Name: Área análisis sonda Nanolitografía facilitado por alineación automática y su aplicación a la fabricación de sustrato para estudios del cultivo celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende nanolitografía de sonda de área amplia con alineación automática para estudiar interacciones célula-superficie usando células madre mesenquimales. Este método permite diseñar biomateriales avanzados con criterios fundamentales.

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Los autores reconocen el apoyo financiero de una variedad de fuentes incluyendo el Reino Unido ingeniería y Consejo de investigación de ciencias físicas (concesión a refs. EP/K011685/1, K024485/EP/1) y una beca de posgrado para JH; la confianza de Leverhulme (RPG-2014-292); el fondo de apoyo estratégico institucional de la Wellcome Trust (105610/Z/14/Z); el British Council (216196834); y la Universidad de Manchester para una Universidad de Manchester Instituto de investigación (fondo de cebado de la bomba UMRI) y una beca de doctorado presidencial para asistencia técnica de SW por el Dr. Andreas Lieb (sistemas de Nanosurf AG) es también agradece.

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</ol>

El algoritmo de alineamiento y el software han sido desarrollados por y son propiedad, de la Universidad de Manchester. Está disponible para su descarga en http://www.click2go.umip.com/.

Este protocolo sirve para proporcionar a los usuarios una metodología conveniente realizar rápidamente nanolithographic patrones con alta uniformidad y tamaño de la función controlable sobre grandes áreas (cm2). Substratos teniendo estos nanopatrones área entonces pueden elaborarse más para una variedad de aplicaciones. Una aplicación importante de esta tecnología es en la generación de superficies nanofabricated para estudios de interacción de la superficie de la célula. Este informe muestra algunos ejemplos ilustrativos del cultivo celular en estos materiales, demostrando control de hMSC morfología por sustratos nanofabricated.
El componente clave de este protocolo es la automatización del procedimiento de alineación (paso 4) que permite la producción altamente uniforme y alto rendimiento de características sobre superficies, hasta resolución de la nanoescala, que permite la rotación rápida de los experimentos de cultivo celular. La litografía de la pluma de polímero realizada utilizando este algoritmo de alineamiento es capaz de generar características a nanoescala dentro de aproximadamente 30 minutos. La reproducibilidad y exactitud de la alineación automática y así la uniformidad de las características de modelado, es sin embargo críticamente dependiente en la calidad de los arreglos de discos de punta de prueba que produce (paso 1 y 2). Algún defecto en su elaboración que sondas embotadas, rotas o ausentes; tales como aire atrapado burbujas (criterio 1.5) o separación incorrecta de las sondas del maestro (paso 1.8) puede resultar en alineación imprecisa y litografía de mala calidad.
Este divulgado método comparte un límite en común con otros métodos de alineación que se basan en la retroalimentación de fuerza. La determinación exacta de cuando las sondas están en contacto con la superficie está limitada por la necesidad de tener en cuenta las vibraciones de fondo causadas por el ambiente y el movimiento de la etapa de la muestra. En general, los sensores tienen una sensibilidad a la fuerza en el régimen µN (2 µN en este caso), pero el algoritmo de alineamiento está diseñado para registrar sólo una fuerza de por lo menos 490 µN como contacto definitivo entre la sonda y la superficie, para evitar cualquier resul 'falsos positivos' Ting de ruido de fondo. 13 por lo tanto, este método tiende a producir grandes características (1-2 μm) ya que las sondas deben extendido a una gran distancia en z-eje (con una consecuente mayor fuerza) para registrar el contacto. Para compensar, características más pequeñas pueden generarse mediante la reducción de la z-eje distancia recorrida durante el paso de la litografía (p. ej., entrar en el ajuste 'Negro' en el paso 5.2.3.2 como 3 μm en lugar de 5 μm).
