveniente seguimiento de software analítico11,14,36 como TrackMate en FIJI/ImageJ37 (véase Tabla de materiales). Localiza la 'x' e 'y' extensión de coordenadas de cada localización por el ajuste gaussiano intensidad del punto de la función (PSF). Nota: resolución de problemas: Si la fluorescencia verde no se observa o es muy débil en la Unión neuromuscular a la exposición al láser de 488 nm, brevemente encender el photoconverting y proyección de imagen láser (405 nm y 561 nm), ya que esto ayuda a producir más de la red especie de mEos2. Cambiar a los láser de 488 nm y tomar una imagen TIRF.</li>
</ol>4. una sola molécula localización en larvas fijadas
<ol><li>Para medir el tamaño de nanoclusters de proteínas vía Palma, sustituir medio insectos de Schneider después de la disección con un fijador - paraformaldehído al 4% diluido en tampón fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Incubar la larva durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Quitar la disección de los pernos y coloque la larva fija de 1,7 mL transparente tubo de microcentrífuga de cierre rápido.</li>
	<li>Disecar y fijar como muchas otras larvas según sea necesario, luego lavan tres veces con PBS.</li>
	<li>Reemplazar el PBS con tampón de bloqueo (una solución de suero normal de cabra PBS, 0,1% Tritón X-100 y 3%).</li>
	<li>Lavar las larvas con PBS tres veces y luego incubar con el anticuerpo primario necesario (diluido en la solución de tampón de bloque).</li>
	<li>Incubar durante una noche a 4 oC.</li>
	<li>Lavar las larvas tres veces con PBS, luego incubar con el anticuerpo secundario necesario (diluido en la solución de tampón de bloque).</li>
	<li>Lave las larvas tres veces con PBS, fije la larva en la base PDMS y la imagen como se describió anteriormente para el rastreo de una sola molécula.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe el seguimiento de una sola molécula de proteínas mEos2-etiquetado en la Unión neuromuscular de la Drosophila tercer instar larva. Para evitar la sobre expresión de la proteína transgénica, sintaxina-1A-mEos2 expresión fue impulsado por endógeno promotor de la sintaxina 1A. Estudios de movilidad de la proteína sináptica han sido limitados a las investigaciones en vitro de cultivos de células y neuronas corticales9,11,12,13. Si estas proteínas exhiben firmas similares de movilidad en un animal vivo es en gran parte desconocido. Para visualizar solo proteína movilidad en vivo, limitaciones tales como la profundidad óptica de la transparencia, la accesibilidad y la penetración tienen que ser superado. Por disección la preparación larvas y visualizar las uniones neuromusculares encajadas la superficie del músculo, evitamos el tema de la transparencia óptica y la accesibilidad. Intentos de movilidad de una sola molécula de imagen en la configuración normal de la TIRF probaron fracasados. Sin embargo, el uso de iluminación ligeramente oblicua permite láser de excitación mayor profundidad de penetración. Además, los pernos de minutien usados para inmovilizar, la larva ha ayudado a evitar cualquier posible efecto adverso de uso anestésico sobre la movilidad de la proteína. Es posible utilizar objetivos de aumento mayor, como 100 x objetivos de inmersión de aceite, para visualizar las moléculas individuales en vivo. Sin embargo, mayor ampliación puede aumentar la ocurrencia de desvíos de la deriva fuera de foco. Además, hemos utilizado una intensidad más baja (~ 30%) 561 nm láser con éxito a las moléculas individuales de la imagen en las terminales del nervio motor. Pruebas adicionales se requiera utilizar menor energía del laser.
Este protocolo es conveniente visualizar la movilidad de las proteínas sinápticas en las cercanías de la membrana plasmática neuronal. Usando este enfoque, la movilidad de la proteína SNARE - sintaxina 1A y el autophagosome obligado proteína Atg18a - han sido correctamente reflejada en vivo14,26. La movilidad de las proteínas en motoneurona axones también pueden ser investigado27. Sin embargo, la investigación de la movilidad de las proteínas en el cerebro o cordón nervioso ventral puede resultar difícil de evaluar debido a la señal de la euforia producida por el tejido subyacente; Además, visualizar la movilidad de la proteína en la misma estructura cerebral requerirá etiquetado fluorescente la estructura del cerebro (para asegurar la replicabilidad), y se necesitaría el uso de la proyección de imagen de doble cámara.
Métodos actuales disponibles para la microscopía de superresolución en Drosophila en su mayoría se limitan a imágenes de embriones, en lugar de los más desarrollados tercer instar de la larva38,39. El problema principal con estos protocolos es que producen un bajo número de trayectorias en el área de imagen y por lo tanto evitar el análisis en profundidad de movilidad Estados22,40. Nuestra en vivo sola molécula seguimiento protocolo tiene la capacidad de generar un gran número de trayectorias y por lo tanto podría ser utilizada en otros modelos animales como Caenorhabiditis elegans y pez cebra. De hecho, cada cadena NMJ genera trayectorias de 2.400 ~ lo que es adecuado para el análisis de los diferentes Estados móviles y las transiciones entre estos Estados14,27. Además, muchos en vivo sola molécula imagen estrategias se basan en el uso de anestésicos para inmovilizar los animales20,22, que podría alterar la función fisiológica que se realiza la proyección de imagen. Aquí hemos optimizado un protocolo 'sin anestesia' para inmovilizar las larvas con pernos minutien.
Un potencial uso de este protocolo puede ser para la visualización de la movilidad de las proteínas en tres dimensiones. Los recientes avances en la microscopía de superresolución permiten movilidad de la proteína ser visualizado en vitro en 'x', 'y' y 'z' dimensiones41,42. Nuestro método actual no tiene en cuenta la movilidad de las proteínas en el eje 'z'. Sin embargo, el nervio motor del Drosophila terminal es una estructura esférica y un valioso enfoque futuro será cuantificar la movilidad de la proteína en un volumen tridimensional43. Proyección de imagen en la dimensión z es factible utilizando una lente astigmática. Por otra parte, en el TIRF modo44,45, z-resolución también aumenta. Sin embargo, en nuestros experimentos, hemos utilizado iluminación ligeramente oblicua para visualizar las moléculas individuales de syntaxin1A-mEos2 sin la lente astigmática.
En conclusión, la disponibilidad de ambos un transgénico Drosophila mosca stock expresando proteínas etiquetadas con una proteína de photoconvertible, una base de PDMS para disecar la larva transgénica, así como un microscopio TIRF equipada con la posibilidad de cambiar la ángulo de iluminación son las más importantes herramientas necesarias para visualizar proteínas individuales como se describe en este protocolo.

