Name: Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Aprende a caracterizar metabolitos en células individuales de embriones vivos de Xenopus laevis mediante microsondeo capilar y electroforesis-espectrometría de masas. Este método rápido y mínimamente invasivo permite analizar la actividad metabólica durante el desarrollo embrionario.

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud subvenciones GM114854 (a p) y CA211635 (a p), Arnold y Mabel Beckman Fundación Beckman joven investigador conceden (a p), el premio DuPont joven profesor (a p), la sociedad americana para la masa Premio de investigación de espectrometría (a p) y becas de la Fundación del Club COSMOS (a R.M.O. y E.P.P.). Las opiniones y conclusiones expresadas en esta publicación son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de las fuentes de financiación.

Los autores no tienen nada que revelar.

MicroProbe CE-ESI-MS permite la caracterización directa de los metabolitos en las células en vivo, libremente desarrollar embriones. En el corazón de la estrategia son dos subcomponentes técnicos, es decir en situ capilar microsampling y alta sensibilidad CE-ESI-MS. Comparado con celulares disección, microsampling capilar tiene la ventaja de un funcionamiento rápido (algunos segundos y 5 minutos / celular por disección), compatibilidad con la morfología tridimensional complejo de embriones y escalabilidad a las ...

Una comprensión integral del desarrollo embrionario requiere caracterización de todos los cambios moleculares que se despliegan en cada célula del organismo en desarrollo. Secuenciación de próxima generación con amplificación molecular permite medición profunda de transcriptomas unicelular1 en desarrollo sistemas2,3, mucho menos se sabe sobre el conjunto de moléculas más pequeñas producido en células embrionarias, incluyendo las proteínas y, especialmente, metabolitos (masa molecular &#60; Da ~ 1.500). Con una respuesta rápida y dinámica a los eventos intrínsecos y extrínsecos, el metaboloma sirve como un poderoso descriptor del estado molecular de la célula. El metaboloma unicelular, por lo tanto, aumenta el potencial para seguir el desarrollo espacial y temporal de la heterogeneidad celular en el embrión y para identificar nuevas moléculas para estudios funcionales. Sin embargo, sin amplificación molecular disponible para estas moléculas, detección del metaboloma exige una sensibilidad excepcional utilizando espectrometría de masas (MS), que es la tecnología de elección para el análisis de metabolitos.
Sola célula MS es una colección de tecnologías con suficiente sensibilidad para medir metabolitos en las células (ver comentarios 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Muestreo reproducible de las células y eficiente extracción de los metabolitos son esenciales para la acertada detección de metabolitos en las células. Disección de célula entera de identificadas células de embriones de Xenopus ha permitido la caracterización de pequeñas moléculas y péptidos16. Otros enfoques utilizan Micropipetas para células vivas individuales seguidas de detección mediante la ionización por electrospray (ESI) MS de la muestra. Por ejemplo, los metabilitos fueron medidos en planta o en células de mamífero por unicelular video MS17, presión sonda18, sonda solo19y fuerza fluídica microscopia20, entre otras técnicas21, 22,23,24. Además, incorporación de separación química antes de la ionización en el flujo de trabajo de MS sola célula eficiente simplifica el metaboloma, aliviando así posibles interferencias durante la generación de iones antes de la detección. Lo importante, separación también proporciona información específica del compuesto para ayudar en la identificación molecular. Electroforesis capilar (CE) se ha utilizado para detectar metabolitos en disecado solo25,26 o microsampled27las neuronas, captando moléculas pequeñas diferencias entre fenotipos de neurona. Recientemente adaptamos CE al tándem ESI MS para permitir la detección de nivel de seguimiento de cientos de metabolitos en las células individuales que fueron disectadas desde tempranos embriones de Xenopus laevis16,28. Estos estudios revelaron sorprendentes diferencias metabólicas entre las células embrionarias en una fase temprana de desarrollo y condujeron al descubrimiento de metabolitos con el previamente desconocido impactos del desarrollo16.
Aquí proporcionamos un protocolo que permitió la detección de metabolitos en las células en un embrión vertebrado vivo utilizando microsonda unicelular CE-ESI-MS29,30. El organismo modelo elegido es la 8-a-32-célula X. laevis embrión, aunque el enfoque es también aplicable a etapas posteriores de desarrollo y otros tipos de organismos modelo. Este protocolo utiliza capilares afilados con varios eje control traduccional bajo dirección por un sistema de proyección de imagen de alta resolución para aspirar una porción de nL ~ 10 de células identificados en situ en el embrión en desarrollo morfológicamente complejo. Esta microsonda es escalable a células más pequeñas y opera dentro de los segundos, que es lo suficientemente rápido para seguir linajes celulares en el embrión. Después de extracción polar o apolar de moléculas pequeñas, como metabolitos y péptidos, de la muestra recogida en ~ 4-5 solución de extracción μl, un ~ 10 nL del extracto resultante se analiza en una plataforma a la medida de CE separe a un espectrómetro de masas ESI. Construcción y operación de la plataforma de CE-ESI-MS se basa en protocolos descritos en otras partes. 31 , 32 la interfaz coaxial de CE-ESI es construida como se describe en otra parte. 31 esta plataforma se mantiene en el régimen cono-chorro rociado lograr sensibilidad de seguimiento-nivel capacidad de cuantificación sobre un rango dinámico del orden de registro de 4-5 (relativa28,29,30 o absoluta16). La plataforma de CE-ESI-MS ofrece un 60-amol límite inferior de detección con 8% de desviación estándar relativa (RSD) en la cuantificación en un rango probado de 10 nM y 1 μm para moléculas pequeñas16, que son suficientes para caracterizar metabolitos endógenos en X. Laevis de las células. Microprobed células continúan dividir a medida que avanza el embrión a través de desarrollo30, lo que permite análisis temporal y espacialmente resueltos de metabolismo celular. De hecho, unicelular CE-ESI-MS puede usarse para encontrar las diferencias metabólicas entre las células que ocupan el dorsal ventral16,29, animal-vegetal16y ejes del desarrollo de izquierda a derecha28 así como células forman el linaje predestinado dorsal de tejido neural de una célula progenitora común en X. laevis30. Además de consultar diferencias metabólicas entre las células embrionarias individuales en diferentes etapas de desarrollo del embrión X. laevis 30, Anticipamos que los protocolos descritos aquí son aplicables a una amplia gama de biomoléculas y microsampled de las células de diferentes etapas de desarrollo embrionario, así como otros tipos de células y organismos modelo. Además, la microsonda podría utilizarse para microsampling, mientras que otra plataforma compatible con minúsculas muestras podría ser utilizada para la separación y caracterización de biomoléculas.