Sin embargo, incluso con esta limitación, el algoritmo de automatización es capaz de abordar un aspecto crítico en la aplicación del paralelo métodos de litografía sonda escaneo, alineación era previamente más exigentes e impreciso paso del tiempo en la aplicación de estas técnicas. Esta automatización ahora cambia el paso tarifa-limitador del proceso de fabricación de la alineación a la litografía de la escritura sí mismo. Si bien este protocolo demuestra la aplicación de este procedimiento de alineación a PPL, el marco podría aplicarse a un número de técnicas SPL como lípido-DPN26 y litografía matriz asistió27 futuro potencial catalítico sistemas de la sonda. 28

Avances en nanotecnología son dependiente en el desarrollo de técnicas capaces de manera eficiente y confiable fabricación características a nanoescala en superficies. 1 , 2 sin embargo, generando tal cuenta sobre grandes áreas (varios cm2) confiable y a un costo relativamente bajo es un esfuerzo no trivial. Mayoría de las técnicas existente, derivada de la industria de semiconductores, se basan en ablativo Fotolitografía para fabricar materiales 'duros'. Más recientemente, técnicas litográficas derivadas de microscopía de sonda (local SPM) han surgido como un método conveniente y versátil para la creación rápida de prototipos de diseños de la nanoescala. 3 técnicas basadas en el SPM son convenientemente y rápidamente ' escribir ' ningún patrón definido por el usuario. El más bien conocido de éstos es Nanolitografía dip-pen (DPN), por Mirkin et al.,4 donde se utiliza una sonda de exploración que una 'pluma' para transferir una 'tinta' molecular a la superficie produciendo características de manera análoga a la escritura. Bajo condiciones ambientales, como una punta de prueba se analiza a través de una superficie las moléculas de 'tinta' se transfieren a la superficie a través de un menisco de agua que se forma entre la sonda y la superficie (figura 1). DPN por lo tanto permite la deposición nanolithographic de una amplia gama de materiales, incluyendo materiales "blandos" tales como polímeros y biomoléculas. 5 técnicas relacionadas usando puntas de prueba diseñados con canales para la entrega de fluido, diversamente conocido como 'nanopipettes' y 'nano-plumas', también se han divulgado. 6 , 7 , 8
El principal obstáculo para la aplicación de SPM-derivado de la litografía es el rendimiento, ya que requiere un tiempo excesivamente largo para áreas de escala centímetro patrón con una sola sonda. Primeros esfuerzos para abordar este tema se centran en la paralelización de DPN basado en voladizo, con 'one-dimensional' y 'bidimensional' matrices de sonda (2D) se informó de la litografía de áreas centímetro de tamaño. 5 , 9 sin embargo, estos arreglos de discos de voladizo se producen a través de métodos de fabricación de varias fases relativamente complejo y relativamente frágiles. La invención de la litografía de la pluma de polímero (PPL) abordó este problema mediante la sustitución de los voladizos SPM estándar con un array 2D de sondas de elastómero suave siloxano a un portaobjetos de vidrio. 10 esta configuración simple sonda disminuye significativamente el costo y la complejidad de patrones grandes zonas, apertura de nanolitografía a una amplia gama de aplicaciones. Esta arquitectura sin voladizo también se ha ampliado a punta de disco duro litografía suave primavera,11 que proporciona un híbrido suave forro elastomérico con puntas de silicona dura dando resolución mejorada en comparación con los patrones producidos con suave puntas de elastómero.
Un factor crucial en la ejecución de estas tecnologías de array 2D es que la matriz de la sonda debe ser exactamente paralela al superficie substrato para que cuando se utiliza la litografía, las sondas entran en contacto con la superficie simultáneamente. Incluso un pequeño desalineamiento puede provocar una gran diferencia en tamaño de la función de un lado de la matriz a otra, algunas sondas entrará en contacto con la superficie anterior durante el descenso de la matriz, mientras que otros entrará en contacto más adelante o no. 12 alineación exacta es especialmente importante con PPL debido a la deformabilidad de las sondas de elastómero suave, donde se comprimirá las sondas de contacto con la superficie anterior, dejando una huella más grande en la superficie.
