Name: Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a medir la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides intestinales humanos mediante microinyección de FITC-dextran y microscopía en tiempo real. Este método permite visualizar y cuantificar cambios tras tratamientos farmacológicos.

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Los autores desean agradecer a los Drs. Stephanie Spohn y Basilea Abuaita muchas discusiones útiles en microinyección organoide. JRS es apoyado por el consorcio de células madre intestinales (U01DK103141), un proyecto de investigación financiado por el Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y Kidney Diseases (NIDDK) y el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID). JRS y VBY son apoyados por el NIAID novela, sistemas de modelo alternativo para Consorcio de enfermedades entéricas (NAMSED) (U19AI116482). DRH se admite la concesión de la formación de mecanismos de patogénesis microbiana desde el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID, T32AI007528) y el Premio de ciencia traslacional y clínica al Instituto Michigan de clínica y salud Investigación (UL1TR000433).
Los archivos de información y código de análisis de datos utilizados en este manuscrito están disponibles en https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol><li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStandring%2C+S+%22Gray%27s+anatomy%3A+The+anatomical+basis+of+clinical+practice%22">Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice</a>. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+defense%3A+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189(2014).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+A+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li>
<li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li>
<li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+measurements%3A+General+aspects+and+possible+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Hosp%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
<li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line%3A+T84+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li>
<li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability%3A+A+critique%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li>
<li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li>
<li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Ussing%27s+chambers%3A+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li>
<li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li>
<li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li>
<li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole+new+ball+game%3A+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2FColonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li>
<li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+clostridium+difficile+infection%3A+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li>
<li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=Dhn2KispfdQC">Theory and practice of histological techniques</a>. , Churchill Livingstone. (2008).</li>
<li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKennedy%2C+S+%22PCR+troubleshooting+and+optimization%3A+The+essential+guide%22">PCR troubleshooting and optimization: The essential guide</a>. , Caister Academic Press. (2011).</li>
<li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKurien%2C+B+%22Western+blotting%3A+Methods+and+protocols%22">Western blotting: Methods and protocols</a>. , Springer. New York. (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+image+to+imageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+W+%22Microsoft+excel+data+analysis+and+business+modeling%22">Microsoft excel data analysis and business modeling</a>. , Pearson Education. (2016).</li>
<li>R Core Team. A language and environment for statistical computing. <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">R Foundation for Statistical Computing</a>. , (2017).</li>
<li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenbaum%2C+S+%22Basic+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics%3A+An+integrated+textbook+and+computer+simulations%22">Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations</a>. , Wiley. (2016).</li>
<li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li>
<li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+assessment+of+intestinal+permeability%2C+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Ther+Health+Med%22%5BJournal%5D)">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li>
<li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966(2017).</li>
</ol>

Los autores tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de interés divulgar.

