Name: Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprende a generar knockouts génico con CRISPR/Cas9 en Danio rerio mediante microinyección y secuenciación. Este protocolo robusto permite identificar mutaciones y estudiar funciones genéticas en biología del desarrollo.

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R21CA182197 a f), el Ralph W. y gracia M. Showalter investigación confianza y por la ciencia agrícola de Purdue y extensión para el programa de desarrollo económico (AgSEED). Datos de secuenciación de Sanger fueron adquiridos por la instalación de Purdue Genomics Core apoyada por CA023168 P30. Mary Witucki fue apoyado por el centro de la Universidad de Purdue para cáncer investigación verano pregrado programa de investigación apoyado por la Asociación de cáncer del Condado de Carroll. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio recolección de datos y análisis, publicación y preparación del manuscrito. Agradecemos a Benjamin Carter, Ellen Denning y Taylor Sabato para proporcionar retroalimentación crítica sobre el manuscrito. Agradecemos al Departamento de bioquímica para el soporte de este trabajo y el centro de investigación del pez cebra en la Purdue University por su dedicación en el cuidado y bienestar de nuestra colonia de pez cebra. Finalmente, agradecemos a las instalaciones de base genómica de Purdue, y contribuciones de Phillip San Miguel con respecto a los servicios NGS.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe la producción de knockouts de genes en el sistema de vertebrados modelo de pez cebra CRISPR Cas9 tecnología. Un número de protocolos se han descrito previamente para llevar a cabo la ingeniería del genoma mediada por CRISPR en pez cebra15,25,26,50,51,52. Este protocolo basa en esfuerzos anteriores por combinación de una serie de técnicas experimentales sencillo y reproducible consistentes, en particular HMA y NGS de múltiples peces heterozigótico, para crear un sencillo, económico y protocolo experimental robusto para CRISPR-mediada mutagénesis en el pez cebra es apropiado para laboratorios dotados de personal con una gama de formación y experiencia, así como laboratorios de enseñanza.
Recomendaciones para el diseño y síntesis de guía que RNAs se incluyen en este protocolo. Una consideración importante en la guía de diseño de RNA es la minimización de los efectos off-target. Varios algoritmos de predicción se han desarrollado para permitir a los usuarios de CRISPR acceder a herramientas de cómputo con interfaces gráficas fáciles de usar que predicen tanto la actividad de la guía en el destino y la posibilidad de efectos off-target34, 35,36. Una ventaja específica del sistema pez cebra es bajar las tasas de efectos off-target porque la Cas9 es inyectada en los embriones y por lo tanto la expresión es transitoria, que se ha demostrado en ratones para provocar disminución efectos off-target53. Sin embargo, se han demostrado efectos off-target en pez cebra54. Una forma de control para efectos off-target es fenotipo fundador pez cebra que han sido generados por dos RNAs guía independiente que el mismo gen, ya que estas guías sería muy probables que afectan a diferentes sitios de fuera de objetivo. Un método alternativo para reducir al mínimo efectos off-target que se describe en este protocolo es el uso de un Cas9 mutado que genera roturas de la hebra en el ADN, Diana que se reparan con alta eficiencia. Asociación ADN nicks cerca uno del otro que son complementarios al contrario filamentos resultados en indel eficaz de formación en el lugar deseado y minimiza los efectos off-target55,56.
Además de tener diferentes tipos de efectos off-target, sgRNAs diferentes pueden tener diferentes tipos de mutagénesis de la deseado57,58,59. Este protocolo utiliza HMA para analizar la eficiencia de mutagénesis de un sgRNA dado uso del heterodúplex banda formación33,40. Bandas del heterodúplex son creados por hibridación de los filamentos de la DNA generados por PCR que contienen uniones mal hechas y pueden resolverse fácilmente mediante electroforesis en gel. A diferencia de otros métodos comúnmente utilizados para medir formación indel, tales como la endonucleasa T7 análisis o alta resolución derretir análisis25,26, HMA no requiere la costosa enzima para cortar DNA no coinciden y no requiere complicada análisis de PCR se funden las curvas. Lo importante, también uso de HMA para verificar las altas tasas de formación de indel en la población inyectada permite el investigador minimizar la cantidad de pescado necesaria para posterior producción de líneas de knock-out, que reduce el coste de identificación de una mutación con la características deseadas.