El trabajo temprano en PPL empleados inspección puramente visual para guiar el proceso de alineación, mediante una cámara montada por encima de la matriz para observar la deformación de las sondas piramidales como fueron traídos en contacto con la superficie. 10 alineación juzgó a la observación de qué lado de las sondas entraron en contacto con la superficie en primer lugar, y luego ajustando el ángulo y repetir de forma iterativa hasta que la diferencia en contacto a cada lado de la punta de prueba fue indistinguibles para el ojo. Como este procedimiento de alineación se basa en la inspección visual subjetiva por parte del operador, es baja.
Posteriormente, se ha desarrollado un enfoque más objetivo, que consiste en un sensor de fuerza montado debajo del sustrato para medir la fuerza aplicada al contacto de las sondas en la superficie. 12 alineación así se logró mediante el ajuste de los ángulos de inclinación para maximizar la fuerza ejercida, que indicaron que las sondas estaban simultáneamente en contacto. Este método demostró que la alineación dentro de 0,004 ° el paralelo superficial era posible. Este 'nivelación de retroalimentación de fuerza' ahora se ha implementado en sistemas totalmente automatizados en dos informes independientes. 13 , 14 utilizar una tríada de sensores montados debajo del sustrato o sobre la matriz tanto medir la cantidad de fuerza ejercida al contacto entre la superficie y arreglos de discos de punta de prueba. Estos sistemas dan alta precisión, divulgación desalineamientos del ≤0.001 ° sobre una escala de 1 cm longitud,14 o ≤ 0,0003 ° sobre 1,4 cm.13 disponen de estos sistemas de alineación automática importantes ahorros en tiempo de operador y el tiempo total para completar el proceso de litografía.
Una aplicación importante de la fabricación superficial de alto rendimiento habilitado por esta tecnología es la generación de sustratos de cultivo celular. Ahora está bien establecido que fenotipo de la célula puede manipularse mediante el control de la interacción inicial entre las células y características superficiales, y que esto puede ser mejorado en la nanoescala. 15 específicamente, métodos de litografía de exploración sonda han demostrado ser un método fácil para producir una variedad de superficies nanofabricated para tales experimentos de cultivo celular. 16 por ejemplo, las superficies que presentan patrones de nanoescala de monocapas auto ensambladas y matriz extracelular proteínas con plantilla por PPL y DPN se han utilizado para estudiar el potencial de materiales nano-modificado en material inducido la diferenciación de células madre. 17
Este protocolo describe la utilización de un sistema de microscopio (AFM) de fuerza atómica modificado que permite gran superficie PPL. Detallamos la detección de la fuerza utilizando múltiples sensores de fuerza como los medios de determinar la superficie de la sonda de contacto, junto con un algoritmo que automatiza el proceso de alineamiento iterativo. Posterior funcionalización de estos patrones con la fibronectina de la proteína de matriz extracelular y la cultura de células madre mesenquimales humanas (hMSC) se describen como una manifestación de PPL fabricado superficies aplicadas para el cultivo celular.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexAFM montado en un motor de 5 ejes (XYZ&Theta; &Phi;) Traslación y etapa de goniómetro</td><td>NanoSurf</td><td>P40008</td><td></td></tr><tr><td>AFM software de control</td><td>NanoSurf</td><td>C3000</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo</td><td>de grabado Sigma-Aldrich</td><td>Z225568</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador</td> de <td>plasma Harrick</td><td>plasma PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>PlasmaFlo</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-FMG-2</td><td></td></tr><tr><td>Economía Bomba de servicio de oxígeno seco Harrick</td><td>plasma</td><td>PDC-OPE-2</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubos</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Desecador de vacío</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Sistema de purificación de agua</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ015WW</td><td></td></tr><tr><td>Generador de humedad modular</td><td>proUmid</td><td>MHG32</td><td></td></tr><tr><td>Proline Plus Pipeta 100-1000 &micro; L</td><td>Sartorius</td><td>728070</td><td></td></tr><tr><td>Silicon masters NIL</td><td>Technology</td><td>Microscopio</td><td></td></tr> de <tr><td>fluorescencia instantánea vertical</td> hecho a medida <td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Objetivos de microscopio</td><td>Olympus</td><td>10x y 60x UPlan FLN &infin;/-/FN 26.5</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio vertical de campo claro</td><td>Leica</td><td>DM 2500M</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonicador</td><td>Ultrawave Ltd.