Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

El objetivo general de este protocolo es caracterizar metabolitos en células vivas de embriones en desarrollo mediante micromuestreo in situ, electroforesis capilar-espectrometría de masas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular y del desarrollo, ya que permite el análisis del metabolismo en células individuales directamente en embriones vivos en desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, escalable a diferentes tamaños celulares y permite el muestreo mínimamente invasivo de células individuales en embriones vivos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que algunos pasos son difíciles de aprender porque el embrión se desarrolla relativamente rápido y se utiliza un instrumento de ionización por electrospray por electrosión capilar hecho a medida. Comience este procedimiento con la preparación de agarosa al 2% en una solución de 1X Steinberg. Mientras aún está líquido, cubra el fondo de las placas de Petri de 60 milímetros con la solución.

Una vez que el gel de agarosa se haya enfriado y solidificado, flamee el extremo de una pipeta Pasteur de seis pulgadas hasta que forme una bola. Luego, toque ligeramente el extremo calentado para imprimir de cinco a 10 pocillos de aproximadamente un milímetro de profundidad en la agarosa. Para fabricar micropipetas de punta cónica, primero extraiga los capilares de borosilicato en un extractor capilar de tipo Flaming/Brown utilizando la configuración que se encuentra en el protocolo de texto.

A continuación, rompa la punta de la micropipeta tirada con un par de pinzas finas y afiladas para obtener un diámetro exterior de la punta capilar de aproximadamente 20 micras. Realice este paso bajo un microscopio estereoscópico para ayudar a la precisión y reproducibilidad. Obtener embriones a través del apareamiento natural inducido por gonadotropina de xenopus laevis adulto o mediante fertilización in vitro como se menciona en el protocolo de texto.

Retire las capas de gelatina que rodean a los embriones a medida que comienzan a adherirse a la etapa de dos células dejando primero que los embriones descansen en la solución desgelificadora durante dos minutos. Luego, gírelos suavemente durante dos minutos más para evitar que los embriones se adhieran a la superficie del plato de recolección. Vierta suavemente el contenido del plato en un vaso de precipitados limpio y decante rápidamente la solución despegajosa del vaso de precipitados.

Cubre inmediatamente los huevos con la solución de Steinberg 0.1X para enjuagar el resto de la solución desgarbante. Agite suavemente y luego decante la solución. Repite este paso cuatro veces para lavar bien los embriones.

Transfiera los embriones desgelatinados a la solución de 1X Steinberg en una placa de Petri. Para minimizar el hacinamiento dentro de las placas, coloque aproximadamente 100 embriones por plato de 100 milímetros. Clasificar los embriones escindidos en la etapa de dos células en un plato separado en el que la pigmentación estereotipada marca con confianza el acceso ventral dorsal con referencia para establecer mapas de sulfato.

Identifique correctamente los embriones escindidos asegurándose de que el primer surco de escisión, que demarca el plano sagital medio, divida en dos el tirón animal de pigmentación oscura y el tirón animal ligeramente pigmentado de modo que las dos mitades sean imágenes especulares. A continuación, monte una micropipeta fabricada en un micromanipulador multieje. Conecte la micropipeta a un microinyector.

Utilice una pipeta de transferencia de plástico para aspirar aproximadamente cinco de los embriones de ocho células y transfiéralos a la placa de muestreo que contiene la solución de Steinberg 0,5X. Con un lazo para el cabello, coloque el embrión que se va a muestrear en un pocillo individual y asegúrese de que la célula de interés correctamente identificada esté frente a la microsonda en un ángulo aproximado de 90 grados. Mientras trabaja bajo el microscopio estereoscópico, guíe la punta de la micropipeta hacia la célula individual identificada dentro del embrión vivo.

Extraiga una porción deseada del contenido de la célula aplicando pulsos de presión negativa al microcapilar utilizando el microinyector. Retraiga suavemente la microsonda de la célula y transfiera su punta a cuatro microlitros del solvente de extracción de metabolitos enfriado en un vial de tamaño micro. A continuación, aplique un aumento de presión positivo de 80 psi durante un segundo al capilar utilizando el microinyector para expulsar el aspirado al disolvente.

Cierre herméticamente el vial para evitar la evaporación y vuelva a colocar el vial en hielo hasta que se complete la muestra. Una vez completado el muestreo, mezcle en vórtice la muestra que contiene viales de microcentrífuga durante aproximadamente un minuto para acelerar la extracción de metabolitos. A continuación, centrifugar los viales a 8.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para granular los restos celulares y otras partículas.

Almacene los extractos celulares junto con los restos celulares y precipite a menos 20 grados Celsius durante un día o a menos 80 grados Celsius durante un máximo de un mes hasta la medición por CE-ESI-MS. Construir la plataforma de inyección CE capaz de realizar una rápida traslación vertical de una etapa que contiene el vial de electrolito de fondo y el microvial de carga de muestras como se menciona en el protocolo de texto. Ensamble la interfaz CE-ESI montando primero el emisor de metal por electrospray en una unión en T de tres puertos.

A continuación, introduzca el capilar CE de separación a través del emisor de electropulverización, permitiendo que sobresalga aproximadamente de 40 a 100 micras más allá de la punta del emisor. Trabaje bajo un microscopio estereoscópico para ayudar a la precisión. Conecte el capilar de la solución de lámina al puerto restante para suministrar la solución de electrospray.