La relativa facilidad de generar indels CRISPR base permite la creación de múltiples alelos de varios genes a la vez. Software basado en web está disponible para el análisis de mutaciones individuales de peces heterocigotos con Sanger secuenciación de productos PCR49. En el caso donde se analizan tres o más alelos mutados CRISPR, NGS para caracterizar la naturaleza de la indel es probable ser más costo efectiva para caracterizar la naturaleza de indel como este enfoque permite una piscina de hasta 50 alelos diferentes para caracterizar o na (véase Tabla de materiales)60,61,62. Tales economías de escala probablemente sería particularmente útil en un entorno de laboratorio pregrado.
En Resumen, este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para generar reproducible CRISPR-reactivos de alta calidad (en particular, sgRNA) que menos peces adultos necesitan ser creados y analizados para identificar con éxito los alelos mutantes de interés, que también reduce el tiempo y el costo de generar las líneas de la deseada. Lo importante, este protocolo se ha diseñado tal que se puede aplicar en laboratorios con recursos limitados para producir pez cebra mutante de una forma asequible. Además, hemos encontrado que este enfoque es adecuado para estudiantes y así, amplía las oportunidades de educación y formación de estudiantes de pregrado interesados en la experiencia práctica en la edición del genoma basado en CRISPR.

La conservación de la maquinaria molecular en eucariontes es la base de la potencia del uso de organismos modelo para la investigación. Muchos de estos sistemas modelo facilitan el uso de enfoques genética reversa como knockouts de genes específicos para caracterizar la contribución de un producto del gene a un proceso biológico o enfermedad de interés. Técnicas de interrupción de genes en organismos como el pez cebra han dependido históricamente de introducción dirigida de mutaciones del mutágeno ' frameshift ' que resultan de reparación imprecisa de distritales1,2. Cuando un DSB se introduce en el genoma, la lesión del ADN se repara a través de dos vías que están universalmente presentes en casi todos los tipos de células y organismos: no homóloga se terminan uniendo (NHEJ) y dirigido por homología reparación (HDR)3,4 . La naturaleza imprecisa de la maquinaria NHEJ con frecuencia produce indels de varias longitudes5,6,7,8,9. Introducción de mutaciones del mutágeno ' frameshift ' en la secuencia de codificación de un gen puede producir un codón de parada prematuro, que a menudo hace que el gen no funcional.
Principios estrategias de ingeniería de genoma en el pez cebra para promover indels incluyen meganucleases, las nucleasas de dedos de zinc y nucleasas de efectoras como activador de transcripción, que utiliza las interacciones DNA proteína para una nucleasa para un específico de la genómica destino donde introdujo un DSB10,11,12,13,14,15. Sin embargo, estas tecnologías son a menudo difíciles de aplicar debido a la ingeniería laboriosa y complejo, necesaria para generar una nucleasa que dirige la secuencia de ADN de interés. A diferencia de estrategias anteriores, edición basada en CRISPR gene no depende de las interacciones DNA proteína para apuntar. En cambio, la endonucleasa CRISPR-asociado (Cas) se dirige a través de una guía de RNA que utiliza la base de interacciones de apareamiento de nucleótidos a un sitio de genómico de interés16,17,18,19 ,20,21. Debido a la simplicidad del diseño de un RNA guía con la base deseada vinculación interacciones para apuntarlo es relativamente fácil tratar la endonucleasa de Cas para el locus deseado. El tipo sistema de II CRISPR en particular ha sido ampliamente desarrollado para aplicaciones de edición de genoma debido a varias características ventajosas incluyendo el uso de una sola multidominio Cas nucleasa (Cas9) que requiere la interacción con el ADN para estimular la actividad de endonucleasa y uso de un guía única RNA (sgRNA) dirigirse al cognado de secuencia de ADN18. Los requisitos de la secuencia necesarios para atacar lo sgRNA cognado son bien entendido19y lo sgRNA deseada se genera fácilmente por en vitro de la transcripción. La sencillez y la solidez del enfoque CRISPR/Cas9 facilita enormemente la modificación genética dirigida en pez cebra y una amplia variedad de otros organismos.