</td><td>U95</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de cálculo para registrar e interpretar los resultados de la alineación automatizada</td><td></td><td>Microsoft Excel</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34863</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio INFLAMABLE Sildes, Transparente, Molido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>451000</td><td></td></tr><tr><td>(7&ndash; 8% de copolímero de vinilmetilsiloxano)-dimetilsiloxano, terminado en trimetilsiloxi</td><td>Gelest</td><td>VDT-731</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5,7-tetrametil-1,3,5,7-tetravinilciclotetrasiloxano</td><td>Gelest</td><td>SIT7900.0</td><td></td></tr><tr><td>Platino(0)-1,3-divinil-1,1,3,3-tetrametildisiloxano solución compleja</td><td>Sigma-Aldrich 479527</td><td></td><td>NOCIVO, TÓXICO(</td></tr><tr><td>25&ndash; 35% de metilhidrosiloxano)-copolímero de dimetilsiloxano, terminado en trimetilsiloxano</td><td>Gelest</td><td>HMS-301</td><td></td></tr><tr><td>Bote de pesaje 100 mL</td><td>Suministros de laboratorio científico</td><td>BALI828</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Appleton Woods</td><td>KS230</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ST10-031T</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de carbón</td><td>Agar científico</td><td>AGG3939</td><td></td></tr><tr><td>ácido 16-mercaptohexadecanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448303-1G</td><td>DAÑINO, TÓXICO</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td>INFLAMABLE</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio recubierto</td><td>de oro Sigma-Aldrich 643203</td><td></td><td>Una vez abierto, el oro permanecerá reactivo a los tioles durante al menos 1 mes</td></tr><tr><td>Tiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>NOCIVO, TÓXICO</td></tr><tr><td>Nitrato de hierro (III) no ahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529303</td><td>NOCIVO, TÓXICO</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84415</td><td>NOCIVO, TÓXICO(</td></tr><tr><td>11-Mercaptoundecil)hexa(etilenglicol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675105</td><td>NOCIVO, TÓXICO</td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de cobalto (II) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203106</td><td>PERJUDICIAL,</td></tr><tr><td>TÓXICO Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM Medio de crecimiento de células madre mesenquimales</td><td>Lonza UK</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Células madre mesenquimales humanas</td><td>Lonza UK</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1 Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga CELLSTAR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td>NOCIVO, TÓXICO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>"Detergente" en manuscrito</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración con vector DAPI</td><td> Laboratorios</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo antifibronectina para conejos</td><td>Abcam</td><td>ab2413</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-Conejo IgG (H+L) para cabras, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10253041</td><td></td></tr><tr><td>T75 tejido matraz de cultivo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790113</td><td></td></tr><tr><td>voladizo</td><td>BudgetSensor</td><td>ContAl-G</td><td></td></tr></tbody></table>

Área análisis sonda nanolitografía facilitado por alineación automática y su aplicación a la fabricación de sustrato para estudios del cultivo celular

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Microscopía de sonda ha permitido la creación de una variedad de métodos para la fabricación de arriba hacia abajo ('aditivo') constructiva características de escala nanométrica. Un inconveniente importante de la exploración de sondeo de litografía ha sido históricamente, el intrínsecamente bajo rendimiento de los sistemas de la sonda solo. Esto se ha abordado mediante el uso de arreglos de discos de múltiples sondas para Nanolitografía mayor rendimiento. Para llevar a cabo tal paralelo Nanolitografía, la alineación exacta de matrices de la sonda con la superficie del sustrato es vital, para que todos los sondeos hacen contacto con la superficie al mismo tiempo cuando comienza a modelar litográfico. Este protocolo describe la utilización de la litografía de pluma de polímero para producir características de escala nanométrica sobre áreas centímetro de tamaño, facilitadas por el uso de un algoritmo para la alineación rápida, exacta y automática de matrices de la sonda. Aquí, Nanolitografía de tioles sobre sustratos de oro muestra la generación de funciones con alta uniformidad. Estos patrones luego son funcionalizados con fibronectina para uso en el contexto de los estudios de morfología celular dirigido de superficie.