La comunicación neuronal se basa en la liberación del neurotransmisor, que se produce a través de la fusión regulada de neurotransmisor que contienen vesículas sinápticas con la membrana plasmática1. Este proceso llamado exocitosis2,3,4,5,6 es altamente dinámico y puede ser regulado de arriba o abajo según las fluctuaciones de la tasa de estimulación7. Las proteínas implicadas en estos procesos están sujetos a movimiento browniano y por lo tanto Mostrar nanoscópicas organización capaz de sostener una serie de enlace acciones que apuntalan estas funciones fisiológicas. Las proteínas de la membrana plasmática son altamente dinámicas, permitiendo captura lateral de las moléculas en nanoclusters en la membrana del plasma7,8,9,10,11, 12. Por lo tanto, investigar la movilidad de estas proteínas ayuda a aclarar su modo de acción8. Proteínas sinápticas como las N-etilmaleimida sensible factor accesorio proteínas receptores solubles (trampas), por ejemplo sintaxina-1A, ahora se sabe que exhiben movilidad lateral rápido, así como la lateral reventado dentro de nanoclusters que pueden servir como molecular depósitos y sitios de vesícula fusión9,13,14,15.
El desarrollo reciente de las proteínas fluorescentes photoconvertible, como monómero (m) Eos16,17 y18de Kaede, ha permitido la resolución nanoscópicas de proteínas de la membrana plasmática neuronal mediante el uso de enfoques tan como microscopía de localización foto-activado (PALM) y estocástico reconstrucción óptica microscopia (tormenta)14,15,19. Estos desarrollos han permitido que las investigaciones sobre la movilidad y la nanoclustering de proteínas biológicas en células vivas cultivadas y las neuronas. Más recientemente, han se han realizado estudios para aclarar (en altas resoluciones similares) la dinámica y organización de estas proteínas de membrana en las neuronas de organismos vivos intactos tal Mus musculus, Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Investigación de la dinámica y organización de una proteína en vivo requiere no sólo el uso de las herramientas de imagen resolución súper desarrollados recientemente (tales como fluoróforos Palma, tormenta y photoconvertible), pero también la capacidad para superar obstáculos tales como la accesibilidad de la proteína y la profundidad de penetración del láser de proyección de imagen. Imágenes de proteínas intracelulares en un animal intacto es inherentemente difícil como es la proyección de imagen proteínas en estructuras profundamente encajadas los tejidos vivos del animal intacto, como el hipocampo de un ratón intacto. Por lo tanto, más fácilmente se reflejada proteínas en o cerca de la superficie del tejido. Otra dificultad con la proyección de imagen en vivo es para garantizar la reproducibilidad a través de animales. Como la anatomía puede diferir de una muestra a otra, seleccionar una estructura con facilidad de replicación en diferentes muestras de animales intactas también podría desafiar. El uso de estructuras estereotipadas, tales como sinapsis, ayudar a superar algunas de estas dificultades.
Estudios recientes han reflejado movilidad de la proteína en los animales con una epidermis ópticamente transparente como Caenorhabditis elegans22, mientras que otras investigaciones han reflejado la organización de proteínas en la superficie de un tejido/órgano, por ejemplo proyección de imagen de actina en las neuronas corticales a través del cráneo de un ratón vivo21. En algunos casos, se han utilizado anestésicos para mantener el animal inmóvil; sin embargo, anestésicos específicos pueden afectar adversamente la proteína de interés. Medios alternativos para mantener animales inmóviles durante proyección de imagen en vivo por lo tanto deberían estudiarse para minimizar el error.
Otra advertencia a super-resolución imágenes en vivo es que el láser utilizado para iluminar las proteínas de interés que podía afectar el tejido circundante, y por lo tanto, mantener la intensidad de excitación tan bajo como sea posible se recomienda. Iluminación de los tejidos circundantes por el láser también tiende a aumentar la señal de fondo. El uso de la intensidad de excitación baja ayuda a reducir el fondo, la salvedad de que él también podría conducir a una disminución en el rendimiento de proteína fluorescente del fotón. Sustracción de fondo durante el análisis podría ser utilizado como una alternativa reducir la señal de fondo antes de análisis de imagen.
Drosophila presenta un organismo ideal para en vivo la proyección de imagen ya que proporciona herramientas genéticas bien establecidas para la investigación de la función de la proteína específica. La secuencia de activación ascendente (UAS)-sistema de Gal4 permite expresión temporal y espacial de las proteínas y por lo tanto puede utilizarse para manipular la neurotransmisión23, que estimulación termo genético utilizando Drosophila transitoria Subfamilia potencial receptor A1 (dTRPA1)24 o estimulación opto-genética usando far-rojos-cambiado de puesto CsChrimson25 puede combinarse con la proyección de imagen14. Han superado muchas de las complicaciones de llevar a cabo en vivo imágenes de una sola molécula en este sistema y ahora describir cómo rastreo de partículas solo pueden realizarse en melanogaster del Drosophila larvas de tercer estadio.