La mayor capacidad a llevar a cabo la edición del genoma específica en el pez cebra como resultado de la elaboración de reactivos basados en CRISPR tiene significativamente mayor la oportunidad de estudiar procesos emblemáticos de organismos vertebrados tales como el desarrollo de la central nerviosa sistema. El genoma del pez cebra contiene ortólogos del 70% de los genes de codificación de la proteína encontrados el genoma humano así como el 84% de los genes asociados con enfermedades en los seres humanos22. Desarrollo del pez cebra presenta varias cualidades claves que potencian su uso en estudios genéticos reversos: los embriones se colocan en grandes garras, desarrollar desde el exterior de la madre lo que los hace susceptibles de genética manipulación por microinyección y pez cebra adulto sexualmente maduros por 3 meses de edad, lo que permite la propagación rápida de líneas deseada23.
Existen numerosos protocolos que describen una variedad de enfoques para generar e identificar derivados CRISPR indels en pez cebra24,25,26,27,28,29 ,30,31. Sin embargo, muchos de estos procedimientos son tiempo intensivo, requieren el acceso a equipos costosos y pueden ser un desafío para los laboratorios con limitados conocimientos. Los pasos descritos proporcionan una sencilla, robusta y económica CRISPR/Cas9 estrategia Ingeniero pez cebra nocaut líneas. Este protocolo describe el uso de un equipo altamente eficiente para sintetizar sgRNAs usando oligonucleótidos de DNA (oligos), similar a otros enfoques que han sido descritas32. El protocolo descrito incluye dos pasos en particular que simplifican grandemente el análisis de líneas CRISPR-transformado: paso a paso uso de HMA basada polimerización en cadena33 para determinar fácilmente la presencia de modificaciones del genoma y el análisis de la secuencia de pez cebra heterozigótico para rápida y fácilmente determinar la naturaleza de indels múltiples de una manera económica. Además, instrucciones paso a paso se incluyen para selección robusto, producción confiable y la inyección de guía RNAs. Los pasos indicados aquí son un ejemplo de un protocolo robusto, relativamente barato que permite que el personal de laboratorio con una gama de conocimientos contribuir a la identificación de los knockouts de genes en el pez cebra.

<table><tbody><tr><td>Software de análisis de sgRNA</td> <td>CRISPOR</td><td></td><td></td>. http://crispor.tefor.net/</tr> <tr><td>Software de análisis de sgRNA</td> <td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td>. https://omictools.com/breaking-cas-tool software de</tr><tr>análisis de <td>sgRNA</td> <td>ChopChop</td><td></td><td></td>. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td>Diseño de cebadores PCR. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr>Técnica <td></td><td></td><td>libre de RNasa</td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>agua libre de RNasa</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Síntesis de RNAs guía. Tanto Thermo Fisher como Qiagen transportan agua adecuada.</td></tr><tr><td>Etanol sin ARNasa</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>El etanol de grado de biología molecular no contiene Rnasa. Fischer, VWR vende etanol adecuado.</td></tr><tr><td>Proteína Cas9 PNA</td><td>Bio</td><td>CP01</td><td>Proteína Cas9 con señal de localización nuclear.</td></tr><tr><td>Dirigirse a oligonucleótidos específicos</td><td>Tecnologías integradas de ADN (IDT)</td><td></td><td>Sintetizar ARN guía.</td></tr><tr><td>Cebadores de PCR guía de flanqueo Sitio de corte de ARN</td><td>Tecnologías de ADN integradas (IDT)</td><td></td><td>Uso para análisis heterodúplex, producto de 100-300 pb.</td></tr><tr><td>Cebadores de PCR guía de flanqueo Sitio de corte de ARN</td><td>Tecnologías de ADN integradas (IDT)</td><td></td><td>Uso para secuenciar alelos CRISPR, producto recomendado de 300-600 pb.</td></tr><tr><td>Kit de síntesis de sgRNA EnGen</td>, <td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>ARN guía transcritos in vitro.</td></tr><tr><td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>Tampón sin RNasa para electroforesis de ácidos nucleicos.</td></tr><tr><td>6X Load Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>Cargando ADN para electroféresis.</td></tr><tr><td>Acetato de amonio 5M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>Reactivo de limpieza para la purificación de ARN guía.</td></tr><tr><td>Etanol (200 grados, sin nucleasas)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Reactivo de limpieza para la purificación de ARN guía. Los materiales de grado molecular están libres de ARNasa.</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para la síntesis y purificación de ARNs guía.</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher</td><td>10328011</td><td>Elimina la contaminación por RNasa de superficies, equipos y cristalería.