<table><tbody><tr><td><fuertes>Reactivos para medios de cultivo de embriones</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 366-1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M 65-3</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>MP Biomedicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Trizma clorhidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Metabolite Solventes >de extracción</acetonitrilo fuerte</td> (grado LC-MS)Metanol Fisher <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>(grado LC-MS)</td><td>Agua Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>(grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Disolventes y normas para CE-ESI-MS</ácido</td> fórmico >fuerte <td></td><td></td><td></td></tr> (<tr><td>grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Metanol A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>(grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Agua (grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de acetilcolina</td><td>Acros Organics</td><td>159170050</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Configuración de fabricación de microsondas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de borosilicato</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas afiladas finas: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc</td><td>11252-30</td><td>Resistente a la corrosión y esterilizable en autoclave.</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Microprobe Configuración de muestreo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td> Microscopio estereoscópico <td>TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Debe estar aislado vibratoriamente.</td></tr><tr><td>Iluminador p. ej. Cuellos de cisne</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia (Plástico, desechables)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm y 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio Pasteur ( Borosilicato, desechables)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Configuración</fuerte>Fuente de alimentación de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>alto voltaje Spellman</td><td></td><td>CZE1000R</td><td>El HVPS puede controlarse a distancia mediante un programa de bajo voltaje generado por una computadora personal. Precaución: El alto voltaje presenta peligro de descarga eléctrica; Todas las partes conectivas deben estar conectadas a tierra o cuidadosamente protegidas para evitar que los usuarios se expongan accidentalmente.</td></tr><tr><td>Bombas de jeringa (2)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Amscope</td><td>SM-3BZZ</td><td>Microscopio estereoscópico capaz de 4,5 aumentos, equipado con un iluminador para monitorear el modo de pulverización de la interfaz CE-ESI.</td></tr><tr><td>Etapa de traducción XYZ</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>Etapa de traducción XYZ</td><td>Hecho</td><td></td> a medida <td>Esta plataforma es capaz de cargar cantidades de nanolitros de muestra en el capilar de separación mediante inyección hidrodinámica y suministrar el BGE para CE. Ambas interfaces descritas en este trabajo fueron capaces de inyectar 6&ndash; 10 nL de muestra en 1 min en un capilar de separación de 1 m</td></tr><tr><td>Viales de muestra de acero inoxidable</td><td>Hecho a</td><td></td><td></td>medida</tr><tr><td>Vial BGE de acero inoxidable</td><td>Hecho</td><td></td><td></td>a medida Capilar de</tr><tr><td>sílice fundida (40 y micro; M/105 y Micro; m ID/OD; 100 cm)</td><td>Tecnologías Polymicro</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de sílice fundida (75 &micro; m/360 y micro; m ID/OD; 100 cm)</td><td>Polymicro technologies</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>Emisor de acero inoxidable con puntas romas (130/260 y micro; m ID/OD)</td><td>Hamilton Co.</td><td>21031A</td><td>Para un mejor rendimiento, corte con láser y pula finamente la punta del emisor.</td></tr><tr><td>Jeringas (herméticas al gas): 500 - 1000 y micro; L Hamilton</td><td>Co.</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>Multímetro digital</td><td>Fluke</td> Espectrómetro de masas de alta resolución <td>Fluke 117</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bruker Daltonics</td><td>Maxis Impact HD</td><td>Espectrómetro de masas en tándem de alta resolución equipado con una interfaz de presión atmosférica configurada para ESI</td></tr><tr><td>Mezcla de ajuste para la calibración del espectrómetro de masas</td><td>Agilent technologies</td><td>ESI-L G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de datos versión 4.3 software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipo auxiliar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de vacío capaz de operar a 4&ndash; 10&deg; C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Microbalanza analítica (XSE105DU)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01911005</td><td></td></tr><tr><td>Congelador (-20 &deg; C)</td> <td>Congelador Fisher Scientific</td><td>97-926-1</td><td></td></tr><tr><td>(-80 &deg; C)</td> <td>Incubadora refrigerada Fisher Scientific</td><td>88300ASP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>11475126</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de rana viva (xenopus laevis)