<table><tbody><tr><td>PDMS (kit de elastómero de silicona Sylgard 184)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo con fondo de vidrio</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D29-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico óptico</td> Pinzas curvas <td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>(Estilo 5/45)</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>0208-5AC-PO</td><td></td></tr><tr><td>Pines de minución (0,1 mm)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma, Ciencias de la Vida</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas (Dumont #5)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ELYRA PS.1</td><td>Zeiss</td><td>PS.1</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (16%)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maxyclear Tubo de microcentrífuga snaplock (1,7 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black software de adquisición</td><td>Carl Zeiss, 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph software</td><td>Molecular Devices</td><td>7.7.8</td><td>PALM Tracer Plugin</td></tr><tr><td>Fly strain</td><td></td><td>w1118; HA-Sx1A-mEos2</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo una sola molécula de seguimiento en la terminal presináptica del nervio motor del drosophila

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Un número creciente de técnicas de microscopía de superresolución está ayudando a descubrir los mecanismos que rigen el mundo celular de nanoescala. Proyección de imagen de una sola molécula está ganando impulso, ya que proporciona un acceso excepcional a la visualización de moléculas individuales en células vivas. Aquí, describimos una técnica que desarrollamos para realizar seguimiento de la solo-partícula microscopía de localización foto-activado (sptPALM) en larvas de Drosophila . Comunicación sináptica depende de la claves proteínas presinápticas que actúan por acoplamiento, cebado y promoviendo la fusión de la que contiene el neurotransmisor las vesículas con la membrana plasmática. Una gama de interacciones proteína-proteína y proteína-lípido regula firmemente estos procesos y las proteínas presinápticas por lo tanto exhiben cambios en la movilidad asociada a cada uno de estos eventos claves. Investigar cómo la movilidad de estas proteínas se correlaciona con su función fisiológica en un animal vivo intacto es esencial para comprender su mecanismo exacto de acción. Extracción de movilidad de la proteína con alta resolución en vivo requiere superar limitaciones tales como la transparencia óptica, la accesibilidad y la profundidad de la penetración. Describimos cómo photoconvertible proteínas fluorescentes etiquetadas a la proteína presináptica sintaxina 1A puede ser visualizado mediante leve iluminación oblicua y seguimiento en la terminal del nervio motor o a lo largo del axón de la neurona de motor de la tercera instar Drosophila larva.

