Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

El objetivo general de este método es identificar las propiedades fenotípicas y el potencial de injerto de las células madre hematopoyéticas clonales o precursores de HSC durante el desarrollo embrionario murino. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hematopoyesis del desarrollo sobre las contribuciones únicas del linaje de los precursores clonales de HSC durante el desarrollo embrionario. La principal ventaja de esta técnica es que los precursores hemogénicos se analizan a nivel de una sola célula.

Esto permite la identificación de las propiedades fenotípicas únicas que distinguen a los precursores raros de HSC. Comience agregando Aorta-Gonada-Mesonephros, AGM, tejidos diseccionados de embriones entre 9,5 y 11,5 días después del coito a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene 10 mililitros de PBS suplementado con 10% de FBS en hielo. Cuando los tejidos se hayan asentado en el fondo del tubo, aspire el sobrenadante e inmediatamente agregue un mililitro de colagenasa al 0,25% a las muestras.

Después de 25 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados, detenga la reacción con un mililitro de PBS más FBS y use una punta de pipeta de un mililitro para triturar los tejidos de 20 a 30 veces hasta obtener una suspensión de una sola célula. A continuación, diluya las células con ocho mililitros más de PBS más FBS y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de bloqueo durante cinco minutos en hielo.

A continuación, añada 500 microlitros del cóctel de anticuerpos que le interese. Después de una incubación de 15 a 20 minutos en hielo, lave las células en ocho mililitros de PBS más FBS y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS fresco más FBS. Filtre las células a través de un filtro de células de 35 micrómetros en un tubo de cinco mililitros, lavando el filtro con tres mililitros adicionales de PBS más FBS para recoger todas las células y centrifugarlas nuevamente.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS más FBS y coloque las células en hielo. Para configurar las puertas para la clasificación en el modo de clasificación de una sola celda y de índice, cargue una pequeña alícuota de celdas en el citómetro de flujo y establezca la adquisición en el caudal más bajo. Abra un diagrama de área de dispersión frontal frente a área de dispersión lateral y establezca una puerta para incluir celdas de diferentes tamaños.

Abra un diagrama de área de dispersión hacia adelante frente a ancho de dispersión hacia adelante y un diagrama de área de dispersión lateral frente a ancho de dispersión lateral y establezca una puerta en cada diagrama para excluir los dobletes. Establezca un área de dispersión hacia adelante frente a un diagrama DAPI para controlar las celdas vivas. A continuación, cree un gráfico de receptor de proteína C anti-endotelial anti-vascular Cadherina frente a anti-proteína endotelial C y dirija las células que expresan el receptor de proteína C alto y positivo para Cadherina endotelial vascular.

Para clasificar índicamente las células de aorta-gonada-mesonefro, coloque una placa de 96 pocillos precultivada con células endoteliales AGM en medio libre de suero AGM más citocinas en el bloque de placa del citómetro de flujo y cargue la muestra experimental. Comience la adquisición de muestras y confirme que se ha seleccionado el modo de clasificación de índice de una sola celda para clasificar una sola celda en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Cuando se haya clasificado una célula en cada pocillo de la placa, coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos configurada a 37 grados Celsius y 5% de CO2 durante un máximo de siete días.

Al final del período de cocultivo, se pueden visualizar colonias hematopoyéticas de varios tamaños y morfologías utilizando un microscopio invertido con un aumento de 100X. Para analizar los clones por citometría de flujo, se utiliza una pipeta multicanal para disociar las células hematopoyéticas de las capas endoteliales sin separar las células endoteliales. A continuación, transfiera 100 microlitros de células a pocillos individuales de una nueva placa de fondo en V de 96 pocillos y devuelva la placa original de 96 pocillos que contiene los 100 microlitros restantes de células a la incubadora de cultivo de tejidos.

Granule las células en la placa inferior en V por centrifugación y elimine el sobrenadante invirtiendo y moviendo la placa con un solo movimiento rápido. Vuelva a suspender los pellets en cada pocillo con 50 microlitros de tampón de bloqueo a cuatro grados centígrados. Después de cinco minutos, agregue el cóctel de anticuerpos de interés a cada pocillo para una incubación de 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Al final de la incubación, lavar cada pocillo con 200 microlitros de PBS más FBS, agitando la placa al final de la centrifugación para desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender los gránulos en 50 microlitros de PBS más FBS y analice las células de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de flujo para detectar colonias que contengan potencial de células madre hematopoyéticas. Seleccionando los pocillos que contienen células con fenotipo de células madre hematopoyéticas mediante análisis de flujo, utilice una pipeta multicanal para resuspender los 100 microlitros restantes de células del cocultivo original y agregue cinco veces 10 al cuarto células de médula ósea de rescate en 100 microlitros de PBS más 2% de FBS a cada pocillo.

Después de la transferencia adoptiva de cada clon a animales receptores congénitos individuales irradiados letalmente, recoja muestras de sangre periférica de los animales injertados a intervalos regulares después del trasplante. Para identificar los clones con injerto a largo plazo, analice las muestras por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de flujo. Las propiedades fenotípicas de cada clon se pueden correlacionar con sus propiedades de injerto.

Las células madre prehematopoyéticas pueden enriquecerse con la positividad de Cadherin endotelial vascular y un alto nivel de expresión del receptor de proteína C endotelial. La tinción con otros anticuerpos conjugados con fluorocromo permite el análisis retrospectivo de parámetros fenotípicos adicionales que se pueden registrar para cada célula durante la clasificación del índice. Después de la clasificación del índice en cocultivos de células endoteliales aorta-gónada-mesonefros, los clones individuales se integran en la capa de células endoteliales aorta-gónada-mesonephros antes de que los clones comiencen a redondearse y formar grupos hematopoyéticos.

Después de cinco a siete días de cocultivo, se pueden detectar colonias de varios tamaños y morfologías. Aquí, se muestran cuatro colonias diferentes obtenidas después del cocultivo, con tres colonias que muestran diferentes proporciones de células madre hematopoyéticas fenotípicas junto con otros tipos de células más diferenciadas y la cuarta colonia que carece de células con expresión de marcadores de células madre hematopoyéticas. La transferencia adoptiva de la progenie de células clonadas permite evaluar la capacidad de injerto multilinaje a largo plazo de cada clon después de la contribución del donante a los compartimentos de células B y T mieloides de la sangre periférica del receptor a lo largo del tiempo.

Aunque la mayoría de las colonias que contienen células con un fenotipo de células madre hematopoyéticas lograron un injerto a largo plazo, el trasplante es necesario para confirmar un injerto funcional de múltiples linajes, ya que algunos clones pierden el injerto con el tiempo. El potencial funcional de las células madre hematopoyéticas de cada clon se puede correlacionar con los parámetros de clasificación de índice originales de ese clon para identificar sus características fenotípicas precisas. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el cultivo secundario de la progenie hematopoyética en el estroma que apoya el desarrollo de células B y T in vitro, para responder preguntas adicionales sobre los potenciales linfocitarios de los precursores hemogénicos individuales.