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

La cuantificación de moléculas pequeñas en las células provoca nuevos potenciales para la mejor comprensión de los procesos básicos que subyacen el desarrollo embrionario. A activar sola célula investigaciones directamente en embriones vivos, nuevos enfoques analíticos son necesarios, especialmente aquellos que son sensibles, selectivos, cuantitativa, robusto y escalable para tamaños diferentes de la célula. Aquí, presentamos un protocolo que permite el análisis en situ del metabolismo en las células en el libre desarrollo de embriones de la rana con garras sudafricana (Xenopus laevis), un modelo potente en biología celular y del desarrollo. Este enfoque utiliza una microsonda capilar para aspirar una porción definida de células identificadas en el embrión, dejando las células vecinas intactas para posterior análisis. El contenido celular recogido es analizado por una interfaz de microescala electroforesis capilar electrospray ionización (CE-ESI) acoplada a un espectrómetro de masas tándem de alta resolución. Este método es escalable a diferentes tamaños de célula y compatible con la compleja estructura tridimensional del embrión en desarrollo. Por ejemplo, demostramos eso microprobe que unicelular CE-ESI-MS permite la aclaración de la heterogeneidad metabólica de la célula que se desarrolla como una célula progenitora da origen a descendientes durante el desarrollo del embrión. Además de la célula y biología de desarrollo, los protocolos de análisis unicelular aquí descritos son susceptibles a otros tamaños de célula, tipos celulares o modelos animales.

Recientemente se empleó microprobe unicelular CE-ESI-MS para caracterizar metabolitos en las células individuales identificadas en el libre desarrollo de embriones de Xenopus laevis 29,30. La microsonda permite rápido (~ 5 seg/celular), en situ la aspiración de ~ 10 nL de una célula individual, aspiraciones múltiples de la misma célula o varias células diferentes dentro de las misma o posteriores etapas del desar...