</td></tr><tr><td>Escalera de ADN, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>Estándares de peso molecular para electroforesis en gel de ADN.</td></tr><tr><td>Escalera de ADN, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>Estándares de peso molecular para electroforesis en gel de ADN.</td></tr><tr><td>Escalera de ARN</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>Marcador de ARN monocatenario para verificar que se ha sintetizado sgRNA de longitud completa</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Gel de poliacrilamida de fundición.</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Gel de poliacrilamida para fundición.</td></tr><tr><td>40% Poliacrilamida (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>Gel de poliacrilamida desnaturalizante para fundición.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>Gel de poliacrilamida desnaturalizante para fundición.</td></tr><tr><td>Gel de ARN Colorante de carga (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>Guía de carga de ARN en gel desnaturalizante para electroforesis.</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Visualización de ácidos nucleicos.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>Método alternativo al bromuro de etidio para la detección de dsDNA en geles de agarosa o poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Limpieza de ARN, purificación por PCR.</td></tr><tr><td>MyTaq Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>Para la amplificación de ADN mediante PCR.</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>de amplificación PCR.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro:</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>de NanoDrop o producto relacionado para cuantificar la cantidad de ADN/ARN.</td></tr><tr><td>Medios de embriones E3 Medios</td><td>hechos en casa</td><td></td><td>para la crianza de embriones y la fabricación de placas de inyección. Receta: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Añadido a 1x medio E3 para prevenir el crecimiento de hongos en los embriones.</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>Almacenar embriones, placa de inyección fundida.</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Denville</td><td>CA3510-8 Placa de inyección de</td><td>fundición, geles de agarosa.</td></tr><tr><td>Molde de microinección</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>Para crear pocillos para contener embriones durante la inyección.</td></tr><tr><td>Rojo de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290&nbsp;</td><td>Colorante para la visualización de la inyección.</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>Para calibrar el volumen de inyección de la aguja.</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Traslado de embriones.</td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>Aguja de inyección de corte, corte de cola de peces adultos.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Mantenimiento de embriones a 28.5 oC.</td></tr><tr><td>Extractor de pipetas de vértice</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>Agujas Geneate para inyección. Instrucciones adicionales para la extracción de la aguja: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Agujas Geneate para inyección.</td></tr><tr><td>Puntas de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Cargue la solución en agujas de inyección.</td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>Inyección de embriones.</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td></td><td>Inyección de embriones.</td></tr><tr><td>30% Poliacilamida (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>Fundición en gel heterodúplex.</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaína)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>Anestesiar el pez cebra para el corte de la cola y la extracción de ADNg de embriones. Receta:</td></tr><tr><td>https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE microondas</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Placa de inyección de fundición, geles de agarosa.</td></tr><tr><td>Escala</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Placa de inyección de fundición, geles de agarosa.</td></tr><tr><td>Guantes</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para todos los aspectos del protocolo.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para expulsar líquido del capilar para la inyección embrionaria.</td></tr><tr><td>1.000 y micro; L&nbsp; consejos</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para todos los aspectos del protocolo.</td></tr><tr><td>200 y micro; L consejos</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para todos los aspectos del protocolo.</td></tr><tr><td>10 y micro; L consejos</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para todos los aspectos del protocolo.</td></tr><tr><td>Tubos de tiras PCR</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para todos los aspectos del protocolo.</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Para todos los aspectos del protocolo.</td></tr><tr><td>Plataforma de secuenciación NGS: Wideseq</td><td></td><td></td><td>Si su institución no ofrece este servicio, visite: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (Costo externo: $35).</td></tr><tr><td>Software para el análisis</td><td></td><td></td><td>de secuencias Para la secuenciación Sanger de peces heterocigotos. Visite: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr> <tr><td>Software para el análisis</td><td></td><td></td><td>de secuencias SnapGene Viewer, Escáner de secuencias para el análisis de secuenciación NGS.</td></tr></tbody></table>

