Name: La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a combinar cristalografía de rayos X con SAXS para modelar regiones dinámicas de proteínas como Nsa1 de S. cerevisiae. Este método permite analizar dominios ordenados y desordenados en biología estructural.

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Se recogieron datos de difracción en el equipo de acceso colaborativo Regional Sureste (SER-CAT) 22-ID y BM 22 líneas en la avanzada del fotón fuente (APS), laboratorio nacional de Argonne. Los datos SAXS se colectó en la línea de SIBILAS en avance luz fuente (ALS), laboratorio nacional Lawrence Berkeley. Nos gustaría agradecer al personal en la línea de SIBILAS por su ayuda con la recolección remota de datos y procesamiento. Agradecemos a la investigación de espectrometría de masa nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) y grupo de apoyo ayuda para determinar los límites del dominio de la proteína. Este trabajo fue apoyado por el nosotros nacional Instituto de salud intramuros programa de investigación; Los E.E.U.U. Instituto Nacional de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) (ZIA ES103247 a R. E. S.) y los institutos canadienses de investigación en salud (CIHR, 146626 a la M.C.P). Uso de la APS fue apoyado por el Departamento de energía, oficina de ciencia, oficina de ciencias básicas de energía bajo contrato no. W-31-109-Eng-38. Uso de la fuente de luz avanzado (ALS) fue apoyado por el Director, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, del Departamento de energía estadounidense bajo contrato no. DE-AC02-05CH11231. Soporte adicional para la línea de SAXS SIBILAS viene del Instituto Nacional de salud del proyecto MINOS (R01GM105404) y una gama alta instrumentación Grant S10OD018483. Nos gustaría también agradecer a Andrea Moon y el Dr. Sara Andres por su lectura crítica de este manuscrito.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Mediante este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae se generó para estudios estructurales por cristalografía de rayos x y SAXS. Nsa1 fue bien-se comportó en solución y cristalizado en múltiples formas de cristal. Durante la optimización de estos cristales, se descubrió que el C-terminal de Nsa1 era sensible a la degradación de la proteasa. La alta resolución, forma cristalina ortorrómbica sólo podría ser duplicada con variantes de truncamiento del c-terminal de Nsa1, probablemente porque el C-terminal fl...

Los ribosomas son máquinas grandes ribonucleoproteína que llevan a cabo el papel esencial de la traducción de mRNA en las proteínas en todas las células vivas. Los ribosomas están compuestos de dos subunidades que se fabrican en un proceso complejo llamado ribosoma biogénesis1,2,3,4. Ensamblaje del ribosoma eucariotas se basa en la ayuda de cientos de Asamblea ribosomal esenciales factores2,3,5. Nsa1 (Nop7 asociado 1) es un factor de ensamblaje ribosoma eucariota que es específicamente necesario para la producción de la subunidad ribosomal grande6, y es conocido como WD-repetición que contiene 74 (WDR74) en los organismos superiores7. WDR74 se ha demostrado que se requiere para la formación de blastocistos en ratones8y el promotor de WDR74 es frecuentemente mutado en cáncer células9. Sin embargo, la función y mecanismos precisos de Nsa1/WDR74 conjunto de ribosomas siguen siendo en gran parte desconocidos. Para comenzar a descubrir el papel de Nsa1/WDR74 durante la maduración de los ribosomas eucarióticos, se realizaron múltiples análisis estructurales, incluyendo la cristalografía de rayos x y ángulo pequeño (SAXS) la dispersión de rayos x10.
Cristalografía de rayos x, resonancia magnética nuclear (NMR) espectroscopia, microscopia electrónica y SAXS son técnicas importantes para el estudio de la estructura macromolecular. Tamaño, forma, la disponibilidad y estabilidad de las influencias de macromoléculas adecuado el método de la biología estructural que una macromolécula particular será mejor, sin embargo la combinación de múltiples técnicas a través de un enfoque llamado "híbrido" se está convirtiendo en un cada vez más beneficiosa herramienta11. En particular la cristalografía de rayos x y SAXS son métodos potentes y complementarios para la determinación estructural de macromoléculas12.
Cristalografía provee alta resolución estructuras atómicas que van desde moléculas pequeñas hasta grandes máquinas celulares como los ribosomas y ha conducido a numerosos avances en la comprensión de las funciones biológicas de las proteínas y otras macromoléculas13. Además, el diseño de fármacos basado en estructura aprovecha el poder de las estructuras cristalinas de acoplamiento molecular por métodos computacionales, añadiendo una dimensión crítica a drug discovery y desarrollo14. A pesar de su amplia aplicabilidad, sistemas flexibles y desordenados son difíciles de evaluar por cristalografía como embalaje de cristal puede ser obstaculizado o mapas de densidad de electrones pueden ser incompletas o de mala calidad. Por el contrario, SAXS es un enfoque estructural basado en la solución y baja resolución, capaz de describir sistemas flexibles que van desde bucles desordenados y termini a proteínas intrínsicamente desordenadas12,15,16. Teniendo en cuenta que es compatible con una amplia gama de tamaños de partícula12, SAXS puede trabajar sinérgicamente con Cristalografía para ampliar la gama de cuestiones biológicas que pueden ser abordadas por los estudios estructurales.
Nsa1 es adecuado para un enfoque estructural híbrido ya que contiene un dominio WD40 bien estructurado seguido de una funcional pero flexible C-terminal que no es sensible a los métodos de Cristalografía de rayos x. Siguiente es un protocolo para la clonación, expresión y purificación de Nsa1 S. cerevisiae para la determinación estructural híbrido por cristalografía de rayos x y SAXS. Este protocolo puede ser adaptado para estudiar las estructuras de otras proteínas que constan de una combinación de regiones ordenadas y desordenadas.

