Name: La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a combinar cristalografía de rayos X con SAXS para modelar regiones dinámicas de proteínas como Nsa1 de S. cerevisiae. Este método permite analizar dominios ordenados y desordenados en biología estructural.

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Se recogieron datos de difracción en el equipo de acceso colaborativo Regional Sureste (SER-CAT) 22-ID y BM 22 líneas en la avanzada del fotón fuente (APS), laboratorio nacional de Argonne. Los datos SAXS se colectó en la línea de SIBILAS en avance luz fuente (ALS), laboratorio nacional Lawrence Berkeley. Nos gustaría agradecer al personal en la línea de SIBILAS por su ayuda con la recolección remota de datos y procesamiento. Agradecemos a la investigación de espectrometría de masa nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) y grupo de apoyo ayuda para determinar los límites del dominio de la proteína. Este trabajo fue apoyado por el nosotros nacional Instituto de salud intramuros programa de investigación; Los E.E.U.U. Instituto Nacional de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) (ZIA ES103247 a R. E. S.) y los institutos canadienses de investigación en salud (CIHR, 146626 a la M.C.P). Uso de la APS fue apoyado por el Departamento de energía, oficina de ciencia, oficina de ciencias básicas de energía bajo contrato no. W-31-109-Eng-38. Uso de la fuente de luz avanzado (ALS) fue apoyado por el Director, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, del Departamento de energía estadounidense bajo contrato no. DE-AC02-05CH11231. Soporte adicional para la línea de SAXS SIBILAS viene del Instituto Nacional de salud del proyecto MINOS (R01GM105404) y una gama alta instrumentación Grant S10OD018483. Nos gustaría también agradecer a Andrea Moon y el Dr. Sara Andres por su lectura crítica de este manuscrito.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Mediante este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae se generó para estudios estructurales por cristalografía de rayos x y SAXS. Nsa1 fue bien-se comportó en solución y cristalizado en múltiples formas de cristal. Durante la optimización de estos cristales, se descubrió que el C-terminal de Nsa1 era sensible a la degradación de la proteasa. La alta resolución, forma cristalina ortorrómbica sólo podría ser duplicada con variantes de truncamiento del c-terminal de Nsa1, probablemente porque el C-terminal fl...

Los ribosomas son máquinas grandes ribonucleoproteína que llevan a cabo el papel esencial de la traducción de mRNA en las proteínas en todas las células vivas. Los ribosomas están compuestos de dos subunidades que se fabrican en un proceso complejo llamado ribosoma biogénesis1,2,3,4. Ensamblaje del ribosoma eucariotas se basa en la ayuda de cientos de Asamblea ribosomal esenciales factores2,3,5. Nsa1 (Nop7 asociado 1) es un factor de ensamblaje ribosoma eucariota que es específicamente necesario para la producción de la subunidad ribosomal grande6, y es conocido como WD-repetición que contiene 74 (WDR74) en los organismos superiores7. WDR74 se ha demostrado que se requiere para la formación de blastocistos en ratones8y el promotor de WDR74 es frecuentemente mutado en cáncer células9. Sin embargo, la función y mecanismos precisos de Nsa1/WDR74 conjunto de ribosomas siguen siendo en gran parte desconocidos. Para comenzar a descubrir el papel de Nsa1/WDR74 durante la maduración de los ribosomas eucarióticos, se realizaron múltiples análisis estructurales, incluyendo la cristalografía de rayos x y ángulo pequeño (SAXS) la dispersión de rayos x10.
Cristalografía de rayos x, resonancia magnética nuclear (NMR) espectroscopia, microscopia electrónica y SAXS son técnicas importantes para el estudio de la estructura macromolecular. Tamaño, forma, la disponibilidad y estabilidad de las influencias de macromoléculas adecuado el método de la biología estructural que una macromolécula particular será mejor, sin embargo la combinación de múltiples técnicas a través de un enfoque llamado "híbrido" se está convirtiendo en un cada vez más beneficiosa herramienta11. En particular la cristalografía de rayos x y SAXS son métodos potentes y complementarios para la determinación estructural de macromoléculas12.
Cristalografía provee alta resolución estructuras atómicas que van desde moléculas pequeñas hasta grandes máquinas celulares como los ribosomas y ha conducido a numerosos avances en la comprensión de las funciones biológicas de las proteínas y otras macromoléculas13. Además, el diseño de fármacos basado en estructura aprovecha el poder de las estructuras cristalinas de acoplamiento molecular por métodos computacionales, añadiendo una dimensión crítica a drug discovery y desarrollo14. A pesar de su amplia aplicabilidad, sistemas flexibles y desordenados son difíciles de evaluar por cristalografía como embalaje de cristal puede ser obstaculizado o mapas de densidad de electrones pueden ser incompletas o de mala calidad. Por el contrario, SAXS es un enfoque estructural basado en la solución y baja resolución, capaz de describir sistemas flexibles que van desde bucles desordenados y termini a proteínas intrínsicamente desordenadas12,15,16. Teniendo en cuenta que es compatible con una amplia gama de tamaños de partícula12, SAXS puede trabajar sinérgicamente con Cristalografía para ampliar la gama de cuestiones biológicas que pueden ser abordadas por los estudios estructurales.
Nsa1 es adecuado para un enfoque estructural híbrido ya que contiene un dominio WD40 bien estructurado seguido de una funcional pero flexible C-terminal que no es sensible a los métodos de Cristalografía de rayos x. Siguiente es un protocolo para la clonación, expresión y purificación de Nsa1 S. cerevisiae para la determinación estructural híbrido por cristalografía de rayos x y SAXS. Este protocolo puede ser adaptado para estudiar las estructuras de otras proteínas que constan de una combinación de regiones ordenadas y desordenadas.