producción eficiente y genera identificación de crispr/cas9 gene knockouts en el sistema modelo danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Caracterización de los clusters, regularmente otro, corto, palindrómico repetir (CRISPR) sistema de Streptococcus pyogenes ha permitido el desarrollo de una plataforma personalizable para rápidamente generar modificaciones gen en una amplia variedad de organismos, incluyendo peces cebra. La edición del genoma basado en CRISPR utiliza a una guía única RNA (sgRNA) a una endonucleasa CRISPR-asociado (Cas) a un objetivo de ADN (gDNA) genómica de interés, donde la endonucleasa Cas genera una rotura de doble cadena (DSB). Reparación de distritales por mecanismos errores conducen a inserciones y/o deleciones (indels). Esto puede causar mutaciones del mutágeno ' frameshift ' que a menudo introduce un codón de parada prematuro dentro de la secuencia de codificación, creando así un alelo nulo de proteínas. Ingeniería basada en CRISPR genoma requiere sólo unos pocos componentes moleculares y se introduce fácilmente en embriones de pez cebra por microinyección. Este protocolo describe los métodos utilizados para generar reactivos CRISPR para microinyección de pez cebra y para identificar los peces que transmisión del germline de los genes modificados CRISPR. Estos métodos incluyen la transcripción in vitro de sgRNAs, microinyección de reactivos CRISPR, identificación de indels inducida en el sitio de destino utilizando un método polimerización en cadena-basado llamado un ensayo de movilidad del heterodúplex (HMA) y caracterización de los indels con un rendimiento bajo y un potente secuenciación de próxima generación (NGS)-basado en el enfoque que puede analizar varios productos de PCR de peces heterocigotos. Este protocolo se optimiza para minimizar la cantidad de peces necesaria y el tipo de equipo necesitado para realizar los análisis. Además, este protocolo está diseñado para ser susceptibles de uso por personal de laboratorio de todos los niveles de experiencia incluyendo a estudiantes, lo que permite esta poderosa herramienta económicamente ser empleado por cualquier grupo de investigación interesado en la realización de base de CRISPR modificación genómica en pez cebra.

Los enfoques experimentales descritos en este protocolo se permiten para la producción eficiente y rentable de pez cebra líneas de knock-out CRISPR/Cas9 tecnología. Las figuras siguientes se han incluido en este artículo para facilitar la interpretación y solución de problemas de los resultados obtenidos utilizando este protocolo. Después de éxito de la producción y microinyección de CRISPR-reactivos, los embriones de pez cebra pueden ser analizados para fenotipos abiertos y para formación de indel con HMA. Un control útil para visualizar el éxito del experimento CRISPR es el uso de lo sgRNA descrito en paso 1.5 al gen productor de pigmento tirosinasa. Formación de indel Cas9-inducida en tirosinasa resulta en la pérdida de la pigmentación y se anotó fácilmente por 48 hpf (figura 1). Otro control útil para asegurar que la preparación de los reactivos CRISPR para inyección ha sido exitosa, es verificar que integral (120 nt) sgRNA ha sido sintetizado mediante un desnaturalización gel de poliacrilamida (figura 2, carril 1 y 2). Si ha sido degrado el ARN puede aparecer como un borrón de transferencia, por ejemplo carril de 3 (figura 2) muestra RNA degradado que no es conveniente para la inyección.