<table><tbody><tr><td>Molecular Cloning of Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2 vector paralelo</td><td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>Utilizamos una versión modificada de pMBP2 que incluía un N-terminal His-tag (pHMBP)</td></tr><tr><td>S. cerevisiae genomic</td><td>DNA ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>Primers para la clonación de Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTCTTTAGAAGC AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td></tr><<tr><td>fuerte>Producción y purificación de proteínas recombinantes Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) Células estelares</td><td>Invitrogen</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>pMBP- NSA1 y varios truncamientos</td><td>Lo et al., 2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimensiones moleculares</td> de<td>la selenometionina</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, sin dioxano</td><td>Promega</td><td>V3953</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001 cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de sodio</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris, 1 M pH7.5</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1M Imidazol, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>Talon Resina de afinidad</td><td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL Filtro centrífugo (MWCO 10K)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Gel de grado de preparación Columna de filtración</td><td>GE-Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>TEV Proteasa</td><td>preparada por NIEHS Expresión de proteínas</td><td>Plásmido de expresión central proporcionado por NCI (Tropea et al. Métodos Mol Biology, 2009)</td><td></td></tr><tr><td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad</td><td></td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization, Proteolytic Screening</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de cristal</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de cristal 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>Salt Rx</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de índice</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla PEG/Ion Hampton</td><td>Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Precipitant Synergy</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD15-PS-T</td><td></td></tr><tr><td>Swissci de 96 pocillos y 3 gotas Placas de caída UVP</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de sellado transparente cristalina de 3 pulgadas de ancho</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>Proti-Ace</td><td>Kit Hampton Research</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>Dimensiones</td> <td>molecularesMD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/hidróxido de sodio pH 7.5</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD2-011-Citrato de</td><td></td></tr> <tr><td>sodio tribásico</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD2-100-127</td><td></td></tr><tr><td>22 mm x 0.22 mm Portaobjetos siliconados</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos con sellador (Placa VDX con Sellador)</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Bucles de nylon montados de 18 mM (0,05 mm a 0,5 mM)</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td><td></td></tr><tr><td>Kit de cuentas de semillas</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de cristal magnético</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Varita criogénica magnética</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>Espuma criogénica Dewar</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de disco de cristal</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>Faldón completo de 96 pocillos Placa transparente</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>AxyMat Tapete de sellado</td><td>VWR</td><td>10011-130</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop Lite</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Robot</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software/Sitios web</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HKL2000</td><td>Otwinoski y Minor, 1997</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Adams et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>Emsley et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov et al., 2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr> <tr><td>Scatter</td><td>Rambo y Tainer, 2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pymol</td><td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schr&ouml; dinger, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>Petoukhov y Svergun, 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun et al, 1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al, 2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria et al, 2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la combinación de cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de nsa1 de s. cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determinación de la estructura integral del factor de ensamblaje del ribosoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es un reto debido a la desordenada y proteasa lábil c-término de la proteína. Este manuscrito describe los métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análisis estructural por cristalografía de rayos x y SAXS. Cristalografía de rayos x fue utilizado para resolver la estructura del dominio N-terminal WD40 ordenado de Nsa1, y luego SAXS se utilizó para resolver la estructura de la terminal C de Nsa1 en solución. Se recopilaron datos de dispersión de solución de larga duración Nsa1 en solución. Las amplitudes de la dispersión teórica se calcularon a partir de la estructura cristalina de alta resolución de dominio WD40, y luego una combinación de cuerpos rígidos y modelado ab initio reveló el c-término de Nsa1. A través de este enfoque híbrido fue reconstruida la estructura cuaternaria de la proteína entera. Los métodos presentados aquí deben ser generalmente aplicables para la determinación estructural híbrido de otras proteínas compuesto por una mezcla de dominios estructurados y no estructurados.