Este Protocolo establece un método general para la microinyección de HIOs hPSC-derivados y derivados de tejido intestinal organoides y la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en tiempo real. También hemos demostrado nuestro enfoque de análisis e interpretación de los datos generados mediante estos métodos. Dada la creciente adopción de organoides intestinal sistemas modelo16,20,21,28 y el interés de muchos años en la permeabilidad de la barrera intestinal como fisiológicamente relevantes funcional resultado3,4,5,6, esperamos que otras personas que trabajan en este campo serán capaces de aplicar y aprovechar estos métodos.
Hay varios pasos que son fundamentales para la aplicación de esta técnica. Acceso a alta calidad hPSC - o tejido tejido derivado de HIO debe establecerse antes de la extensa experimentación con microinyección. HIO macroestructura puede ser heterogéneo, con variación de tamaño y forma, aunque la identidad del tejido y la morfología celular es altamente reproducible cuando utilizando la metodología establecida para generar HIOs24. HIOs esféricas que consta de una sola luz semi transparente y mide aproximadamente 1 mm de diámetro son ideales para la medición de la fluorescencia luminal en tiempo real y microinyección. En algunos casos, fallará microinyección, dando por resultado derrumbamiento del HIO u obvia salida del material inyectado. HIOs pueden quitarse de la cultura bien a discreción del usuario utilizando una micropipeta estándar. Considere las lentes del objetivo disponibles en una plataforma de proyección de imagen al seleccionar HIOs de microinyección y la proyección de imagen. En general, 2-4 X lentes del objetivo son ideales para la captura de la señal fluorescente completada de HIO, aunque un objetivo de X 10 se puede utilizar si no se dispone de lentes de baja potencia o si los HIOs disponibles son &#60; 1 mm de diámetro. Software de imágenes debe permitir la captura automática de imágenes fluorescentes en los puntos definidos en el tiempo.
Varias modificaciones de este protocolo son posibles con el fin de satisfacer las necesidades experimentales. Por ejemplo, los resultados de pruebas de la función de barrera pueden ser dependientes en el tamaño molecular de los compuestos de uso43 y puede ser apropiado probar preparaciones de dextrano de peso molecular variable. Además, la proyección de imagen trasmitida puede realizarse además de imágenes de fluorescencia como indicador de la integridad estructural general del tejido25. Cuando se realiza la microinyección de bacterias vivas25,28,31,32,33,44, puede ser necesario añadir penicilina y estreptomicina o gentamicina a los medios de cultivo HIO antes o después de la microinyección. El exterior de la microcapillary que se contaminan durante el llenado con la suspensión del cultivo bacteriano y esto puede ser transferido a los medios de comunicación HIO. Alternativamente, puede realizarse microinyección en HIOs suspendidas en la matriz extracelular (por ejemplo, Matrigel) sin medios de comunicación, agregando a los medios de comunicación una vez finalizada la microinyección. Esto puede limitar la contaminación a la matriz extracelular y la cara externa de la HIO. Al planificar el análisis de crecimiento microbiano, puede ser necesario retirar antibióticos en los medios de comunicación después de 1-2 h para evitar frenar o prevenir el crecimiento de organismos microinyectados.
Finalmente, reconociendo que no todos los investigadores tendrán acceso a equipo de microscopía para proyección de imagen en vitro , es importante señalar que los procedimientos descritos en este protocolo de recogida de datos de fluorescencia pueden ser aplicados a imágenes tomadas en los puntos de tiempo fijados utilizando microscopía epifluorescente estándar sin controles ambientales o captura de imágenes automatizado. Ejemplos de este enfoque pueden encontrarse en los informes por Leslie y Huang et al. 25, que examinaron la actividad de toxina de C. difficile en organoides intestinales derivados de hPSC y Karve y Pradan et al. 44, que examinó la permeabilidad de la barrera epitelial en similares derivados de hPSC organitas intestinal microinyectados con en e. coli. Operación manual de equipos puede resultar en una mayor variación y dificultad en la normalización de la señal fluorescente. Cuando se realiza la proyección de imagen manual de FITC-los dextranos inyecta HIOs es esencial mantener aumento fijo, la intensidad de excitación fluorescente y tiempos de exposición durante todo el experimento para evitar la distorsión de las mediciones de intensidad fluorescente.