Describimos los pasos que permiten muestreo rápido in situ de una pequeña porción de una célula individual de alta precisión y mínima invasión, mediante micro-muestras basadas en el tubo capilar, para facilitar la caracterización química de una instantánea de la actividad metabólica en embriones vivos utilizando una plataforma de espectrometría de masas y electroforesis capilar célula hecha a la medida.

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

El objetivo general de este protocolo es caracterizar metabolitos en células vivas de embriones en desarrollo mediante micromuestreo in situ, electroforesis capilar-espectrometría de masas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular y del desarrollo, ya que permite el análisis del metabolismo en células individuales directamente en embriones vivos en desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, escalable a diferentes tamaños celulares y permite el muestreo mínimamente invasivo de células individuales en embriones vivos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que algunos pasos son difíciles de aprender porque el embrión se desarrolla relativamente rápido y se utiliza un instrumento de ionización por electrospray por electrosión capilar hecho a medida. Comience este procedimiento con la preparación de agarosa al 2% en una solución de 1X Steinberg. Mientras aún está líquido, cubra el fondo de las placas de Petri de 60 milímetros con la solución.Una vez que el gel de agarosa se haya enfriado y solidificado, flamee el extremo de una pipeta Pasteur de seis pulgadas hasta que forme una bola. Luego, toque l

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Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Aquí, presentamos protocolos para realizar tanto imágenes de espectrometría de masas ambiental (MSI) de tejidos como análisis in situ de MS de células individuales vivas (SCMS) utilizando la sonda única, que es un dispositivo multifuncional miniaturizado para el análisis de MS.

Aplicaciones de la sonda: Single-Imaging espectrometría de masas y análisis de celda única bajo condiciones ambientales

Una plataforma de manipulación de células integrada se desarrolla para su uso en conjunto con una configuración de espectrometría de masas de una sola sonda para el análisis en línea de células de suspensión individuales en condiciones ambientales.

Plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única

Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Aquí describimos una caracterización proteómica basada en espectrometría de masas de linajes celulares con destinos tisulares conocidos en el embrión vertebrado de Xenopus laevis .

Proteómica de espectrometría de masas guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana)

Este protocolo tiene como objetivo preservar los metabolitos celulares para la espectrometría de masas unicelular (SCMS) mediante la combinación de lavado con solución salina volátil, enfriamiento rápido de nitrógeno líquido, liofilización y almacenamiento a -8 °C. Demuestra que el enfriamiento con nitrógeno líquido es esencial para mantener los perfiles de metabolitos, mientras que el almacenamiento prolongado en frío debe minimizarse para evitar alteraciones metabólicas.

Preparación de muestras para espectrometría de masas unicelular Estudios metabolómicos: lavado, enfriamiento, secado y almacenamiento combinados de células

El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo.  Este artículo describe un flujo de trabajo típico utilizado para la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos en suero, incluida la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el análisis de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos.

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

jove_content es un método analítico rápido, barato y robusto que permite la monitorización cuantitativa de las reacciones químicas en tiempo real. Su utilidad para un análisis rápido, conveniente y preciso se demuestra aquí a través del análisis de injertos de péptidos covalentes en películas de quitosano para mejorar la adhesión celular.

La electroforesis capilar para supervisar Péptido injerto sobre quitosano películas en tiempo real

Se describe un procedimiento para la detección de elementos químicos presentes in situ en células humanas, así como su cuantificación en vitro . El método es adecuado para cualquier tipo de células y es particularmente útil para los análisis químicos cuantitativos en las células siguiendo en vitro exposición de nanopartículas de óxido de metal.

In Situ Detección y cuantificación de la célula de las nanopartículas de óxido de Metal usando análisis de microsonda Nuclear

Aprende a caracterizar metabolitos en células individuales de embriones vivos de Xenopus laevis mediante microsondeo capilar y electroforesis-espectrometría de masas. Este método rápido y mínimamente invasivo permite analizar la actividad metabólica durante el desarrollo embrionario.

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Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

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