La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

El objetivo general de este procedimiento es producir una proteína recombinante que se compone de una mezcla de dominios ordenados y desordenados para el análisis estructural híbrido mediante cristalografía de rayos X y dispersión de rayos X de ángulo pequeño. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología estructural sobre cómo poner la función biológica para que la determinación de todas las soluciones permanezca en la estructura de la proteína. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para modelar regiones dinámicas de una proteína o macromolécula que no se pueden resolver mediante cristalografía de rayos X.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades al principio para aprender a evaluar adecuadamente la calidad de sus datos SAXS. Para comenzar el procedimiento, transforme un plásmido de expresión de Nsa1 en una cepa de expresión de E. coli adecuada. Cultivar las células, inducir la expresión de Nsa1 y cosechar las células.

Vuelva a suspender las células en 25 mililitros de tampón de lisis, preenfriado a cuatro grados centígrados, que contenga una tableta de inhibidor de proteasa sin EDTA. Sonicar las células a cuatro grados centígrados durante siete minutos, con un ciclo de dos segundos encendido y dos segundos apagado. A continuación, centrifugar el lisado a 26.900 veces la gravedad durante 45 minutos a cuatro grados centígrados.

Asegúrese de que la mezcla no se congele durante la centrifugación. A continuación, equilibre una columna de flujo por gravedad que contenga 10 ml de resina de afinidad de cobalto inmovilizada con tampón de lisis. Cargue el lisado clarificado en la columna y deje que fluya a través de la resina a cuatro grados centígrados.

A continuación, lava la resina dos veces con porciones de 100 ml de tampón de lisis. Eluir Nsa1 de la columna con 20 ml de tampón de elución. Ejecute una alícuota de 15 mcl del eluere en un gel SDS-PAGE de cuatro a 15% para confirmar la elución de la proteína.

A continuación, añada 1 ml de la solución madre de proteasa TEV de 1 mg/ml al eluere. Incube el eluere a cuatro grados centígrados durante la noche para eliminar la etiqueta MBP. A continuación, utilice una unidad de filtro centrífugo de 10 kilodalton para concentrar el Nsa1 escindido en MBP hasta unos 5 ml, teniendo cuidado de no concentrarse en exceso.

Purifique la proteína concentrada en una columna de filtración de gel preequilibrada con tampón A. Uno de los pasos críticos en este procedimiento es asegurarse de eliminar todos los agregados durante la purificación. Los agregados interferirán con la cristalización y la adquisición y análisis de datos SAXS. Analice muestras de 15 mcl de cada fracción de columna con SDS-PAGE para confirmar la separación de MBP de Nsa1.

Combine las fracciones que contienen Nsa1. Utilice una unidad de filtro centrífugo de 10 kilodalton para concentrar las fracciones combinadas a unos 8 mg/ml. Mida la absorbancia a 289 nanómetros y calcule la concentración de proteína.

Proceder inmediatamente a los ensayos de cribado proteolítico y cristalización. Para comenzar el cribado proteolítico, prepare soluciones madre de 1 mg/ml de alfa-comotripsina, tripsina, elastasa, capayina, septilisina y endoproteinasa GluC. Diluya cada solución madre con tampón de dilución a 1:10, 1:100 y 1:1.000.

Diluya la solución de 8 mg/ml de Nsa1 a 1 mg/ml con tampón A. Luego, para cada dilución de proteasa, combine 1 mcl de la dilución de proteasa con 9 mcl de la reserva de proteína diluida. Incubar las soluciones a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, añada 10 mcl de muestra 2x SDS-PAGE para tampón a cada solución y caliente las soluciones a 95 grados centígrados durante cinco minutos.

Ejecute las soluciones en un gel de cuatro a 15% SDS-PAGE para identificar los dominios resistentes a la proteasa. Cree construcciones de expresión truncadas que excluyan las regiones lábiles de la proteasa. Exprime y purifica estas proteínas para optimizar la cristalización.

Después de adquirir datos SAXS para la proteína Nsa1 en un rango de concentraciones, establezca la ruta del archivo de shell terminal en el directorio que contiene los datos. A continuación, inicie el software de análisis. Cargue las curvas de dispersión en el software de análisis.

Utilice la herramienta RG automático para determinar el radio de giro y la intensidad de dispersión hacia adelante para cada curva. A continuación, genere diagramas de Kratky para cada curva de dispersión para determinar el grado de compacidad. Utilice la herramienta autónomo para calcular la función de distribución por pares para cada curva, utilizando una dimensión máxima inicial de 3 veces el radio de giro.

Optimice la dimensión máxima para obtener una curva de función de distribución suave y por pares que sea coherente con la curva de dispersión experimental. Compare los parámetros estructurales a través de las concentraciones para verificar la ausencia de daño por radiación o efectos dependientes de la concentración. Es fundamental comparar los parámetros estructurales clave, como el radio de giro, la masa molecular, la dispersión directa y las funciones de distribución de distancia de pares en una serie de concentraciones.

Y eso es para garantizar que no haya daños por radiación o efectos de concentración. A continuación, ejecute la utilidad de método de optimización de conjuntos utilizando el archivo de estructura cristalina de proteína inicial, el archivo de secuencia de proteína objetivo y el archivo de datos SAXS experimental. Compare los valores de chi cuadrado del archivo de estructura cristalina inicial con el archivo de conjunto para determinar si el modelo de conjunto se ajusta bien a los datos experimentales.

Utilice software de visualización molecular para superponer la estructura cristalina con los conformadores generados. Obsérvese el número total de conformadores y la fracción de ocupación de cada conformador que contribuye a la curva de dispersión. La escisión proteolítica del extremo C lábil de la proteasa de Nsa1 dio lugar a la formación de cristales ortorrómbicos.

El Nsa1 recién purificado formó cristales cúbicos, pero la estructura cristalina aún carecía de densidad electrónica para el extremo c/n lábil. El dominio WD-40 de la hélice beta blada de Nsa1 n-terminal se resolvió bien en ambas estructuras. El dominio Nsa1 WD-40 por sí solo no era una buena opción para los datos experimentales de SAXS.

Una combinación de modelado de cuerpo rígido y reconstrucción abinicial del extremo C mejoró significativamente la bondad del ajuste. El modelado de conjuntos proporcionó una mejora aún mayor en la bondad de ajuste, revelando el muestreo confirmacional de la cola C-terminal en solución. Si bien SAXS es una técnica estructural de baja resolución, complementa muy bien los estudios estructurales de alta resolución, como la cristalografía de rayos X.

De este modo, puede modelar regiones flexibles y desordenadas. Al recopilar y analizar los datos de SAXS de la macromolécula, puede comenzar a comprender el cambio de confirmación que se produjo al ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo resolver la estructura de una proteína compuesta por regiones ordenadas y desordenadas tanto por cristalografía de rayos X como por SAXS.