El epitelio intestinal forma una barrera selectiva que media el transporte direccional de nutrientes, H2O, iones y residuos minimizando el intercambio inespecífica mediada por la difusión de otras partículas entre la luz y la mesenquimales tejido o sangre fuente1,2. La permeabilidad de la barrera epitelial intestinal ha sido considerado como un parámetro funcional clave en salud y enfermedad3,4,5,6, que refleja la tasa de difusión de moléculas pequeñas a través del epitelio mediante el espacio paracelular. Medición de la permeabilidad de la barrera epitelial puede llevarse a cabo en7 modelos animales y en pacientes humanos8 a través de la ingestión de la lactulosa, que ningún transportador específico en el tracto gastrointestinal y la posterior colección y medición de las concentraciones de lactulosa en sangre periférica. Alternativos ingeridos marcadores de la función de barrera tales como fluorescencia de etiquetado carbohidratos también están disponibles9,10. Este enfoque ha sido adaptado para las culturas de célula epitelial intestinal en Transwell soporta11, un enfoque simplificado que permite un mayor control experimental, pero también ha sido criticado como un pobre predictor de en vivo permeabilidad debido a la ausencia de subtipos epiteliales diferenciados y tejido estructura12. Usando cámaras representan otro enfoque y permitir la medición de la función de barrera epitelial en mucosa intestinal todo ex vivo13. Aplicación de esta técnica es frecuentemente limitado por tejido disponibilidad y condiciones de13,14. Así son necesarios nuevos métodos que balancear rendimiento y reproducibilidad con relevancia fisiológica.
Novedades en vitro organogénesis han conducido a la adopción de sistemas de cultivo de tejidos 3D modelo como una sofisticada plataforma para recapitular la dinámica de los complejos tejidos15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. En particular, han surgido humanas pluripotentes células madre (hPSC) derivados organitas intestinal humano (HIOs)19,24 como modelo experimental manejable y reproducible para el estudio de las interacciones microbianas en host y barrera epitelial dinámica25,26,27,28. Del mismo modo, organoides derivados de tejido humano (también conocido como enteroids) se pueden derivar de un procedimiento de biopsia simple y pueden utilizarse como un sistema manejable para estudiar la fisiología humana y la enfermedad15,29,30. Microinyección de organoides intestinal humana permite la entrega de compuestos experimentales25 o vive microbios25,31,32,33 a la apical epitelial superficie del lumen del organoide. Leslie y Huang et al. 25 recientemente adaptado esta técnica para medir la permeabilidad de la barrera en HIOs microinyectados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) etiquetado dextrán después de la exposición a las toxinas bacterianas.
Este protocolo pretende ser una guía para la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en derivados hPSC HIOs y HIOs derivados de tejido mediante microscopía fluorescente. Con pequeñas modificaciones, también puede servir como un manual general de microinyección de HIOs con compuestos experimentales. Usuarios pueden complementar este protocolo con aplicaciones posteriores adicionales o alternativas después de la microinyección.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0,5 M estéril (pH 8,0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>Solución de matriz celular (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de imágenes de células vivas Deltavision RT</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr> <tr><td>Cámara</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Incluido con el sistema Deltavision</td></tr><tr><td>softWoRx Software</td><td>de imagen GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Incluido con el sistema Deltavision Armario</td></tr> de <tr><td>bioseguridad</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td><td></td></tr> <tr><td>1X PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Life Tecnologías</td><td>12634-010</td><td>Componente de los medios ENR; véase McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>B27 suplemento (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Componente de los medios ENR; véase McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-glutamine (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Componente de los medios ENR; véase McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>HEPES tampón</td> Life <td>Technologies</td><td>15630080</td><td>componente de los medios ENR; véase McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para pipetas</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>Alternativa a Xenoworks</td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Endoscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>Endoscopio recomendado, aunque es probable que otros modelos sean compatibles</td></tr><tr><td>Olympus IX71 Microscopio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Incluido con el sistema Deltavision</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Fotometría</td><td>29065728</td><td>Incluido con el sistema Deltavision</td></tr><tr><td>Recombinante C. difficile Toxina A/TcdA Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td>Componente de los medios ENR; véase McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>4645-RS</td><td>Componente de medios ENR; véase McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td>Componente de medios ENR; véase McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextrano (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Portaobjetos de cámara</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>Filamentos de vidrio</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para micropipetas</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>Dispositivo preferido</td></tr><tr><td>Kit de tubos analógicos</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 en férula transparente</td><td>Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>junta tórica de 1-1,2 mm</td><td>Xenoworks V300450</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides intestinal humano