<table><tbody><tr><td>Molecular Cloning of Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2 vector paralelo</td><td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>Utilizamos una versión modificada de pMBP2 que incluía un N-terminal His-tag (pHMBP)</td></tr><tr><td>S. cerevisiae genomic</td><td>DNA ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>Primers para la clonación de Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTCTTTAGAAGC AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td></tr><<tr><td>fuerte>Producción y purificación de proteínas recombinantes Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) Células estelares</td><td>Invitrogen</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>pMBP- NSA1 y varios truncamientos</td><td>Lo et al., 2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimensiones moleculares</td> de<td>la selenometionina</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, sin dioxano</td><td>Promega</td><td>V3953</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001 cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de sodio</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris, 1 M pH7.5</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1M Imidazol, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>Talon Resina de afinidad</td><td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL Filtro centrífugo (MWCO 10K)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Gel de grado de preparación Columna de filtración</td><td>GE-Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>TEV Proteasa</td><td>preparada por NIEHS Expresión de proteínas</td><td>Plásmido de expresión central proporcionado por NCI (Tropea et al. Métodos Mol Biology, 2009)</td><td></td></tr><tr><td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad</td><td></td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization, Proteolytic Screening</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de cristal</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de cristal 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>Salt Rx</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de índice</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla PEG/Ion Hampton</td><td>Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Precipitant Synergy</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD15-PS-T</td><td></td></tr><tr><td>Swissci de 96 pocillos y 3 gotas Placas de caída UVP</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de sellado transparente cristalina de 3 pulgadas de ancho</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>Proti-Ace</td><td>Kit Hampton Research</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>Dimensiones</td> <td>molecularesMD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/hidróxido de sodio pH 7.5</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD2-011-Citrato de</td><td></td></tr> <tr><td>sodio tribásico</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD2-100-127</td><td></td></tr><tr><td>22 mm x 0.22 mm Portaobjetos siliconados</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos con sellador (Placa VDX con Sellador)</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Bucles de nylon montados de 18 mM (0,05 mm a 0,5 mM)</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td><td></td></tr><tr><td>Kit de cuentas de semillas</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de cristal magnético</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Varita criogénica magnética</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>Espuma criogénica Dewar</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de disco de cristal</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>Faldón completo de 96 pocillos Placa transparente</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>AxyMat Tapete de sellado</td><td>VWR</td><td>10011-130</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop Lite</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Robot</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software/Sitios web</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HKL2000</td><td>Otwinoski y Minor, 1997</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Adams et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>Emsley et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov et al., 2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr> <tr><td>Scatter</td><td>Rambo y Tainer, 2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pymol</td><td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schr&ouml; dinger, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>Petoukhov y Svergun, 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun et al, 1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al, 2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria et al, 2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la combinación de cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de nsa1 de s. cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determinación de la estructura integral del factor de ensamblaje del ribosoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es un reto debido a la desordenada y proteasa lábil c-término de la proteína. Este manuscrito describe los métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análisis estructural por cristalografía de rayos x y SAXS. Cristalografía de rayos x fue utilizado para resolver la estructura del dominio N-terminal WD40 ordenado de Nsa1, y luego SAXS se utilizó para resolver la estructura de la terminal C de Nsa1 en solución. Se recopilaron datos de dispersión de solución de larga duración Nsa1 en solución. Las amplitudes de la dispersión teórica se calcularon a partir de la estructura cristalina de alta resolución de dominio WD40, y luego una combinación de cuerpos rígidos y modelado ab initio reveló el c-término de Nsa1. A través de este enfoque híbrido fue reconstruida la estructura cuaternaria de la proteína entera. Los métodos presentados aquí deben ser generalmente aplicables para la determinación estructural híbrido de otras proteínas compuesto por una mezcla de dominios estructurados y no estructurados.

Nsa1 fue PCR amplificados de la DNA genomic de S. cerevisiae y subcloned en un vector que contiene una etiqueta de afinidad 6 x-histidina N-terminal seguida de MBP y un sitio de proteasa TEV. Nsa1 se transformó en células de e. coli BL21(DE3) y altos rendimientos de expresión de la proteína se obtuvieron después de la inducción con IPTG y crecimiento a 25 ° C durante la noche (figura 1A). Nsa1 fue purificados por afinidad en la resina de la ...