Para analizar la frecuencia de formación de indel de genes dirigidos por CRISPR Cas9 que no den lugar a fenotipos abiertos como tirosinasa, análisis HMA es un método simple y confiable. sgRNA/Cas9 embriones inyectados analizados resultados HMA en la formación de bandas del heterodúplex y reducción de la intensidad de la banda homoduplex (figura 4). La presencia de bandas del heterodúplex es más utilizada en este protocolo para identificar potenciales fundador de peces de los embriones microinyectados y como adultos (figura 4 y figura 5), para analizar la eficacia de transmisión de línea germinal de un fundador ( Figura 6) y para verificar la presencia de un indel en un pez heterocigoto de la F1 (figura 7). Los peces heterocigotos que contienen un indel son candidatos para NGS para identificar la naturaleza de la indel y para determinar si un codón de parada prematuro está presente en la región codificante del gen objetivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> Figura 1 : Embriones de pez cebra presentan un defecto de pigmento cuando se inyecta con un sgRNA contra tirosinasa en la etapa de una célula. (A) tipo de salvaje, uninjected embrión en 48 hpf y (B) inyección de embrión en 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> Figura 2 : Transcripción in vitro de sgRNA usando síntesis kit. Oligos se sintetizaron mediante transcripción en vitro de acuerdo con las instrucciones del kit sgRNA síntesis. 500 ng de ARN se ejecute en un gel de urea de las páginas como se describe. sgRNA cargado en los carriles 1 y 2 muestra una banda correspondiente a la longitud completa, intacta 120 nt RNA. Lo sgRNA en carril 3 muestra un ejemplo de RNA degradado que no es conveniente para la inyección.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> Figura 3 : Comparación de la salud de embriones hpf inyectado 24. Un embrión vivo (A) se convirtió a 24 hpf, se distingue fácilmente de un embrión que ha abortado desarrollo (B). Embriones que se asemejan a (B) o drásticamente alteración funciones para (A), tales como curvatura espinal o alteración cabeza y desarrollo del ojo debe ser quitada del plato. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> Figura 4 : Ensayo de movilidad del heterodúplex de Cas9 sgRNA microinyectados embriones de pez cebra. Piscinas de 5 embriones por cada muestra se colectaron en 72 hpf y gDNA fue extraído. El análisis del heterodúplex fue realizado como se describe, las muestras fueron cargadas igualmente con 500 ng de ADN. Carriles: M = marcador de bp 100; 1 = control uninjected; 2 = muestra inyección 1; 3 = muestra de inyección 2. Espera que el tamaño de banda = 98 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> Figura 5 : Ensayo de movilidad del heterodúplex de gDNA extraído de la cola de un pez cebra adulto inyectado CRISPR. Embriones que fueron inyectados con un sgRNA y proteína Cas9 crecieron hasta la adultez (3 meses). Pez B y C exhiben bandas del heterodúplex y posteriormente fueron criados para identificar indels germinales transmitidas; peces A no fue utilizado en el análisis posterior porque no exhibe una banda positiva del heterodúplex. Carriles: 1 = control de tipo salvaje; 2 = pescado A; 3 = pescado B; 4 = pescado C. espera banda tamaño = 98 BP <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> Figura 6 : Ensayo de movilidad del heterodúplex de solo embriones generados por la cría de un pez cebra F0 CRISPR inyectado a un pez de tipo salvaje para identificar del germline transmitido indels. Pez cebra fueron apareadas y se colectaron los embriones F1 de embriones solo 72 h. y el análisis del heterodúplex realizado como se describe. Carriles: 1 = control de tipo salvaje; 2-10 = un solo embrión de F1 por carril. Este gel muestra que 7 de cada 10 embriones muestran una banda positiva del heterodúplex, indicando una tasa de transmisión del germline del 70% de lo indel. Espera que el tamaño de banda = 98 BP <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> Figura 7 : Ensayo de movilidad del heterodúplex de clips de cola de pez cebra de F1 adultos. Peces adultos F1 fueron marcados por HMA para identificar indels. Peces que exhiben una banda positiva del heterodúplex fueron PCR amplificado y enviado para el análisis de la secuencia amplia para determinar la naturaleza de la mutación. Carriles (A): 1 = control de tipo salvaje; 2 = pescado una (4 bp canceladura, desajuste de bp 1). (B) estos F1 peces fueron identificados en el mismo fundador y aún Mostrar del heterodúplex diferentes patrones, lo que indica transmisión del germline de múltiples alelos modificados de un solo fundador. Carriles: 1 = control de tipo salvaje; 2 = pescado B (4 inserción de puntos de ebullición, desajuste de bp 7), 3 = pescado C (canceladura de 4 puntos, 4 desajuste de bp). Cada uno de estos indels crea un codón de parada prematuro en la secuencia de codificación del gene del destino, según lo determinado por NGS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar una edición genómica dirigida utilizando la tecnología CRISPR/Cas9 en pez cebra para diseñar knockouts de genes de una manera robusta y económica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel biológico de un gen en el contexto de un sistema modelo de vertebrados, como la forma en que un gen contribuye a los procesos de desarrollo en eucariotas de orden superior. Con estos procedimientos simples y robustos, el personal de laboratorio de todos los niveles de experiencia, incluidos los estudiantes universitarios, puede realizar modificaciones genómicas específicas en el pez cebra.Las personas nuevas en este método deben ser capaces de seguir las instrucciones