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Avances en la cultura 3D de tejidos intestinales obtenidos mediante biopsia o generados a partir de células pluripotentes mediante diferenciación dirigida, han resultado en modelos sofisticados en vitro de la mucosa intestinal. Aprovechamiento de estos sistemas emergentes del modelo requerirá la adaptación de herramientas y técnicas desarrolladas para los animales y los sistemas de cultivo 2D. Aquí, describimos una técnica para medir la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides intestinal humano en tiempo real. Esto se logra mediante microinyección de dextrano marcada con fluorescencia y la proyección de imagen en un microscopio invertido con filtros epifluorescente. Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera en organoides intestinal facilita la generación de datos temporales de alta resolución en tejido epitelial intestinal humano, aunque esta técnica puede aplicarse también a punto fijo de enfoques. Este protocolo es fácilmente adaptable para la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial después de la exposición a agentes farmacológicos, productos bacterianos, toxinas o microorganismos vivos. Con pequeñas modificaciones, este protocolo también puede servir como un manual general de microinyección de organoides intestinal y los usuarios pueden elegir complementar este protocolo con aplicaciones posteriores adicionales o alternativas después de microinyección.

HIOs se diferencian de células madre humanas pluripotentes y cultivan en solución de matriz celular anteriormente descrito19,24. Después de 4 semanas en la cultura, los HIOs habían ampliado suficientemente para permitir la microinyección. HIOs fueron microinyectados con dextrano conjugado con FITC de 4 kDa suspendido en PBS o en PBS con TcdA de la toxina de Clostridium difficile . C. difficile es un patógeno oportunista gastrointestinal que exhibe toxicidad epitelial mediada por toxina en HIOs25. Como control positivo, el EGTA fue agregado a los medios de cultivo HIO en un subconjunto de HIOs inyectado con PBS y FITC-los dextranos. EGTA es un quelante de calcio que causa la rápida polimerización de la actinia citoesqueleto42. La fluorescencia FITC fue monitoreada en tiempo real en un microscopio de proyección de imagen vivo dentro de una cámara ambiental controlada e imágenes fueron capturadas en intervalos de 10 minutos.
Análisis post-hoc de los datos de proyección de imagen reveló diferencias sustanciales en la retención de fluorescencia FITC (figura 5). HIOs inyectados con PBS conservan casi la totalidad de la señal fluorescente presente en t = 0, sin embargo HIOs que también fueron inyectados con TcdA de tratados con EGTA exhibieron una disminución substancial en la intensidad fluorescente por microinyección después de 8 horas (figura 5A). datos de la proyección de imagen fueron cuantificados para que los HIOs en todos los puntos de tiempo generar un conjunto de datos de alta resolución que representan el cambio relativo de intensidad fluorescente con el tiempo en cada condición experimental (figura 5B). Se evaluaron las diferencias en la permeabilidad epitelial calcular el tiempo medio de eliminación (t1/2 ) de FITC para cada grupo de tratamiento (tabla 1) y comparando las diferencias en t t1/2 entre grupos uso del estudiante t-pruebas. Tratados con control HIOs retuvo la mayoría de la señal fluorescente FITC para más de 16 horas (t1/2 = 17 ± 0.3 h). Tratamiento con EGTA redujo significativamente el tiempo de eliminación de FITC-los dextranos con respecto control HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1.3 x 10-8). De acuerdo con los resultados previamente publicados25, microinyección de TcdA aumentó significativamente la permeabilidad de la barrera epitelial en relación con tratamiento de control (t1/2 = ± 7,6 0,6 h; P = 5.4 x 10-4). Así, microinyectados compuestos (TcdA) y externos (EGTA) son capaces de inducir alteraciones significativas en la permeabilidad de la barrera epitelial en HIOs. Estos resultados sugieren que los efectos de una amplia gama de agentes farmacológicos, metabolitos, productos bacterianos, citocinas, factores de crecimiento y otros compuestos en función de la barrera epitelial pueden evaluarse utilizando este enfoque.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tratamiento</td>
			<td>Vida media (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>IC del 95% (h) de inferior</td>
			<td>Superior 95% IC (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17,78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7,56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5,93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: tiempo de eliminación (t1/2) para FITC-los dextranos en HIOs trataron con EGTA o TcdA. Las unidades son microinyección después de horas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Figura 1: diseño básico de un microinyector y un micromanipulador para microinyección HIO. Esta imagen muestra el complemento completo del equipo utilizado para realizar la microinyección de HIOs. Componentes clave son etiquetados y ordenar la información se puede encontrar en la tabla de materiales. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Figura 2: tirador de la micropipeta. El cobre bobina hc, abrazadera superior c1, abrazadera inferior (c2), la calefacción brazo extractor (pa), palanca de selección de calor (ht) se identifican por las flechas. El ajuste correcto de 1 calor y tracción se indican en el texto en rojo. El recuadro muestra un filamento de vidrio correctamente montado listo para calentar. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Figura 3: imágenes representativas de un HIO derivados del tejido inyectado con FITC-los dextranos. (A) imagen que demuestra el posicionamiento de la microcapillary de cristal justo antes de la inserción en el HIO y microinyección. (B) imagen trasmitida de un derivado de tejido organitas intestinal humana después de la microinyección de FITC-los dextranos. Tenga en cuenta que la señal de fluorescencia es evidente incluso sin el uso de un sistema de filtro específico. Esta coloración ayuda a la precisión de la microinyección. 3 aumentos <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Figura 4: flujo de trabajo de proyección de imagen en vivo. (A) captura de pantalla que ilustran los pasos necesarios para configurar los parámetros de microscopio, encontrar los HIOs de la diapositiva y guardar la posición de la etapa para cada HIO a ser reflejada. (B) configuración de la proyección de imagen para capturar el canal FITC a intervalos regulares en cada una de las posiciones habían especificado en A. (C) después de la proyección de imagen de exportación de datos en formato DV archivos como imágenes TIFF con una imagen TIFF por HIO por momento.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Figura 5: resultados representativos. (A) célula de vástago derivado organitas intestinal humano (HIO) microinyectados con 2 mg/mL de FITC-los dextranos (4 kDa) reflejada por 20 horas. HIOs también fueron microinyectados con PBS (control) o la toxina de difficile del Clostridium TcdA (12.8 ng/μL) o tratados con 2 mM EGTA añadido a los medios externos de la cultura. 4 aumentos. (B) parcela de media intensidad FITC normalizado con el tiempo en HIOs tratados con PBS (control), TcdA o EGTA. Barras de error representan SEM y n = 11 HIOs (Control), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en el tratamiento farmacológico siguiente en tiempo real en humanos organitas intestinal mediante microscopía fluorescente y vivo microscopia celular.