Este método describe el clonaje, expresión y purificación de Nsa1 recombinantes para la determinación estructural por cristalografía de rayos x y dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) y es aplicable para el análisis estructural híbrido de otras proteínas que contiene tanto había ordenado y desordenado dominios.

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

El objetivo general de este procedimiento es producir una proteína recombinante que se compone de una mezcla de dominios ordenados y desordenados para el análisis estructural híbrido mediante cristalografía de rayos X y dispersión de rayos X de ángulo pequeño. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología estructural sobre cómo poner la función biológica para que la determinación de todas las soluciones permanezca en la estructura de la proteína. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para modelar regiones dinámicas de una proteína o macromolécula que no se pueden resolver mediante cristalografía de rayos X.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades al principio para aprender a evaluar adecuadamente la calidad de sus datos SAXS. Para comenzar el procedimiento, transforme un plásmido de expresión de Nsa1 en una cepa de expresión de E. coli adecuada. Cultivar las células, inducir la expresión de Nsa1 y cosechar las células.Vuelva a suspender las células en 25 mililitros de tampón de lisis, preenfriado a cuatro grados centígrados, que contenga una tableta de inhibidor de proteasa sin EDTA. Sonicar las células a cua

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Este artículo presenta un protocolo para el procesamiento de imágenes cryo-EM utilizando la suite de software SPHIRE. El presente protocolo se puede aplicar para casi todos los proyectos EM de partículas individuales que apuntan a la resolución casi atómica.

Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

Estructuras de conjuntos supramoleculares proteína a resolución atómica son de alta relevancia debido a su papel crucial en una variedad de fenómenos biológicos. Adjunto, presentamos un protocolo para llevar a cabo estudios estructurales de alta resolución en asambleas de proteína macromolecular insoluble y no-cristalino magic-angle spinning estado sólido de resonancia magnética nuclear espectroscopia (MAS SSNMR).

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Se presenta un protocolo optimizado para realizar una amplia caracterización bioquímica y estructural de una proteína de unión a sustrato de carbohidratos de Streptococcus pneumoniae .

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Este protocolo describe en detalle cómo fabricar y operar dispositivos de microfluidos para la recogida de datos de difracción de rayos x a temperatura ambiente. Además, describe cómo supervisar la cristalización de proteínas por la dispersión ligera dinámica y obtenidos de cómo procesar y analizar datos de difracción.

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

Este protocolo muestra cómo obtener un modelo de baja resolución ab initio y detalles estructurales de una proteína de membrana de detergente solubilizado en solución mediante dispersión de neutrones de ángulo pequeño con coincidencia de contraste del detergente.

Coincidencia de contraste detergente en Small-Angle Neutron Scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado Ab Initio

Aquí, presentamos cómo la dispersión de rayos-x en ángulo pequeño (SAXS) pueden ser utilizados para obtener información en sobres baja representación de las estructuras macromoleculares. Cuando se utiliza en conjunción con alta resolución estructurales técnicas como la cristalografía de rayos x y resonancia magnética Nuclear, SAXS puede proporcionar penetraciones detalladas en dominios múltiples proteínas y complejos macromoleculares en solución.

Estudios estructurales de las macromoléculas en solución mediante dispersión de rayos-x de ángulo pequeño

Presentamos el uso del protocolo MeshAndCollect para obtener un conjunto de datos de difracción completa, para su uso en la determinación de la estructura posterior, compuesto por difracción parcial de conjuntos de datos recopilados de muchos pequeños cristales de la proteína fluorescente cerúleo.

Solución de la estructura de la proteína fluorescente Cerulean con MeshAndCollect

Las mediciones SEC-BioSAXS de macromoléculas biológicas son un enfoque estándar para determinar la estructura de la solución de las macromoléculas y sus complejos. Aquí, analizamos los datos de SEC-BioSAXS a partir de dos tipos de trazas SEC comúnmente encontradas: cromatogramas con picos completamente resueltos y parcialmente resueltos. Demostramos el análisis y la desconvolución utilizando scatter y BioXTAS RAW.

Análisis de los datos de la SEC-SAXS a través de la desconvolución y dispersión de EFA

La cristalografía de proteínas de neutrones es una técnica estructural que permite la localización de átomos de hidrógeno, proporcionando así importantes detalles mecanicistas de la función de la proteína. Presentamos aquí el flujo de trabajo para el montaje de un cristal de proteína, la recopilación de datos de difracción de neutrones, el refinamiento de la estructura y el análisis de los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones.

Recopilación y procesamiento de datos de cristalografía de neutrones para modelar átomos de hidrógeno en estructuras de proteínas

Este artículo describe cómo utilizar eficazmente tres plataformas de procesamiento crio-EM, es decir, cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3, para crear un flujo de trabajo único y robusto aplicable a una variedad de conjuntos de datos de una sola partícula para la determinación de estructuras de alta resolución.

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Aprende a combinar cristalografía de rayos X con SAXS para modelar regiones dinámicas de proteínas como Nsa1 de S. cerevisiae. Este método permite analizar dominios ordenados y desordenados en biología estructural.

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae (Video) | JoVE Journal

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

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