Para comprobar si la alineación automática había sido un éxito, se analizaron las gráficas trazadas desde los datos de alineación (en la hoja de cálculo en el paso 4.8). Donde el proceso de alineación han tenido éxito las dos parcelas, correspondientes al ángulo por el cual la etapa de la muestra haya sido inclinada a lo largo de los ejes θ y φ, mostraron una serie de levantamiento y descendentes puntos de datos. En cada una de las parcelas, dos ajustes lineales de los puntos de datos demostraron una intersección bien definido "pico" que indica la máxima z-extensión y el correspondiente ángulo en el que la alineación fue alcanzado (Figura 4A y 4B). Este proceso es repetido cuatro veces (es decir, dos veces para cada eje) y graficados como un conjunto de cuatro coordenadas. Así, la intersección de cada par de coordenadas muestra los ángulos en general óptimos (figura 4). 13 en casos donde la alineación no fue exitosa, se puede observar que su correspondiente θ y φ ángulo parcelas no dan ajustes lineales de buena calidad, o no se cruzan (figura 5). Estos alineamientos son típicamente como resultado de los arreglos de discos se mal ajustado o montado en el porta sondas (pasos 1.7, 1.8 y 2.2). En estos casos, los arreglos de discos se descartaron un nuevo preparado y había montado (pasos 1 y 2) y repite el proceso de alineación (paso 4).
Alineación exitosa y litografía con MHA de PPL, sustratos de oro estampados fueron luego reflejados usando microscopía de fuerza lateral para examinar si la deposición había producido. Se realizó también un examen de área más grande de las superficies impresas por microscopía óptica de los substratos después del grabado del oro no protegido por el tiol depositado (figura 6 y figura 7). Sin embargo, los patrones de grabado no pueden utilizarse para más funcionamiento y deben usarse únicamente para confirmar patrones en muestras representativas de un lote de sustratos superficie impresos. Si los patrones grabados muestran áreas en blanco correspondientes a jaulas individuales (figura 8), este resultado indica que la producción de arreglos de discos de sonda no se ha hecho con éxito, y que algunas sondas están dañada o falta. Esta inhomogeneidad de las sondas puede ser debido al uso de un viejo maestro donde la capa perfluorados ha desgastado (paso 1.3), dando por resultado algunas sondas rasgadas lejos cuando la matriz se separa del maestro. En estos casos, debe utilizarse un nuevo maestro. El resultado también puede deberse a la presencia de aire burbujas atrapado entre el vidrio del forro y el maestro (criterio 1.5), o si la matriz de la sonda no fue limpio separada del maestro después de curar (paso 1.8).
