4.14: Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET)

La transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) es un fenómeno utilizado para investigar las interacciones bioquímicas de corto alcance. En FRET, una molécula fotoluminiscente donante puede transferir energía de forma no radiativa a una molécula aceptora si sus respectivos espectros de emisión y absorbancia se superponen. La cantidad de energía transferida y, en consecuencia, la emisión total de la muestra, depende de la proximidad de un par de moléculas fotoluminiscentes aceptor-donante. El análisis FRET se combina con otras técnicas bioquímicas para obtener información detallada de las estructuras biomoleculares y las interacciones de este "gobernante espectroscópico".

Este video cubre los principios y conceptos del análisis FRET. El procedimiento se centra en la preparación de muestras para FRET y en las formas de presentar e interpretar los datos. Por último, las aplicaciones incluyen el seguimiento de los procesos conformacionales y celulares mediante el etiquetado de partes de una célula o proteína, el seguimiento de las reacciones enzimáticas que alteran las estructuras de las proteínas y el uso de FRET para controlar la agregación de monómeros expresados por las células.

La transferencia de energía de resonancia de F?rster, o FRET, es una transferencia no radiativa de energía entre moléculas emisoras de luz, y a menudo se usa para investigar interacciones bioquímicas de corto alcance. FRET solo ocurre cuando las moléculas fluorescentes están espaciadas dentro de 10 nm entre sí. El análisis FRET se puede combinar con otras técnicas para obtener información estructural detallada. Este video presentará los principios subyacentes de FRET, resumirá un protocolo y una presentación de datos, y discutirá algunas aplicaciones bioquímicas.

Una molécula fotoluminiscente, como un fluoróforo, se excita absorbiendo radiación electromagnética a una longitud de onda en su espectro de absorción. A medida que se relaja, emite luz a una longitud de onda dentro de su espectro de emisión. Para obtener más información sobre la fluorescencia, consulte el video de JoVE sobre microscopía de fluorescencia. Diferentes fluoróforos absorben y emiten luz en diferentes longitudes de onda, que con frecuencia se superponen. Si el espectro de emisión de un fluoróforo se superpone significativamente con el espectro de absorción de otro fluoróforo, el ?donante? liberará un fotón virtual, que es absorbido por el ?aceptor?. Cuando un donante excitado está a menos de 10 nm de un aceptor, la energía se transfiere de un donante a otro mediante interacciones dipolo-dipolo. La liberación de energía por emisión de luz del donante disminuye en consecuencia. Mientras tanto, el aceptor excitado emite luz a su longitud de onda de emisión. La respuesta de FRET se evalúa en términos de eficiencia, o el porcentaje de energía liberada del donante por FRET en lugar de por fluorescencia u otros procesos radiativos. La eficiencia depende en gran medida de la distancia entre el donante y el aceptor, lo que permite que FRET actúe como un gobernante "molecular" o "espectroscópico".

En bioquímica, FRET se usa a menudo cualitativamente para observar los cambios conformacionales en las moléculas mediante el monitoreo de los fluoróforos a medida que entran y salen del rango de FRET entre sí. Del mismo modo, las funciones celulares se pueden estudiar con moléculas que contienen un par FRET. Si la molécula marcada se escinde por la actividad enzimática, FRET se detiene y la longitud de onda de fluorescencia observada cambia.

Ahora que comprende los principios detrás de FRET, veamos una descripción general de un protocolo y algunas formas de presentar e interpretar los datos.

Antes del experimento, las biomoléculas de interés, normalmente ADN o proteínas, se diseñan con etiquetas fluorescentes, utilizando técnicas de biología molecular. Las formas comunes de introducir el material genético modificado en las células incluyen la transfección y la electroporación.

A continuación, las células se preparan para la visualización de FRET en un microscopio de fluorescencia. Por ejemplo, las moléculas pueden inmovilizarse en un portaobjetos para FRET de una sola molécula, o las muestras se cargan en pocillos para un cribado de alto rendimiento.

A continuación, se preparan los láseres de excitación, el microscopio y el equipo asociado. (A) Los experimentos FRET a menudo involucran láseres potentes; (B) por lo tanto, se deben utilizar los procedimientos adecuados de EPP y seguridad. A continuación, la muestra se coloca en el instrumento y se ilumina con el láser de excitación.

Para los experimentos que monitorean el comportamiento de las células, se utilizan imágenes en color que muestran diferencias o cambios en la intensidad de la emisión. Las intensidades de las emisiones del donante y del aceptor se trazan juntas para realizar un seguimiento de la respuesta de FRET a lo largo del tiempo.

Los datos FRET también se pueden ajustar a varias funciones para análisis más complejos. Dependiendo del experimento, los datos se pueden presentar de múltiples maneras para representar mejor los resultados, lo que convierte a FRET en una herramienta experimental flexible.

Ahora que está familiarizado con los conceptos básicos de la ejecución y el análisis de un experimento FRET, veamos algunas aplicaciones de FRET en la investigación bioquímica.

FRET se puede utilizar para estudiar cambios conformacionales o procesos celulares mediante el etiquetado de partes de la proteína o célula que se predice que se moverán a menos de 10 nm entre sí con un par de FRET. Por ejemplo, los sensores de proteínas se preparan marcando los receptores con un par de fluoróforos. La respuesta de FRET se monitoriza en vivo mediante microscopía confocal. La variación de la longitud de onda y la intensidad de la emisión indican cambios conformacionales.

FRET también se puede utilizar preparando moléculas con un par FRET activo y observando cambios en la respuesta. Cuando el sustrato se escinde, FRET se interrumpe, lo que provoca un aumento en la emisión del donante y una disminución en la emisión del aceptor. Las emisiones se analizan para determinar las contribuciones del donante, el aceptante y el FRET. Una vez calculados los factores de emisión directa para las proteínas fluorescentes cian y amarillas, se pueden determinar la concentración y los parámetros cinéticos del sustrato.

Las células diseñadas para expresar monómeros que contienen cualquiera de los dos pares FRET funcionan como "sensores" de las interacciones entre esos monómeros. Si se induce la agregación de esos monómeros, se observa una respuesta FRET. Esto se puede utilizar para investigar la agregación de proteínas desencadenada por la "siembra" de proteínas mal plegadas. Aquí, las células se transducieron con agregados de la proteína de interés, se incubaron y se analizaron con citometría de flujo.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la Transferencia de Energía de Resonancia F?rster, o FRET. Este video contenía los principios subyacentes de FRET, la preparación y el análisis de un experimento FRET y algunas aplicaciones bioquímicas.

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