paso a paso para identificar los objetivos genómicos óptimos para la mutagénesis CRISPR, realizar la microinyección de embriones de pez cebra e identificar alelos modificados. La demostración visual de este método es fundamental, ya que este método está destinado a estudiantes universitarios que pueden no estar familiarizados con una o más de las técnicas necesarias. En el protocolo de texto se proporcionan directrices para el diseño de oligonucleótidos específicos de plantilla para la producción de ARN guía.Para empezar, suspenda la proteína Cas9 en tampón para generar una solución de un miligramo por mililitro. Almacene esta solución en alícuotas listas para inyección a menos 80 grados Celsius para su uso posterior. A continuación, sintetice el sgRNA con un kit de transcripción in vitro como el sugerido en los materiales de este artículo según las instrucciones del fabricante.Purifique el sgRNA sintetizado utilizando una precipitación de acetato de amonio libre de ARNasa. Agregue 25 microlitros de acetato de amonio de cinco molares al ARN sintetizado y mezcle la solución por vórtice. A continuación, agregue 150 microlitros de etanol libre de nucleasa de 200 grados a la muestra.Y coloque la reacción en un congelador a menos 80 grados centígrados durante al menos 20 minutos. A continuación, centrifugar las muestras a máxima velocidad. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no alterar la bolita de ARN.Luego agregue un mililitro de etanol al 70% e invierta el tubo varias veces para lavar la sal residual del tubo. Vuelva a centrifugar a velocidad máxima a cuatro grados centígrados durante siete minutos. Utilice una pipeta P1000 para eliminar la mayor parte de la solución.A continuación, utilice una pipeta P200 para eliminar la mayor cantidad posible de la solución restante sin alterar el pellet. Teniendo cuidado de evitar la contaminación por ARNasa, seque el pellet en un espacio limpio hasta que no haya gotas de líquido visibles en el tubo. Vuelva a suspender el pellet en 30 microlitros de agua libre de ARNasa y utilice un espectrofotómetro para cuantificar el producto.Alícuota la solución para el almacenamiento a largo plazo a menos 80 grados centígrados. A continuación, mezcle de 300 a 500 nanogramos de sgRNA con un volumen igual de tinte de carga en gel de ARN 2X. A continuación, con una pipeta P1000, limpie cada uno de los pocillos de gel de agarosa de residuos con tampón de funcionamiento varias veces.Cargue las soluciones en los pocillos de gel de agarosa y haga funcionar el gel a 10 voltios por centímetro durante el tiempo suficiente para separar las bandas de ARN en el gel. El tiempo puede variar según el aparato de electroforesis. En general, el frente del tinte debe extenderse a 2/3 de la longitud del gel.A continuación, utilice una tinción de ácido nucleico para visualizar las bandas. El ARN intacto aparece como una sola banda, como en los carriles uno y dos que se muestran aquí. El ARN degradado se ejecuta como un frotis, como en el carril tres.Primero, prepare a los sujetos de pez cebra para la reproducción la noche anterior a realizar las inyecciones como se describe en el protocolo de texto. A continuación, combine la proteína Cas9 y el sgRNA en una proporción de dos a uno. Incubar la solución a temperatura ambiente durante cinco minutos mientras el Cas9 y el sgRNA forman un complejo de ribonucleoproteínas.A continuación, añada 0,5 microlitros de soluciones de rojo de fenol al 2,5% en suficiente agua libre de ARNasa para alcanzar un volumen final de cinco microlitros. Para preparar la aguja de inyección, utilice un extractor de micropipetas para extraer un capilar de vidrio de un milímetro. A continuación, corte la punta de la aguja de vidrio resultante con una cuchilla de afeitar para obtener una abertura en ángulo.Coloque la aguja en un micromanipulador conectado a un microinyector. Con un microscopio óptico, ajuste la presión de inyección hasta que la aguja inyecte constantemente un nanómetro de solución en la placa de Petri. Antes de realizar la microinyección de embriones, practique la preparación de agujas e inyecte embriones de control utilizando una solución de solo colorante y registre la supervivencia después de 24 horas de desarrollo.Debería ser capaz de obtener una supervivencia superior al 90% en comparación con un control no inyectado. A continuación, seleccione de 10 a 15 embriones como población de control y colóquelos en una placa de Petri etiquetada por separado. Con una pipeta de transferencia, alinee cuidadosamente los embriones restantes en una placa de inyección a temperatura ambiente.Bajo un microscopio de disección, inyecte un nanolitro de la solución en el saco vitelino de cada embrión. A continuación, devuelva los embriones inyectados a una placa de Petri etiquetada y cúbralos con 1X E3 medio con azul de metileno. Colocar los embriones inyectados en una incubadora a 28 grados centígrados