Utilice los manguitos adecuados y las conexiones apretadas con los dedos para un funcionamiento sin fugas de la interfaz CE-ESI. Con un portaplacas, monte la interfaz CE-ESI en una platina de traslación de tres ejes y coloque la punta del emisor de electrospray aproximadamente a dos milímetros del orificio del espectrómetro de masas. Para limpiar los componentes de la interfaz, primero suministre la solución de lámina de electrospray a través del emisor de electrospray a un microlitro por minuto y el BGE a través del capilar de separación CE.

Utilice bombas de jeringa para alimentar los solventes a un ritmo constante. A continuación, enjuague el capilar de separación CE antes de cada medición conectando una jeringa al extremo de entrada del capilar. Utilice jeringas grandes de manera eficiente para minimizar el rellenado y el cebado de las líneas de suministro de solventes.

Después de enjuagar el capilar de separación durante aproximadamente cinco minutos, transfiera su entrada a la solución BGE ubicada en el vial de acero inoxidable. Coloque la punta del emisor de electrospray aproximadamente a dos milímetros del orificio del espectrómetro de masas. Ajuste con precisión esta distancia utilizando una etapa de traslación para generar electrospray en el régimen de chorro de cono estable mientras monitorea el rociado con un microscopio estereoscópico.

Monitoree la estabilidad de la corriente iónica total o TIC durante aproximadamente 30 a 45 minutos para garantizar un funcionamiento estable. Aplique 21 más o menos dos kilovoltios al vial de BGE aumentando gradualmente el potencial durante aproximadamente 15 segundos, por lo general generando aproximadamente 7.5 microamperios de corriente a través del capilar de separación utilizando ácido fórmico al 1% por ciento como BGE. Antes de cada medición, asegure la estabilidad del sistema monitoreando el perfil TIC durante aproximadamente cinco a 10 minutos y luego reduzca gradualmente el potencial de separación a cero voltios.

Pipetear un microlitro de la solución estándar de enfriamiento de acetilo en el vial de inyección y transferir el capilar de separación del vial BGE al vial de inyección. Levante la etapa de inyección CE 15 centímetros en un segundo. Después de 60 segundos, inyecte hidrodinámicamente seis nanolitros de la muestra en el capilar de separación.

A continuación, traslade la etapa de nuevo a los niveles iniciales y mueva suavemente el extremo de entrada capilar hacia el BGE. Inmediatamente después, aumente el voltaje CE para iniciar la separación electroforética y la adquisición del estado EMA. Una vez que se haya detectado el estándar, detenga la adquisición de datos y baje el voltaje de separación de forma escalonada a cero voltios.

Luego, recupere el emisor a dos centímetros del orificio. Enjuague el capilar de separación durante cinco minutos antes de analizar el extracto celular. Mida 10 nanolitros del extracto de una sola célula repitiendo estos pasos durante 90 segundos para inyectar hidrodinámicamente la muestra.

Aquí se muestra un electroferograma representativo del extracto celular, en el que se muestra la separación de una serie de metabolitos identificados. Se identificaron 70 señales diferentes con alta confianza como metabolitos polares pequeños en función del tiempo de migración y los patrones de fragmentación MS/MS de las señales de extracto celular en comparación con las de un estándar o de bibliotecas espectrales de masas en tándem. La identificación de metabolitos se lleva a cabo comparando la masa precisa, el tiempo de migración y el comportamiento de fragmentación de la señal desconocida de la muestra con el patrón de metabolitos o los datos disponibles en una base de datos de metabolitos.

Este paso se demuestra para la histidina. Aquí, las células dorsales individuales que se identificaron y muestrearon utilizando la microsonda CE-ESI-MS se muestran en las etapas embrionarias de ocho, 16 células y 32 células. El análisis multivariado de los metabolitos identificados en los tres tipos diferentes de células reveló diferentes perfiles metabólicos y tendencias metabólicas complejas en todas las etapas celulares.

El análisis de componentes principales de los metadatos cuantitativos descubrió cambios metabólicos a medida que una célula progenitora identificada del embrión de ocho células se dividía para formar un clon celular en el embrión de 16 y 32 células. Se muestran tendencias representativas para metabolitos seleccionados. Metabolitos como la acetilcolina disminuyeron en abundancia con la división celular, mientras que la trolamina y la serina/arginina mostraron tendencias opuestas en estos tipos de células.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer muy rápido, generalmente en menos de 10 segundos para cada celda. La idea de este método fue cuando comenzamos el mapeo de la heterogeneidad celular metabólica en el embrión temprano de Xenopus laevis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la electroforesis capilar de microsonda y la espectrometría de masas para analizar metabolitos en células embrionarias individuales.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar rápido, ya que el metaboloma es dinámico y las células se dividen rápidamente en el embrión en desarrollo. Además, examine los detalles analíticos para asegurarse de que se recopilan datos de alta fidelidad cualitativa sobre el metabolismo celular. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de especímenes vivos porque nuestro enfoque de espectrometría de masas con microsonda funciona rápido, es mínimamente invasivo y compatible con muestras pequeñas.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el seguimiento de sulfatos, para responder a preguntas adicionales, como el impacto de los metabolitos en la especificación de los tejidos. No olvide que trabajar con fuentes de alimentación de alto voltaje puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el aislamiento eléctrico de las interfaces electrificadas al realizar este procedimiento.