Imágenes de microscopia fluorescente de las superficies de fibronectina funcionalizado hMSCs incubados fueron también recogieron (figura 9). En general, todos los sustratos fueron estables en el ambiente de cultivo en vitro y las células se adhirieron y adaptaron su morfología a los patrones impresos en caso de menor aislada 20 x 20 matriz de características.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> Figura 1. Representación esquemática de la litografía de la pluma de polímero con transporte molecular de la tinta a través de un menisco de agua en la punta. (A) vista lateral y vista (B) superior de la matriz de polímero pluma indican que cuando el matriz de sonda y el substrato superficial estén completamente alineados, todas las sondas entran en contacto con la superficie al mismo tiempo, dando por resultado la litografía paralelizada. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> Figura 2. Diagrama esquemático de la litografía de polímero pen set arriba (A) vista lateral ampliada de configuración experimental donde la matriz de sonda preparado es ATA para soporte de la sonda y montada en escáner AFM. El sustrato se coloca en el escenario, debajo de que se encuentran los tres sensores de fuerza. (B) representación de la instrumentación montada, mostrando la cabeza de exploración AFM en relación con la etapa de la muestra. Vista inferior (C) que muestra la ubicación del sensor de fuerza. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> Figura 3. Representación esquemática que representa el programa de espectroscopia para el procedimiento de alineación. El escáner AFM se encuentra para mover las sondas hacia muestra a una distancia de 10 μm a 100 ms, en la posición de 250 ms, seguida de una contracción de 10 μm a 100 ms y luego destinados a 250 ms en la posición retraída. El movimiento se repite en todo el proceso de alineación. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> Figura 4. Gráficos que ilustran una alineación exitosa. Gráficos de posición en z contra los ángulos de inclinación (A) θ y φ (B) para una alineación exitosa, donde ● indica los valores reales medición y + indica el mejor ajuste con el método de mínimos cuadrados. (C) gráfico de φ contra θ había equipado ángulos con los cuatro puntos donde se alcanzó la máxima posición de z. El punto de intersección marcado es el ángulo de inclinación óptimo final en ambos ejes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> Figura 5. Gráficos que ilustran una alineación. Gráficas de posición z contra los ángulos de inclinación (A) θ y φ (B) para una alineación fracasada, donde ● indica los valores reales medición y + indica el mejor ajuste con el método de mínimos cuadrados. (C) gráfico de φ contra θ había equipado ángulos con los cuatro puntos donde se alcanzó la máxima posición de z. No optima claro o punto de intersección se observan y por lo tanto los ángulos de alineación óptima no se resuelven. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> Figura 6. Microscopía óptica ilustrativo e imágenes de microscopía de fuerza atómica de sustratos de oro que fueron estampados con MHA por las matrices PPL alineadas y entonces al. (A) y (B) son imágenes de microscopía óptica magnificada secuencialmente de los patrones de grabado; (C) es una imagen de la topografía AFM de una sola red de patrones. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> Figura 7. Imágenes de microscopía óptica ilustrativos de sustratos de oro que fueron estampados con MHA por las matrices PPL alineadas y luego al. (A) y (B) son imágenes de microscopía óptica magnificada secuencialmente de patrones de grabado al agua fuerte y (C) es una imagen de aumento más bajada que muestra área homogéneos patrones. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> Figura 8. Imagen de microscopía óptica ilustrativa de un substrato de oro que fue irregularmente estampado con MHA y luego al. Los patrones previstos (se muestra en la ilustración) estaban repitiendo rejillas de 20 líneas de puntos dispuestas en 20 líneas, con cada dos líneas producidas al aumentar el z-extensión de eje de 1 μm (desde 5-5 μm). Puede verse que en algunas zonas no se generan patrones, debido a las sondas que falta en esos lugares. En las zonas donde se producen sólo dos líneas de puntos, este resultado indica que una punta de prueba está presente pero no es de la misma altura que las puntas de prueba completamente funcional, tan único depósito ofrece cuando la matriz se extiende a todo z-distancia del eje. En esta imagen, el contraste ha sido alterado deliberadamente para permitir la observación de las zonas parcialmente impresas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> Figura 9. Imágenes de microscopía de epifluorescencia de hMSCs cultivadas en las matrices de la fibronectina con plantilla por PPL. (A) y (B) son imágenes de gran aumento que muestra las células individuales. (C) muestra un patrón de ejemplo de la matriz de fibronectina sin un adherente celular y (D) es una imagen de gran campo de las células cultivadas en un arreglo de rejilla (un esquema del patrón impreso también se muestra en la carátula). Las células se tiñen para mostrar fibronectina (rojo), F-actina (verde) y los núcleos (azul) de la célula. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí presentamos un protocolo para área amplia exploración sonda Nanolitografía habilitado por el alineamiento iterativo de arreglos de discos de punta de prueba, así como la utilización de patrones litográficos para estudios de interacción de la superficie de la célula.