Nsa1 fue PCR amplificados de la DNA genomic de S. cerevisiae y subcloned en un vector que contiene una etiqueta de afinidad 6 x-histidina N-terminal seguida de MBP y un sitio de proteasa TEV. Nsa1 se transformó en células de e. coli BL21(DE3) y altos rendimientos de expresión de la proteína se obtuvieron después de la inducción con IPTG y crecimiento a 25 ° C durante la noche (figura 1A). Nsa1 fue purificados por afinidad en la resina de la ...

Este método describe el clonaje, expresión y purificación de Nsa1 recombinantes para la determinación estructural por cristalografía de rayos x y dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) y es aplicable para el análisis estructural híbrido de otras proteínas que contiene tanto había ordenado y desordenado dominios.

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

El objetivo general de este procedimiento es producir una proteína recombinante que se compone de una mezcla de dominios ordenados y desordenados para el análisis estructural híbrido mediante cristalografía de rayos X y dispersión de rayos X de ángulo pequeño. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología estructural sobre cómo poner la función biológica para que la determinación de todas las soluciones permanezca en la estructura de la proteína. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para modelar regiones dinámicas de una proteína o macromolécula que no se pueden resolver mediante cristalografía de rayos X.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades al principio para aprender a evaluar adecuadamente la calidad de sus datos SAXS. Para comenzar el procedimiento, transforme un plásmido de expresión de Nsa1 en una cepa de expresión de E. coli adecuada. Cultivar las células, inducir la expresión de Nsa1 y cosechar las células.Vuelva a suspender las células en 25 mililitros de tampón de lisis, preenfriado a cuatro grados centígrados, que contenga una tableta de inhibidor de proteasa sin EDTA. Sonicar las células a cuatro grados centígrados durante siete minutos, con un ciclo de dos segundos encendido y dos segundos apagado. A continuación, centrifugar el lisado a 26.900 veces la gravedad durante 45 minutos a cuatro grados centígrados.Asegúrese de que la mezcla no se congele durante la centrifugación. A continuación, equilibre una columna de flujo por gravedad que contenga 10 ml de resina de afinidad de cobalto inmovilizada con tampón de lisis. Cargue el lisado clarificado en la columna y deje que fluya a través de la resina a cuatro grados centígrados.A continuación, lava la resina dos veces con porciones de 100 ml de tampón de lisis. Eluir Nsa1 de la columna con 20 ml de tampón de elución. Ejecute una alícuota de 15 mcl del eluere en un gel SDS-PAGE de cuatro a 15% para confirmar la elución de la proteína.A continuación, añada 1 ml de la solución madre de proteasa TEV de 1 mg/ml al eluere. Incube el eluere a cuatro grados centígrados durante la noche para eliminar la etiqueta MBP. A continuación, utilice una unidad de filtro centrífugo de 10 kilodalton para concentrar el Nsa1 escindido en MBP hasta unos 5 ml, teniendo cuidado de no concentrarse en exceso.Purifique la proteína concentrada en una columna de filtración de gel preequilibrada con tampón A. Uno de los pasos críticos en este procedimiento es asegurarse de eliminar todos los agregados durante la purificación. Los agregados interferirán con la cristalización y la adquisición y análisis de datos SAXS. Analice muestras de 15 mcl de cada fracción de columna con SDS-PAGE para confirmar la separación de MBP de Nsa1.Combine las fracciones que contienen Nsa1. Utilice una unidad de filtro centrífugo de 10 kilodalton para concentrar las fracciones combinadas a unos 8 mg/ml. Mida la absorbancia a 289 nanómetros y calcule la concentración de proteína.Proceder inmediatamente a los ensayos de cribado proteolítico y cristalización. Para comenzar el cribado proteolítico, prepare soluciones madre de 1 mg/ml de alfa-comotripsina, tripsina, elastasa, capayina, septilisina y endoproteinasa GluC. Diluya cada solución madre con tampón de dilución a 1:10, 1:100 y 1:1.000.Diluya la solución de 8 mg/ml