durante 24 horas.A continuación, inspeccione los embriones inyectados para eliminar los individuos muertos o con un desarrollo anormal. Primero, recoja dos conjuntos de cinco embriones de 72 horas de edad de las placas que contienen embriones inyectados y un juego de cinco embriones de 72 horas de edad del grupo de control no inyectado en los tubos de microcentrífuga. Pipetear suavemente los medios de cada conjunto de embriones y anestesiarlos.Retire el anestésico después de dos minutos y agregue 45 microlitros de hidróxido de sodio de 50 milimolares. A continuación, incubar las muestras a 95 grados durante 10 minutos. A continuación, retire las muestras de la incubadora y deje que se enfríen a temperatura ambiente.Añadir cinco microlitros de un plorhidrato molar de tris y vortear las muestras vigorosamente. A continuación, centrifugar la solución a máxima velocidad a temperatura ambiente durante tres minutos. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN genómico a un nuevo tubo marcado y almacene el ADNg a menos 20 grados Celsius.Utilice los cebadores diseñados para amplificar alrededor de la región diana del sgRNA como se describe en el texto para amplificar un fragmento de PCR para el análisis heterodúplex. Utilice un kit de limpieza de PCR para purificar los productos de la reacción de PCR. Diluya las muestras en 30 microlitros de agua y utilice un espectrofotómetro para cuantificar el ADN.Coloque los tubos que contienen los amplicones de PCR en una rejilla flotante en un baño de agua hirviendo. A continuación, prepare un gel TBE de poliacrilamida al 15% con un 30% de poliacrilamida. Después de que el gel se fije, colóquelo en un aparato de electroforesis con tampón de funcionamiento TBE.A continuación, cargue 500 nanogramos de los productos de PCR recocidos y cargue un control junto a cada conjunto de muestras de sgRNA. Enciende el gel a 150 voltios durante dos horas y media o hasta que el frente del tinte esté en el fondo del gel. Crecen embriones de pez cebra inyectados hasta la edad adulta que muestran bandas heterodúplex en el HMA.Para interpretar el HMA, compare la intensidad de la banda homodúplex de la PCR del control no inyectado de tipo salvaje con las muestras inyectadas correspondientes. Si se ha producido un corte suficiente, la intensidad de la banda de los peces inyectados debe ser aproximadamente un 50% más baja que la del control de tipo salvaje. Para confirmar la presencia de indels en posibles peces padres fundadores, anestesiar al pez con tricaína al 0,004% y utilizar una cuchilla de afeitar limpia para eliminar de 1/2 a 3/4 de la aleta caudal.Luego, coloque la cola en 45 microlitros de hidróxido de sodio de 50 milimolares. Regrese el pez a un tanque de recuperación y realice la extracción de ADNg como se describió anteriormente. A continuación, realice un HMA en el ADNg de la pinza de cola para determinar si el individuo fue modificado con éxito por la inyección de CRISPR.Luego, cría los adultos que exhiben bandas heterodúplex en el ADN de la cola con peces de tipo salvaje. Seleccione el pez fundador para generar peces F1 en función del análisis de HMA de los estanques. Finalmente, secuenciar el ADNg del pez de interés para caracterizar la naturaleza del indel.Tras el éxito de la producción y microinyección de reactivos CRISPR, se analizaron los embriones de pez cebra para determinar los fenotipos manifiestos y la formación de indel mediante HMA. La formación de indel indel inducida por Cas9 en la tirosinasa da lugar a la pérdida de pigmentación y se obtiene fácilmente 48 horas después de la fertilización. La identificación de alelos modificados con CRISPR que no dan lugar a fenotipos de desarrollo manifiestos se realiza mediante HMA.La focalización exitosa del gen de interés da como resultado la formación de bandas heterodúplex y la reducción de la intensidad de la banda homodúplex, como en los carriles tres y cuatro. No olvides que trabajar con un organismo vertebrado conlleva responsabilidades éticas. Este protocolo describe estrategias que minimizan el número de peces cebra necesarios para obtener un knockout, un objetivo que debe tenerse en cuenta al realizar este procedimiento.Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para generar e identificar rápidamente el pez cebra portador de alelos modificados con CRISPR que se transmitirán en la línea germinal con alta eficiencia. Es importante destacar que esta técnica se ha optimizado para ser un enfoque de bajo costo accesible para estudiantes universitarios y otras personas con poca experiencia previa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar e implementar fácilmente un enfoque de eliminación de genes basado en CRISPR utilizando pez cebra.

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Investigación

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Genetics

Genética

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