Área análisis sonda Nanolitografía facilitado por alineación automática y su aplicación a la fabricación de sustrato para estudios del cultivo celular

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Existe una gran necesidad de herramientas convenientes para generar características y objetos a escala nanométrica, particularmente en el estudio de las interacciones biológicas con materiales y superficies nanoestructurados. Este protocolo permite la replicación rápida y homogénea de matrices de proteínas en áreas a escala centimétrica con resolución a nanoescala. Esto nos permite estudiar las interacciones de las células madre mesenquimales en estas superficies.Estas superficies del modelo nos permiten examinar las interacciones controladas entre variables específicas del material y las células madre mesenquimales, proporcionando criterios fundamentales de diseño de materiales que informarán futuros diseños de biomateriales. Para comenzar el procedimiento, mezcle bien los componentes del prepolímero PDMS en un bote de pesaje. Desgasifique la mezcla en un desecador al vacío durante 20 minutos o hasta que hayan desaparecido todas las burbujas de gas.A continuación, coloque el maestro de silicio para la matriz PPL en una placa de Petri de cuatro centímetros. Vierta la mezcla de prepolímero PDMS desgasificada sobre el maestro hasta que esté completamente cubierto. Desgasifica el PDMS cubriendo el maestro durante otros cinco minutos.Durante la desgasificación, trate un portaobjetos de vidrio con plasma de oxígeno durante un minuto. Después de la desgasificación, coloque con cuidado el portaobjetos en el PDMS con el lado tratado hacia abajo. Presione suavemente la corredera sobre el maestro de silicona para eliminar el aire atrapado y asegurarse de que una capa uniforme de PDMS quede intercalada entre el maestro y la guía.Transfiera la matriz PDMS intercalada a otra placa de Petri con el maestro de silicio en la parte inferior. Cura el PDMS en un horno a 70 a 80 grados centígrados durante 24 a 48 horas. Luego, retire la matriz PPL curada del horno y deje que se enfríe durante 15 minutos.Use una cuchilla de afeitar para recortar cuidadosamente el exceso de PDMS de la parte posterior y los lados del portaobjetos de vidrio. Sople los residuos sueltos de PDMS con un chorro de gas nitrógeno seco. Es importante recortar el exceso de PDMS de la parte posterior y los bordes de la matriz para permitir una alineación precisa.Esto también ayuda al usuario a observar mejor las condiciones de las sondas bajo el AFM durante la litografía. Coloque una hoja de afeitar en la esquina de la matriz a una profundidad de un milímetro y haga palanca con cuidado en la matriz del maestro de silicio con un solo movimiento de elevación continuo. A continuación, corte y raspe con cuidado 0,5 milímetros del PDMS en los bordes de la matriz con una cuchilla de afeitar.Los usuarios deben tener mucho cuidado al hacer palanca en las matrices del maestro para garantizar una buena separación y evitar dañar las sondas. Esto debe hacerse en una sola acción suave sin que las matrices vuelvan a caer en el maestro de silicio. Trate la matriz PPL con plásmido de oxígeno durante 30 segundos, luego deje caer 20 microlitros de agua desionizada sobre la superficie de la matriz.Si el agua no se distribuye uniformemente por todo el conjunto, repita el tratamiento con plasma. Seque completamente la matriz tratada con plasma, luego use cinta de carbono de doble cara para sujetar la matriz al soporte de la sonda de microscopía de fuerza atómica. Monte el soporte de la sonda en el soporte cinemático AFM.Para entintar la matriz, aplique una gota de 20 microlitros de una solución MHA de un milimolar en etanol a la matriz, evitando el contacto entre la punta de la pipeta y la superficie de la matriz. Permita que la solución MHA se extienda por toda la matriz. Espera a que el etanol se evapore.Monte el soporte de la sonda con la matriz PPL en el AFM, luego coloque un sustrato de oro en el centro de la etapa de muestra del AFM. Fije el sustrato en su lugar con cinta adhesiva. Para comenzar la alineación, ejecute el programa de configuración del controlador de etapa para restablecer todos los ejes y ángulos a un punto cero precalibrado.Utilice