de Nsa1 a 1 mg/ml con tampón A. Luego, para cada dilución de proteasa, combine 1 mcl de la dilución de proteasa con 9 mcl de la reserva de proteína diluida. Incubar las soluciones a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, añada 10 mcl de muestra 2x SDS-PAGE para tampón a cada solución y caliente las soluciones a 95 grados centígrados durante cinco minutos.Ejecute las soluciones en un gel de cuatro a 15% SDS-PAGE para identificar los dominios resistentes a la proteasa. Cree construcciones de expresión truncadas que excluyan las regiones lábiles de la proteasa. Exprime y purifica estas proteínas para optimizar la cristalización.Después de adquirir datos SAXS para la proteína Nsa1 en un rango de concentraciones, establezca la ruta del archivo de shell terminal en el directorio que contiene los datos. A continuación, inicie el software de análisis. Cargue las curvas de dispersión en el software de análisis.Utilice la herramienta RG automático para determinar el radio de giro y la intensidad de dispersión hacia adelante para cada curva. A continuación, genere diagramas de Kratky para cada curva de dispersión para determinar el grado de compacidad. Utilice la herramienta autónomo para calcular la función de distribución por pares para cada curva, utilizando una dimensión máxima inicial de 3 veces el radio de giro.Optimice la dimensión máxima para obtener una curva de función de distribución suave y por pares que sea coherente con la curva de dispersión experimental. Compare los parámetros estructurales a través de las concentraciones para verificar la ausencia de daño por radiación o efectos dependientes de la concentración. Es fundamental comparar los parámetros estructurales clave, como el radio de giro, la masa molecular, la dispersión directa y las funciones de distribución de distancia de pares en una serie de concentraciones.Y eso es para garantizar que no haya daños por radiación o efectos de concentración. A continuación, ejecute la utilidad de método de optimización de conjuntos utilizando el archivo de estructura cristalina de proteína inicial, el archivo de secuencia de proteína objetivo y el archivo de datos SAXS experimental. Compare los valores de chi cuadrado del archivo de estructura cristalina inicial con el archivo de conjunto para determinar si el modelo de conjunto se ajusta bien a los datos experimentales.Utilice software de visualización molecular para superponer la estructura cristalina con los conformadores generados. Obsérvese el número total de conformadores y la fracción de ocupación de cada conformador que contribuye a la curva de dispersión. La escisión proteolítica del extremo C lábil de la proteasa de Nsa1 dio lugar a la formación de cristales ortorrómbicos.El Nsa1 recién purificado formó cristales cúbicos, pero la estructura cristalina aún carecía de densidad electrónica para el extremo c/n lábil. El dominio WD-40 de la hélice beta blada de Nsa1 n-terminal se resolvió bien en ambas estructuras. El dominio Nsa1 WD-40 por sí solo no era una buena opción para los datos experimentales de SAXS.Una combinación de modelado de cuerpo rígido y reconstrucción abinicial del extremo C mejoró significativamente la bondad del ajuste. El modelado de conjuntos proporcionó una mejora aún mayor en la bondad de ajuste, revelando el muestreo confirmacional de la cola C-terminal en solución. Si bien SAXS es una técnica estructural de baja resolución, complementa muy bien los estudios estructurales de alta resolución, como la cristalografía de rayos X.De este modo, puede modelar regiones flexibles y desordenadas. Al recopilar y analizar los datos de SAXS de la macromolécula, puede comenzar a comprender el cambio de confirmación que se produjo al ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo resolver la estructura de una proteína compuesta por regiones ordenadas y desordenadas tanto por cristalografía de rayos X como por SAXS.

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La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae (Video) | JoVE Journal

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

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