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides intestinales humanos a lo largo del tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la gastroenterología, como cómo toxinas específicas, productos bacterianos o incluso tratamientos farmacológicos pueden alterar la permeabilidad de la barrera epitelial. La principal ventaja de esta técnica es que permite tanto la visualización como la medición cuantitativa de la permeabilidad de la barrera epitelial en tiempo real y utilizando tejido epitelial intestinal humano.Antes de microinyectar organoides intestinales humanos, se debe configurar el microinyector y preparar, instalar y probar el microcapilar como se describe en el protocolo de texto. Para llenar el microcapilar con el material de inyección, sumerja la punta del microcapilar de vidrio en la suspensión de inyección de FITC-dextrano, teniendo cuidado de evitar romper la punta del microcapilar contra el costado o la parte inferior del tubo. Tire hacia atrás de la jeringa de aceite mineral para extraer aproximadamente 10 microlitros de la suspensión de FITC-dextrano en el microcapilar.Cuando la suspensión de microinyección llene el 90% de la longitud del microcapilar de vidrio, deje de llenar el microcapilar. Presione ligeramente la jeringa antes de retirar el microcapilar de la solución de microinyección para asegurarse de que la punta del microcapilar no contenga bolsas de aire. Retire la placa de cultivo de organoides intestinales humanos de la incubadora de cultivos celulares y transfiérala a la cabina de bioseguridad con el microinyector.Retire la tapa de la placa de cultivo y centre el primer pocillo en la platina del microscopio para que sea claramente visible a través del ocular del endoscopio con el ajuste de aumento más bajo. Gire el brazo del micromanipulador de manera que el microcapilar apunte hacia abajo en el pocillo de cultivo en un ángulo superior a 45 grados en relación con la etapa del microscopio. Coloque la punta del microcapilar por encima del primer pocillo de cultivo a aproximadamente un centímetro por encima de la superficie del medio.Compruebe que tanto la punta del filamento de vidrio como el organoide intestinal humano son visibles a través del ocular. La clave para una microinyección exitosa es alinear cuidadosamente el microcapilar con el organoide antes de intentar la microinyección. Y siempre recomiendo que los nuevos usuarios practiquen con pañuelos de repuesto antes de intentar un experimento crítico.girando la perilla de control del eje z en el sentido de las agujas del reloj, avance el microcapilar lentamente. Perforar el organoide intestinal humano con la punta del microcapilar. La superficie externa del organoide intestinal humano se deprimirá ligeramente a medida que el microcapilar comience a aplicar presión, y volverá a tomar forma a medida que la punta penetre en el lumen.Si tiene dificultades para ver la punta del microcapilar dentro del lumen, ajuste la iluminación o la configuración de aumento del microscopio de disección. Cuando el microcapilar esté correctamente colocado con la punta del microcapilar cerca del centro del organoide intestinal humano, retire las manos de los controles del micromanipulador. Presione ligeramente la jeringa llena de aceite mineral para empujar la solución de microinyección fuera del microcapilar y hacia la luz del organoide intestinal humano.El organoide intestinal humano puede expandirse ligeramente para acomodar el volumen de la inyección. Con el microcapilar colocado sobre el medio para evitar daños accidentales a los organoides intestinales humanos durante las maniobras, pase al siguiente objetivo del organoide intestinal humano. Entre tratamiento o en caso de rotura, cambiar el microcapilar.Afloje la abrazadera en el extremo del brazo del micromanipulador y retire el microcapilar del soporte de la micropipeta. Para probar los