Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana

El objetivo general de este método es amplificar 16 SRRNA de leche humana y otras muestras de baja biomasa utilizando un protocolo semiautomatizado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo y las perturbaciones del microbioma humano en relación tanto con la salud como con la enfermedad. La principal ventaja de la técnica es que es semiautomatizada, relativamente fácil de realizar y adaptable a múltiples tipos de muestras, incluidas secreciones, hisopos y heces.

Después de descongelar y asignar leche entera de acuerdo con el protocolo de texto, centrifugar las muestras a 5000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para pellet las células. Utilice una espátula de plástico o una punta de pipeta de gran diámetro para eliminar la capa superior de grasa. Luego, sin alterar el pellet, retire todo el sobrenadante, excepto 100 microlitros.

Con un mililitro de PBS, vuelva a suspender y lave el pellet. A continuación, prepare un control negativo añadiendo un mililitro de PBS estéril a un tubo de cinco mililitros. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga limpio de un punto cinco mililitros y gírelo a 5000 veces G a temperatura ambiente durante un minuto.

A continuación, utilice una punta de pipeta filtrada estéril de 1000 microlitros para desechar toda la capa grasa sobrenadante. Para interrumpir y homogeneizar la muestra, agregue 600 microlitros de tampón de lisis que contiene beta mercaptoetanol al pellet y transfiera la suspensión a un tubo de perlas. Prepare un control positivo con tampón de lisis y 20 microlitros de la muestra bacteriana simulada.

Agite vigorosamente todos los tubos de cuentas durante 15 segundos. A continuación, caliente las muestras en un vórtice de temperatura controlada a 37 grados centígrados y de 700 a 800 RPM durante 10 minutos. Cargue los tubos en el juego de adaptadores de disruptores de muestra automatizados.

A continuación, batir las muestras a 30 hercios durante un minuto. Desmonte el juego de adaptadores y cámbielo manualmente con las placas de muestra del brazo robótico izquierdo al brazo robótico derecho del instrumento. Bead batió los tubos a 30 hercios durante otro minuto y luego centrifugó los tubos a 17, 200 veces G y 25 grados Celsius durante tres minutos.

Con una pipeta de 200 microlitros, retire todo el sobrenadante, teniendo cuidado de no tomar nada de la capa grasa en la parte superior o los residuos de perlas en la parte inferior de la muestra. Aplique el sobrenadante a las columnas homogeneizadoras. A continuación, centrifugar las columnas a máxima velocidad y a 25 grados centígrados durante tres minutos.

Transfiera 350 microlitros de eluid a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros del fabricante. Para aislar el ADN de acuerdo con el protocolo de texto, corte las tapas y alise los bordes de las columnas de espín individuales para el ADN y el ARN. Inserte la columna de centrifugado de ADN sin el tubo de recolección en el adaptador del rotor.

A continuación, deseche el tubo de recolección. A continuación, inserte los tubos de dos mililitros en vórtice en un agitador, siguiendo la tabla de carga del instrumento de purificación automática de ADN/ARN según las instrucciones del fabricante. Etiquete un punto cinco tubos de recolección de mililitros e insértelos en los adaptadores del rotor.

A continuación, coloque los adaptadores del rotor en la centrífuga siguiendo la tabla de carga del instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN. Después de insertar las puntas de filtro, el agua libre de RNasa y los reactivos en el bloque de reactivos del instrumento, cierre la tapa del instrumento y ejecute el programa de purificación de ADN personalizado en el instrumento. Cuando se complete la reacción, recoja la muestra que contiene tubos del agitador y, si queda alguna muestra, guárdela a menos 20 grados Celsius para almacenamiento a corto plazo o a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo.

Después de preparar el área de trabajo y la mezcla maestra de PCR, de acuerdo con el protocolo de texto, cargue de 50 a 100 microlitros de muestras de ADN en un adaptador de muestra de instrumento de 32 pocillos, siguiendo el mapa de placa de 96 pocillos. Para cada placa de PCR, configure dos controles negativos pipeteando 30 microlitros de agua PCR en un tubo de recolección limpio de un punto cinco mililitros. A continuación, coloque todas las muestras en el adaptador de muestras de instrumento de 32 pocillos con las tapas bloqueadas en la posición abierta.

En el adaptador de reactivo del instrumento, retire la tapa de cada cebador inverso con números de código de barras específicos de uno en uno. Para cargar el manipulador de líquidos robótico, coloque el adaptador de reactivo en posición B1.In evitar un efecto de borde, coloque con cuidado un borde del adaptador contra el lado de agarre y baje lentamente el otro borde. Asegúrese de empujar todas las esquinas de los adaptadores.

Coloque el adaptador de muestra en la posición C1, asegurándose de empujar todas las esquinas de los adaptadores. A continuación, vórtice la mezcla maestra de cinco mililitros. Abra la tapa y colóquela en la posición A en la mezcla maestra y el bloque de reactivos del instrumento.

Coloque la placa de PCR en el adaptador del instrumento de 96 pocillos que está diseñado para sostener placas de PCR con medio faldón. A continuación, inicie la ejecución y guárdela como un nuevo archivo. Una vez completada la ejecución, compruebe que no haya habido errores.

Luego use 12 u ocho tapas de tiras para sellar la placa. Realice un vórtice vigoroso y use un girador de placas de 96 pocillos para girar las placas durante un minuto. Finalmente, coloque la placa en hielo hasta que se traslade a la sala de postamplificación y se cargue en el termociclador.

Después de la amplificación por PCR, lleve a cabo el control de calidad y la preparación de la biblioteca de acuerdo con el protocolo de texto. El primer paso de control de calidad del protocolo sigue a la amplificación por PCR de la región 16SV4. Como se muestra aquí, se analizó un microlitro de producto de PCR de cada muestra por electroforesis para confirmar que estaba dentro del rango de tamaño esperado de 350 a 450 pares de bases.

Algunas muestras de leche materna generaron cantidades más bajas de un producto específico, lo que sugiere bajos niveles de ADN microbiano extraído en esas muestras o arrastre de inhibidores de PCR durante la extracción. La cuantificación del producto específico para cada muestra fue esencial para determinar el volumen requerido para la agrupación molar igual de las muestras para la secuenciación. Una biblioteca agrupada para la secuenciación dirigida suele estar dominada por un producto de PCR específico.

Si hay una cantidad significativa de producto no específico en la biblioteca, se debe agregar un paso de purificación de gel al flujo de trabajo. Los resultados de la secuenciación demuestran una alta diversidad en los taxones asociados con el microbioma de la leche humana y variabilidad en el número de recuentos de cañas de secuenciación para cada muestra. Por el contrario, la composición de los taxones y los recuentos de cañas para el simulacro bacteriano fueron comparables con los resultados obtenidos para el simulacro en ejecuciones de flujo de trabajo anteriores, lo que sugiere que la variabilidad observada para las muestras de leche humana es un resultado experimental auténtico y no una función de la variabilidad intrínseca del flujo de trabajo.

Si se deja un secuenciador funcionando durante la noche, esta técnica se puede realizar en dos días, para 12 a 24 muestras, si todas las muestras se amplifican en la ejecución inicial de PCR. De lo contrario, se necesita otro día de concha. Al intentar este procedimiento, es importante viajar solo desde el área pre-PCR hasta el área post-PCR para evitar la contaminación.

También es fundamental cambiar los guantes con frecuencia para evitar cualquier contaminación cruzada. No olvide que trabajar con muestras humanas puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el equipo de protección adecuado y los gabinetes de bioseguridad.