Medición automatizada de la cápsula de polisacárido de Cryptococcus especies y cuerpo de la célula

El objetivo general de esta técnica es automatizar las tediosas mediciones manuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo criptocócico, como la relación entre el tamaño de la cápsula o del cuerpo de la célula y los diferentes aspectos de la virulencia. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis de enormes volúmenes de muestra sin fatiga.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la criptococosis, ya que el tamaño de la cápsula y del cuerpo celular son aspectos importantes del patógeno. Para preparar un portaobjetos de tinta china, comience pipeteando 10 microlitros de muestra criptocócica en un portaobjetos. Cualquier cepa de yi circular con trabajo, excepto para este experimento, H99 fue la única cepa utilizada.

Pipetee dos microlitros de tinte de tinta china sobre la muestra y mézclela empujando físicamente la punta de la pipeta en la muestra y moviéndola con movimientos circulares hasta que la tinta china aparezca distribuida uniformemente. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra manteniendo presionado el borde izquierdo del cubreobjetos contra la superficie del portaobjetos. Luego, baje suave y uniformemente el lado opuesto del cubreobjetos sobre la muestra.

Deje que el portaobjetos se seque al aire durante cinco minutos. A continuación, aplica una ligera capa de esmalte de uñas en el borde del cubreobjetos para formar un sello y preservar la mancha de tinta china. Para obtener imágenes de las muestras, coloque un portaobjetos debajo de un microscopio de campo claro con el accesorio de la cámara y la conversión conocida de píxeles a micras.

Ajuste los filtros, los objetivos y los contrastes, y asegúrese de que el campo de visión sea denso, pero no superpoblado, con células criptocócicas con un claro contraste entre la cápsula celular y el fondo, y correctamente enfocadas con el cuerpo de la célula visualizado como una banda oscura. Después de tomar imágenes, guárdelas en un solo directorio con títulos claros, ya que el algoritmo de medición se ejecutará en imágenes en un solo directorio y los datos de salida se organizarán de acuerdo con los nombres de los archivos de imagen. Siguiendo la configuración del algoritmo de acuerdo con el protocolo de texto, ejecute la aplicación haciendo doble clic en QCA.py.

Mientras sigue los pasos descritos en el programa, ingrese el tipo de extensión de los archivos de imagen, precedido por un punto y separado por punto y coma. A continuación, haga clic en el botón Intro. Elija el directorio donde se encuentran los archivos de imagen haciendo clic en el botón Seleccionar directorio y seleccione la carpeta que contiene las imágenes.

Genere la lista de archivos de imagen en el directorio haciendo clic en el botón Generar lista de imágenes. Las imágenes se enumerarán en el cuadro de texto de la derecha. Revise y asegúrese de que la lista sea precisa y completa.

A continuación, seleccione una imagen aleatoria de la lista para usarla como vista previa haciendo clic en el botón Seleccionar imagen aleatoria. A continuación, introduzca el objetivo del microscopio y la configuración de agrupación. Si la configuración predeterminada no coincide con el microscopio utilizado, seleccione Conversión de píxeles personalizada e introduzca la conversión de píxeles a micrómetros para los archivos de imagen.

Una vez seleccionado, haga clic en el botón Calcular conversión y asegúrese de que la conversión sea correcta según el cuadro de texto de la derecha. Para introducir los parámetros del algoritmo para la detección de círculos, introduzca el radio mínimo y máximo detectable para la detección de la cápsula exterior, como las entradas de radio mínimo y máximo de la cápsula. A continuación, introduzca el radio mínimo y máximo detectable para la detección del cuerpo de la célula como entradas de radio mínimo y máximo del cuerpo de la célula.

Ahora, mueva los controles deslizantes de sensibilidad de la cápsula y del cuerpo de la célula para ajustar el umbral de sensibilidad del algoritmo. Una sensibilidad baja será estricta y reducirá la detección de círculos falsos positivos, pero también puede detectar menos círculos reales. Por el contrario, una alta sensibilidad aumentará la tasa de detección, pero también puede dar lugar a círculos de falsos positivos.

Maximice el número de cuerpos y cápsulas detectados e inspeccione visualmente si los círculos parecen encajar correctamente. El número de cuerpos dentro de las cápsulas detectados se mostrará en el cuadro de texto de la derecha. De lo contrario, manipule los parámetros del algoritmo hasta que los resultados sean precisos.

Ejecute el algoritmo de detección en todo el directorio de archivos de imagen haciendo clic en el botón Comenzar análisis. Cada imagen será analizada y el programa mostrará Finalizado en el cuadro de texto de la derecha cuando se hayan analizado todas las imágenes. A continuación, haga clic en el botón Coincidir y limpiar.

Esto hará coincidir los cuerpos celulares detectados con las cápsulas detectadas en las que residen y calculará el verdadero radio de la cápsula restando el cuerpo de la cápsula. En el directorio de imágenes, busque los datos completados en CleanedOutput. Archivo CSV.

Si solo se seleccionó un dato, el archivo se etiquetará como CleanedBodies. csv o CleanedCapsules.csv. Como se ve aquí en esta imagen microscópica de una diapositiva de tinta china, las células están separadas y en una densidad lo suficientemente baja como para no abrumar el campo de visión.

También se ha utilizado suficiente tinte para crear contraste entre las celdas y el fondo. El algoritmo determina un umbral único para cada imagen tomando el valor de intensidad promedio y agregando la desviación estándar. Las intensidades de píxeles con una intensidad superior al umbral se consideran blancas y, con una intensidad menor, se consideran negras.

El cuerpo de la célula debe visualizarse como un círculo negro robusto sobre el fondo blanco de la cápsula. El mejor plano focal para usar es aquel en el que el cuerpo de la célula aparece como una banda oscura y concentrada. Este plano focal es aceptable como estándar, ya que enfoca correctamente la célula.

Esto se confirmó visualizando la pared celular con UVITEX, un tipo de tinción que claramente es una pared celular nítida y enfocada con una señal débil en el centro. Cuando se sigue el protocolo con precisión y se obtienen imágenes óptimas, el algoritmo es preciso y fiable. Sin embargo, si el protocolo se sigue incorrectamente y se obtienen imágenes subóptimas debido a una tinción deficiente, apiñamiento u otros parámetros mencionados anteriormente, el algoritmo pierde precisión y no puede recapitular las mediciones humanas.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unos 10 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe familiarizarse con la adquisición de imágenes óptimas con anticipación, de modo que esté preparado cuando adquiera muestras reales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación criptocócica exploraran los tamaños de cápsulas y cuerpos celulares en cualquier sistema de imágenes en el que los dos se visualicen claramente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir cápsulas criptocócicas y cuerpos celulares. No olvide que trabajar con criptococos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la seguridad básica de BSL2 al realizar este procedimiento.