Utilizando el Protocolo mencionados, sintaxina-1A-mEos2 transgénicos Drosophilamelanogaster fueron generados (figura 1). Transgénicos tercer ínstar Drosophila larvas fueron disectadas en la base cilíndrica de PDMS (figura 2A-F). Para visualizar las moléculas individuales de la sintaxina 1A, se utilizó Palma en un microscopio TIRF con láser ligeramente oblicuos iluminación14.
Las moléculas individuales de la sintaxina 1A fueron seguidas en las terminales presinápticas de los nervios motores musculares 6 del segundo segmento abdominal. Como se muestra en la imagen de baja resolución de sintaxina-1A-mEos2 en botones de 1b de tipo cuando se excitó con el láser de 488 nm (Figura 3A), se pudo detectar la fluorescencia verde de mEos2. En los experimentos de proyección de imagen, el 405 nm y las 561 nm excitación láser imágenes profundidades fueron 133,5 nm y 165.6 nm, respectivamente. La imagen verde adquirió un promedio de 16 fotogramas individuales. Esta imagen verde se usó para crear la región de interés utilizado para limitar el análisis de localizaciones de la película photoconverted a las terminales presinápticas de los nervios motores solos.
El análisis de las películas de sptPALM de photoconverted adquirido generan una intensidad muy resuelta, coeficiente de difusión, y mapas de la trayectoria (Figura 3A). Movilidad de sintaxina-1A-mEos2 más se cuantificó mediante el análisis del desplazamiento cuadrático medio (MSD) de las trayectorias individuales (figura 3B). Las comparaciones estadísticas se pueden hacer usando el área bajo la curva MSD (figura 3B). Análisis de la movilidad produce la distribución del coeficiente de difusión de sintaxina-1A-mEos2, y esto puede ser evaluado estadísticamente en comparación del móvil a las poblaciones inmóviles (figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> Figura 1 : Generando construcciones tagged mEos2. El pFL44S-attB-MCS-w + vector es linearizado con BamHI y XbaI. Superposición reacción en cadena de polimerasa (PCR) fragmentos de codificación de la proteína de interés (POI) y mEos2, respectivamente, puede ser reproducido, por ejemplo, en vivo la recombinación en células de levadura ura3 - o Asamblea de Gibson. Tenga en cuenta que para generar el transgén sintaxina-1A-mEos2, hemos clonado el constructo flanqueado por las secuencias de promotor y terminador de sintaxina 1A endógenas. La construcción resultante se puede inyectar posteriormente en Drosophila embriones para crear una línea de mosca transgénica expresando la proteína de interés (POI) fundida a mEos2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> Figura 2 : Drosophila disección de la larva y la iluminación oblicua. (A) esquema que muestra la disección de la larva de Drosophila en medio cilíndrica base PDMS. Una larva de fileteado se llevó a cabo en el PDMS del gel por el uso de pernos minutien. (B-C) La preparación de larva-PDMS se colocó dentro de una placa de cultivo con fondo de cristal que contiene medio insectos de Schneider. Un microscopio TIRF en una configuración de iluminación ligeramente oblicua fue utilizado para visualizar la sintaxina-1A-mEos2 en los terminales del nervio motor. (D-F) Una base PDMS medio cilíndrico con larva Drosophila disecada. La preparación de larva-PDMS se colocó en un plato de imagen con medio de Schneider, y la larva era reflejada en el microscopio de súper-resolución Palma. Barra de escala, 10 mm. (esta cifra ha sido modificada desde el14). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> Figura 3 : En vivo seguimiento de sintaxina-1A-mEos2 en el presináptica del nervio motor terminal. (A) A baja resolución TIRF imagen de sintaxina-1A-mEos2 en un tipo 1b nervio motor terminal. Análisis de películas de photoconversion había reflejado en intensidad Super resuelto sptPALM, coeficiente de difusión y trayectoria 33 Hz generado mapas. 5.309 trayectorias individuales fueron imagen adquisición de película de más de 16.000 fotogramas. Barra de escala, 3 μm. (B-C) Desplazamiento de la media cuadrada (MSD) de sintaxina-1A-mEos2 fue trazada de 6 terminales diferentes de los nervios motores; área bajo la curva (AUC) de MSD se utilizó para cuantificar el nivel de movilidad. La distribución del coeficiente de difusión revela las poblaciones de sintaxina 1A móviles e inmóviles que pueden cuantificarse como cocientes de ellos; se obtuvo un promedio de 2.400 ~ trayectorias por nervio motor terminal (n = 3 larvas). Datos presentados como la media error estándar de la media. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Seguimiento in vivo de una sola molécula en la terminal nerviosa motora presináptica de Drosophila. Esta técnica describe cómo se pueden rastrear e obtener imágenes de proteínas individuales in vivo en las terminales nerviosas motoras de las larvas de Drosophila de tercer estadio. La principal ventaja de esta técnica es que permite obtener imágenes, rastrearlas y localizarlas proteínas individuales a altas resoluciones similares a las observadas en los sistemas in vitro.Diseño de Drosophila transgénica. La proteína sináptica de interés está marcada con un fluoróforo fotoconvertible, y esto se expresa en Drosophila melanogaster. Disección de la larva de Drosophila de tercer estadio.Coloque una larva errante de tercer estadio en una base de Sylgard de forma cilíndrica o semicilíndrica. Añade 40 microlitros de Schneider's Insect Medium sobre la larva. Bajo un microscopio de disección, se clava un alfiler minucioso en la cabeza y otro en la cola de la larva para inmovilizarla.Para proporcionar acceso, use un alfiler de minutién para hacer una incisión estrecha en la línea media del lado dorsal de la región abdominal de la larva. Desde este punto de incisión, con unas tijeras de resorte, corte a lo largo de la pared del cuerpo en la dirección anteroposterior. Retire los órganos internos de la larva con la ayuda de pinzas finas y tijeras de resorte.Lave la larva diseccionada con el medio para insectos de Schneider. Pegue dos alfileres minuciosos a través de cada una de las dos solapas de la pared del cuerpo para producir una preparación de larva disecada en forma de hexágono. Use unas tijeras de resorte para separar el cerebro de la larva del cordón nervioso ventral.Con unas pinzas curvas, empuje los alfileres minuciosos en la base de Sylgard. Microscopía de localización fotoactivada de seguimiento de una sola partícula. Invierta la base Sylgard de la larva en un plato de cultivo con fondo de vidrio lleno de dos mililitros de medio para insectos de Schneider a temperatura ambiente.Aplique agua sobre el objetivo de inmersión en agua 63x de un microscopio ELYRA PS.1 y luego coloque el plato en la plataforma. Encienda la luz transmitida y utilice el ocular para localizar la larva en la base Sylgard con la ayuda del objetivo aéreo 10x. Cambie al objetivo de inmersión en agua de 63x e identifique el músculo seis, utilizando la iluminación de campo brillante.Con el software de adquisición ZEN Black, seleccione la configuración de fluorescencia de reflexión interna total, TIRF. Cambie el láser de 488 nanómetros para visualizar eMos2 en verde. Localice las uniones neuromusculares, que parecen cuentas en una cuerda, y adquiera una imagen TIRF de baja resolución, encienda simultáneamente el láser de 405 nanómetros y el láser de 561 nanómetros para fotoconvertir e obtener imágenes de las especies rojas eMos2.Utilice una potencia láser muy baja para el láser de 405 nanómetros para permitir fotoconversiones estocásticas moderadamente constantes. Aquí, un láser de 405 nanómetros funciona al 0,09%mientras que un láser de 561 nanómetros funciona al 50%En las opciones de ángulo TIRF del software, deslice ligeramente el ángulo crítico TIRF. Ajusta el tiempo de exposición a 30 milisegundos.Adquirir una serie temporal de imágenes de la unión neuromuscular. Aquí se adquirió una película de 15.000 fotogramas. Guarde la película como un archivo en formato czi.análisis de datos. Analice las películas adquiridas con un software analítico de seguimiento molecular único adecuado. Localice las coordenadas x e y de la localización de cada proteína fluorescente mediante el ajuste gaussiano de la función de dispersión del punto de intensidad.Para trazar la trayectoria de cada localización, establezca un umbral de un mínimo de ocho apariencias continuas de fotogramas diferentes para cada localización y un máximo de tres píxeles de movilidad entre cada fotograma. Obtenga la imagen de trayectoria, el desplazamiento cuadrático medio, así como el coeficiente de difusión de todas las localizaciones rastreadas. Resultados representativos.Se graficó el desplazamiento cuadrático medio de las trayectorias individuales de Syntaxin-1A-eMos2 desde múltiples uniones neuromusculares en tres larvas diferentes, como media más menos error estándar de media. También se graficó el área bajo la curva de desplazamiento cuadrático medio. El coeficiente de difusión de la sintaxina-1A-mEos2 se obtuvo de manera similar a partir de múltiples uniones neuromusculares y se trazó como un histograma de la distribución de frecuencia relativa.El umbral del coeficiente de difusión reveló dos poblaciones de Syntaxin-1A, una móvil y otra inmóvil. Se calculó la relación entre las poblaciones móviles e inmóviles de sintaxina-1A-mEos2. Conclusión. Este video debería proporcionar una comprensión de cómo se puede llevar a cabo el seguimiento de una sola proteína en la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila.La técnica proporciona una forma para que los investigadores en el campo de la comunicación neuronal visualicen y observen la movilidad y organización de proteínas individuales a altas resoluciones in vivo.

