Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

El objetivo general de este procedimiento es medir la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides intestinales humanos a lo largo del tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la gastroenterología, como cómo toxinas específicas, productos bacterianos o incluso tratamientos farmacológicos pueden alterar la permeabilidad de la barrera epitelial. La principal ventaja de esta técnica es que permite tanto la visualización como la medición cuantitativa de la permeabilidad de la barrera epitelial en tiempo real y utilizando tejido epitelial intestinal humano.

Antes de microinyectar organoides intestinales humanos, se debe configurar el microinyector y preparar, instalar y probar el microcapilar como se describe en el protocolo de texto. Para llenar el microcapilar con el material de inyección, sumerja la punta del microcapilar de vidrio en la suspensión de inyección de FITC-dextrano, teniendo cuidado de evitar romper la punta del microcapilar contra el costado o la parte inferior del tubo. Tire hacia atrás de la jeringa de aceite mineral para extraer aproximadamente 10 microlitros de la suspensión de FITC-dextrano en el microcapilar.

Cuando la suspensión de microinyección llene el 90% de la longitud del microcapilar de vidrio, deje de llenar el microcapilar. Presione ligeramente la jeringa antes de retirar el microcapilar de la solución de microinyección para asegurarse de que la punta del microcapilar no contenga bolsas de aire. Retire la placa de cultivo de organoides intestinales humanos de la incubadora de cultivos celulares y transfiérala a la cabina de bioseguridad con el microinyector.

Retire la tapa de la placa de cultivo y centre el primer pocillo en la platina del microscopio para que sea claramente visible a través del ocular del endoscopio con el ajuste de aumento más bajo. Gire el brazo del micromanipulador de manera que el microcapilar apunte hacia abajo en el pocillo de cultivo en un ángulo superior a 45 grados en relación con la etapa del microscopio. Coloque la punta del microcapilar por encima del primer pocillo de cultivo a aproximadamente un centímetro por encima de la superficie del medio.

Compruebe que tanto la punta del filamento de vidrio como el organoide intestinal humano son visibles a través del ocular. La clave para una microinyección exitosa es alinear cuidadosamente el microcapilar con el organoide antes de intentar la microinyección. Y siempre recomiendo que los nuevos usuarios practiquen con pañuelos de repuesto antes de intentar un experimento crítico.

girando la perilla de control del eje z en el sentido de las agujas del reloj, avance el microcapilar lentamente. Perforar el organoide intestinal humano con la punta del microcapilar. La superficie externa del organoide intestinal humano se deprimirá ligeramente a medida que el microcapilar comience a aplicar presión, y volverá a tomar forma a medida que la punta penetre en el lumen.

Si tiene dificultades para ver la punta del microcapilar dentro del lumen, ajuste la iluminación o la configuración de aumento del microscopio de disección. Cuando el microcapilar esté correctamente colocado con la punta del microcapilar cerca del centro del organoide intestinal humano, retire las manos de los controles del micromanipulador. Presione ligeramente la jeringa llena de aceite mineral para empujar la solución de microinyección fuera del microcapilar y hacia la luz del organoide intestinal humano.

El organoide intestinal humano puede expandirse ligeramente para acomodar el volumen de la inyección. Con el microcapilar colocado sobre el medio para evitar daños accidentales a los organoides intestinales humanos durante las maniobras, pase al siguiente objetivo del organoide intestinal humano. Entre tratamiento o en caso de rotura, cambiar el microcapilar.

Afloje la abrazadera en el extremo del brazo del micromanipulador y retire el microcapilar del soporte de la micropipeta. Para probar los compuestos administrados al epitelio apical, el compuesto debe resuspenderse en un PBS estéril que contenga dos miligramos por mililitro de FITC-dextrano. En este experimento representativo, vuelva a suspender la toxina TcdA de Clostridium difficile, agregue 12,8 nanogramos por microlitro en PBS que contenga FITC-dextrano antes de la microinyección.

Microinyecte el compuesto en la luz del organoide intestinal humano como se demostró en la sección anterior. Para probar los compuestos administrados en el compartimento lateral basal, después de la microinyección de FITC-dextrano, reemplace el medio de cultivo externo con un nuevo medio que contenga dos milimolares de EGTA como control positivo, un vehículo de PBS solo como control negativo u otro compuesto experimental. Comience la obtención de imágenes en vivo inmediatamente después de la microinyección.

Esta imagen representativa de campo claro muestra un organoide intestinal humano derivado de tejido después de la microinyección de FITC-dextrano. La señal fluorescente es evidente incluso sin el uso de un juego de filtros específico. Los organoides intestinales humanos derivados de células madre se microinyectaron con dextrano conjugado con cuatro kilodalton FITC suspendido en PBS, o PBS que contenía toxina Clostridium difficile TcdA.

Como control positivo, se añadió EGTA a los medios de cultivo de organoides intestinales humanos en un subconjunto de organoides intestinales humanos inyectados con PBS y FITC-dextrano. Se tomaron imágenes de los organoides intestinales humanos durante 20 horas. Como se ilustra en estas imágenes, los organoides intestinales humanos inyectados con PBS retuvieron casi toda la señal fluorescente presente en T cero.

Sin embargo, los organoides intestinales humanos que también fueron inyectados con TcdA, o tratados con EGTA, mostraron una disminución sustancial en la intensidad fluorescente ocho horas después de la microinyección. Los datos de imagen se cuantificaron para todos los organoides intestinales humanos en todos los puntos de tiempo para generar un conjunto de datos de alta resolución que representa el cambio relativo en la intensidad fluorescente a lo largo del tiempo en cada condición experimental. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 30 minutos a una hora, dependiendo del número de condiciones experimentales.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser paciente y tomarse su tiempo al alinear los organoides intestinales humanos con el microcapilar antes de la microinyección. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR, la Western blot y la búsqueda de ARN para responder preguntas adicionales sobre la respuesta del organoide intestinal humano al material inyectado. El desarrollo de esta técnica nos permitió examinar los efectos de toxinas bacterianas, agentes farmacológicos, citocinas e incluso microorganismos vivos sobre la función de barrera epitelial en organoides intestinales humanos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo microinyectar dextrano marcado con fluorescencia y otros materiales experimentales en el lumen de un organoide intestinal humano. No olvide que cuando se trabaja con toxinas bacterianas u organismos vivos, puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre se deben tomar precauciones como el uso de EPP adecuado mientras se realiza este procedimiento. Y, por último, hay que tener especial cuidado para evitar heridas punzantes, ya que los microcapilares son extremadamente afilados.