compuestos administrados al epitelio apical, el compuesto debe resuspenderse en un PBS estéril que contenga dos miligramos por mililitro de FITC-dextrano. En este experimento representativo, vuelva a suspender la toxina TcdA de Clostridium difficile, agregue 12,8 nanogramos por microlitro en PBS que contenga FITC-dextrano antes de la microinyección.Microinyecte el compuesto en la luz del organoide intestinal humano como se demostró en la sección anterior. Para probar los compuestos administrados en el compartimento lateral basal, después de la microinyección de FITC-dextrano, reemplace el medio de cultivo externo con un nuevo medio que contenga dos milimolares de EGTA como control positivo, un vehículo de PBS solo como control negativo u otro compuesto experimental. Comience la obtención de imágenes en vivo inmediatamente después de la microinyección.Esta imagen representativa de campo claro muestra un organoide intestinal humano derivado de tejido después de la microinyección de FITC-dextrano. La señal fluorescente es evidente incluso sin el uso de un juego de filtros específico. Los organoides intestinales humanos derivados de células madre se microinyectaron con dextrano conjugado con cuatro kilodalton FITC suspendido en PBS, o PBS que contenía toxina Clostridium difficile TcdA.Como control positivo, se añadió EGTA a los medios de cultivo de organoides intestinales humanos en un subconjunto de organoides intestinales humanos inyectados con PBS y FITC-dextrano. Se tomaron imágenes de los organoides intestinales humanos durante 20 horas. Como se ilustra en estas imágenes, los organoides intestinales humanos inyectados con PBS retuvieron casi toda la señal fluorescente presente en T cero.Sin embargo, los organoides intestinales humanos que también fueron inyectados con TcdA, o tratados con EGTA, mostraron una disminución sustancial en la intensidad fluorescente ocho horas después de la microinyección. Los datos de imagen se cuantificaron para todos los organoides intestinales humanos en todos los puntos de tiempo para generar un conjunto de datos de alta resolución que representa el cambio relativo en la intensidad fluorescente a lo largo del tiempo en cada condición experimental. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 30 minutos a una hora, dependiendo del número de condiciones experimentales.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser paciente y tomarse su tiempo al alinear los organoides intestinales humanos con el microcapilar antes de la microinyección. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR, la Western blot y la búsqueda de ARN para responder preguntas adicionales sobre la respuesta del organoide intestinal humano al material inyectado. El desarrollo de esta técnica nos permitió examinar los efectos de toxinas bacterianas, agentes farmacológicos, citocinas e incluso microorganismos vivos sobre la función de barrera epitelial en organoides intestinales humanos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo microinyectar dextrano marcado con fluorescencia y otros materiales experimentales en el lumen de un organoide intestinal humano. No olvide que cuando se trabaja con toxinas bacterianas u organismos vivos, puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre se deben tomar precauciones como el uso de EPP adecuado mientras se realiza este procedimiento. Y, por último, hay que tener especial cuidado para evitar heridas punzantes, ya que los microcapilares son extremadamente afilados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo describe el uso de preparaciones de tejido intestinal extirpado o "sacos intestinales" como modelo ex vivo de la función de barrera intestinal. Este modelo se puede utilizar para evaluar la integridad tanto de la barrera epitelial como de la capa de gel mucoso en sitios intestinales específicos en modelos animales de enfermedad digestiva.