in-vivo-single-molecule-tracking-at-drosophila-presynaptic-motor

Research

Investigación

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Este video muestra la técnica para registrar las corrientes sinápticas de un botón sináptico en la unión neuromuscular de la larva de Drosophila. Esta técnica permite monitorizar la actividad de un único botón sináptico, lo que es importante para el estudio de líneas de moscas mutantes con una mayor actividad sináptica espontánea o asíncrona.

Registro de corrientes sinápticas en la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila

En este video, las fibras nerviosas de las larvas de Drosophila se sumergen en un tinte FM, que se une a los lípidos de la membrana celular. El microelectrodo de succión y los pulsos eléctricos estimulan el proceso de endocitosis, incorporando el colorante FM en las vesículas endocíticas recién formadas. Este método, que visualiza las etapas presinápticas de la neurotransmisión, es útil para estudiar la función sináptica y la liberación de neurotransmisores.

Carga y descarga de colorantes FM mediada por microelectrodos en células nerviosas de larvas de Drosophila

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

Aquí, describimos el método que empleamos para crear imágenes de filopodia dendrítica altamente móviles en una preparación en vivo del cerebro larvario Drosophila, y el protocolo que desarrollamos para cuantificar conjuntos de datos de imágenes 3D de lapso de tiempo para evaluaciones cuantitativas de la dendrita dinámica en el desarrollo de neuronas.

Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Aprende a rastrear moléculas individuales in vivo en terminales presinápticas de Drosophila melanogaster mediante microscopía PALM. Este método permite visualizar la dinámica de proteínas sinápticas con alta resolución.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

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