Resonancia de plasmón superficial (SPR)

La resonancia de plasmones de superficie, o SPR, es el fenómeno subyacente detrás de ciertos biosensores sin etiquetas para evaluar las interacciones de unión y adsorción de biomoléculas. Los ensayos de unión que requieren etiquetado, como ELISA, pueden ser un proceso lento y pueden alterar la funcionalidad del analito. En SPR, las interacciones biomoleculares ocurren en un sensor especial hecho de una capa delgada de metal en una cara de un prisma. Al monitorear los cambios en la luz reflejada en la parte inferior del metal, los instrumentos SPR visualizan estas interacciones en tiempo real sin el uso de etiquetas. Este video presentará los principios de SPR, un procedimiento general para la obtención de imágenes de SPR y algunas aplicaciones en bioquímica.

Un sensor SPR generalmente está hecho de una capa delgada de un metal noble sobre la cara de un prisma. Para tomar lecturas del sensor, la luz se refleja desde la interfaz prisma-metal hacia un fotodetector. La luz reflejada tendrá una alta intensidad excepto en un cierto ángulo, relacionado con las propiedades electrónicas de la superficie metálica, conocido como "ángulo de resonancia del plasmón de superficie".

A medida que las moléculas se unen a la superficie, las propiedades electrónicas del metal cambian, lo que a su vez ajusta el ángulo. A medida que las nuevas proteínas se unen, formando complejos, el ángulo cambiará aún más. Al medir los cambios relativos en el ángulo SPR, las interacciones como estas se pueden monitorear en tiempo real.

Otra técnica llamada localizada, o "L"SPR, utiliza nanopartículas metálicas como superficie del sensor. Las propiedades que afectan al ángulo SPR están muy localizadas en cada nanopartícula, lo que mejora la sensibilidad y la resolución de la señal.

Cuando se investigan las interacciones de unión con el SPR estándar, el sensor generalmente se monta en una plataforma que se convierte en el piso de una celda de flujo en el instrumento. Las biomoléculas de interés son transportadas a través de la celda de flujo por una solución tampón. La superficie del sensor a menudo se recubre primero con un sustrato que tiene una alta afinidad por el metal. Esto asegura que una cantidad significativa de ligando, que a su vez se une al analito de interés, se inmovilizará en el sensor y reduce la probabilidad de que el ligando se disocie durante el procedimiento.

Una vez que el ligando está inmovilizado en el sensor, el analito fluye sobre el sensor en tampón. Al monitorear el cambio en el ángulo SPR a lo largo del tiempo a medida que el analito se une al ligando, se puede calcular la velocidad de unión y otra información cinética.

Los datos de reflectancia también se pueden utilizar para la obtención de imágenes SPR, o SPRi, dirigiendo la luz reflejada a un detector CCD. Esto produce una imagen de alto contraste y alta resolución de toda la superficie del sensor. Usando SPR y las técnicas relacionadas, se pueden responder preguntas sobre la afinidad molecular, la cinética, la especificidad y la concentración.

Ahora que comprende lo que se mide en un experimento SPR, veamos un procedimiento para investigar las tasas de unión.

Antes de comenzar el procedimiento, se deben preparar los búferes en ejecución y de muestra. El tampón de ejecución se utiliza para depositar el ligando en el sensor, y el tampón de muestra se utiliza para depositar el analito. El chip sensor se limpia cuidadosamente y se carga en una funda. Luego, el dispositivo se coloca en el instrumento, donde se convierte en la parte inferior de la celda de flujo. El software del instrumento está configurado para el experimento y el análisis posterior. Si es necesario, la superficie del sensor se imprima con un sustrato para capturar el ligando. El ligando fluye sobre la superficie del sensor en el tampón de ejecución, donde es capturado por el sustrato en la superficie del sensor.

A continuación, el analito en el tampón de muestra se pasa a través de la celda de flujo, donde se une selectivamente al ligando inmovilizado. El cambio en la reflectancia se traza y se compara con los controles para determinar las constantes de velocidad y otros datos cinéticos de reacción para la reacción investigada.

Ahora que entiendes cómo se realiza un experimento de SPR, veamos algunas otras aplicaciones de SPR en bioquímica.

Aquí, las imágenes SPR se utilizaron para evaluar proteínas con una matriz de once receptores en un sensor. Se prepararon gráficos 3D de reflectividad frente al tiempo y concentración de receptores a partir de los datos de reflectividad de cada proteína. Estos "perfiles" son característicos de cada proteína, por lo que podrían utilizarse posteriormente para la identificación de proteínas.

En este experimento, se estudiaron las secreciones celulares utilizando un sensor LSPR hecho a medida. El sensor también era compatible con SPRi y microscopía de fluorescencia. Al depositar la célula en el sensor, la interacción de las secreciones celulares con el conjunto de nanopartículas se pudo medir con alta resolución espacial.

Aquí, se investigó el uso de puntos cuánticos, semiconductores a nanoescala, como agente de mejora de la señal SPR mezclado con el analito. Este método mejorado de "nano-SPRi" se comparó con los ensayos de SPRi estándar y el método ELISA. El método nano-SPRi mejoró significativamente la sensibilidad y el límite de detección, a la vez que requería menos tiempo que el método ELISA.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la resonancia del plasmón de superficie. Este fenómeno se utiliza para monitorear e obtener imágenes de las interacciones biomoleculares sin el uso de etiquetas. Este video presentó los principios de SPR, un protocolo típico para realizar un experimento de SPR, y algunas aplicaciones de SPR en bioquímica.

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