Ex Vivo intestinal Sacs para evaluar la permeabilidad de la mucosa en modelos de enfermedad gastrointestinal

Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

Aquí describimos una técnica para cuantificar la integridad de la barrera de los pequeños organoides intestinales. El hecho de que el método se base en organoides vivos permite la investigación secuencial de diferentes sustancias moduladoras de la integridad de la barrera o combinaciones de las mismas de una manera resuelta en el tiempo.

Investigación de la ruptura de la barrera intestinal en los organoides vivos

Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.

Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides, un modelo intestinal tridimensional, a partir del tejido intestinal fetal. Se utilizaron imágenes inmunofluorescentes de biomarcadores epiteliales para la caracterización del modelo. La exposición apical de lipopolisacáridos, una endotoxina bacteriana, mediante la técnica de microinyección indujo la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la dosis medida por la fuga de dextrano fluorescente.

Prueba de permeabilidad epitelial en enteroides derivados de tejido fetal

El presente protocolo describe un método que utiliza lucifer amarillo en un modelo enteroide apical-out para determinar la permeabilidad intestinal. Este método se puede utilizar para determinar la permeabilidad paracelular en enteroides que modelan enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante.

Determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out

Este estudio presenta un protocolo para la generación de monocapas 2D intestinales bovinas a partir de organoides, ofreciendo un mejor acceso para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Incluye métodos para evaluar la integridad y funcionalidad de la membrana, avanzando en modelos in vitro que imitan la fisiología gastrointestinal del ganado. Este enfoque promete importantes beneficios biomédicos y agrícolas, incluidas estrategias de tratamiento mejoradas.

Avances en la tecnología de organoides bovinos mediante interfaces monocapa de intestino delgado y grueso

Este estudio describe un protocolo para generar monocapas 2D de organoides porcinos derivados del intestino delgado y grueso. El crecimiento de estas monocapas se caracteriza por el aumento de los valores de TEER, lo que indica una sólida integridad epitelial. Además, estas monocapas exhiben respuestas secretoras fisiológicas en experimentos en cámara de Ussing después de la aplicación de forskolina.

Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo

El protocolo presentado en este estudio se describen métodos para la monitorización en tiempo real de la progresión de la reprogramación a través de la medición cinética de marcadores de células madre pluripotentes positivas y negativas utilizando citometría de flujo análisis. El protocolo también incluye la evaluación basada en la obtención de imágenes de la morfología y la expresión del indicador o marcador durante la generación de IPSC.

Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

Aprenda a medir la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides intestinales humanos mediante microinyección de FITC-dextran y microscopía en tiempo real. Este método permite visualizar y cuantificar cambios tras tratamientos farmacológicos.

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

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