la consola de control de los ejes X e Y de la etapa de muestra de AFM para mover el sustrato a la ubicación de impresión deseada. Cambie la palanca de liberación de la etapa para liberar la etapa de muestra y activar los sensores de fuerza. Deje que los sensores se equilibren durante al menos 15 minutos, luego use el controlador del eje Z para elevar la etapa de muestra hasta que la matriz esté visualmente lo más cerca posible del sustrato.Asegúrese de que la matriz esté a menos de un milímetro del sustrato. A continuación, abra el programa de alineación automática. Rellene el paso de ángulo, la distancia de paso grueso y la distancia de paso fino.Establezca la ruta del archivo de hoja de cálculo y adjunte la plantilla de hoja de cálculo. A continuación, abra el software de control AFM y navegue hasta la sección de espectroscopia. Configure la oscilación del eje Z del cabezal de escaneo para que se extienda 10 micrómetros durante 100 milisegundos, manténgalo presionado durante 250 milisegundos, se retraiga 10 micrómetros durante 100 milisegundos y manténgalo presionado durante 250 milisegundos.Inicie la oscilación del cabezal de escaneo y ejecute la alineación automatizada. Una vez que el software indique que la alineación ha finalizado, finalice el proceso de alineación. Inspeccione el ajuste lineal generado automáticamente de los datos de alineación para determinar si la alineación se realizó correctamente e identificar los ángulos óptimos generales, luego eleve la etapa de muestra en incrementos de 500 nanómetros hasta que se observe el contacto entre la matriz y el sustrato con la cámara de visión superior AFM.Haga clic en Detener en el software de control AFM para retraer la matriz 10 micrómetros. Para comenzar el proceso PPL, abra la sección de litografía del software de control AFM. Seleccione el modo de funcionamiento de modulación Z y navegue hasta el patrón de litografía que se va a importar.Rellene el tamaño del patrón que se va a generar. Establezca el desplazamiento de origen en 25 micrómetros en los ejes X e Y, luego seleccione la posición Z absoluta de modulación, configure el instrumento para simplificar a dos capas y establezca los valores de blanco y negro en cinco y cinco micrómetros negativos, respectivamente. Haga clic en Aceptar para aplicar la configuración y cerrar la ventana.Abra el editor de capas desde la ventana de litografía y establezca el tiempo de pausa. A continuación, baje la cámara de aislamiento atmosférico sobre el AFM y abra su software de control. Establezca una humedad relativa del 45%, una temperatura de 25 grados centígrados y un caudal de intercambio atmosférico de 500 mililitros.Implemente los ajustes y espere a que se alcance el nivel de humedad deseado. A continuación, inicie la secuencia litográfica. Una vez finalizada la litografía, retraiga la etapa 500 micrómetros.Retire la cámara de aislamiento atmosférico. Bloquee la etapa de muestra para desactivar los sensores de fuerza. Por último, retire el sustrato de la plataforma para su visualización o posterior procesamiento.PPL se utilizó para producir patrones homogéneos a gran escala de cuadrículas de matriz fina o imágenes detalladas. Los patrones se visualizaron para microscopía óptica mediante el grabado del oro no protegido por el tiol depositado. Un patrón irregular indicaría sondas dañadas o faltantes.Las matrices de MHA impresas en oro con PPL se funcionalizaron con fibronectina y se incubaron con células madre mesenquimales humanas. Las células individuales se adhirieron a las matrices funcionalizadas con fibronectina, adaptando su morfología a los patrones cuando fue necesario. Esta técnica PPL se puede utilizar para depositar una amplia gama de patrones de proteínas para experimentos de biología celular.Un usuario competente puede generar patrones como los que se muestran en unas tres horas. Recuerde que la preparación meticulosa de la matriz es la clave del éxito. La técnica PPL es bastante genérica y se puede utilizar para la deposición de compuestos que van desde moléculas pequeñas hasta polímeros y biomoléculas, allanando el camino para una variedad de estudios en química, biología y ciencia de los materiales.

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