Name: Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a secuenciar el ARN ribosomal 16S de leche humana y muestras de baja biomasa mediante un protocolo semi-automatizado. Este método facilita el estudio del microbioma humano en salud y enfermedad.

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Nos gustaría agradecer a Helty Adisetiyo, PhD y Shangxin Yang, PhD para el desarrollo del protocolo. Apoyo total para el internacional materno pediátrico adolescentes SIDA clínico ensayos grupo (IMPAACT) fue proporcionada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud (NIH) números de premio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) y UM1AI106716 (IMPAACT LC), con cofinanciación de Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD) y el Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de los NIH.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Objetivo generación secuenciación de 16S rRNA es una técnica ampliamente utilizada, rápida para microbioma caracterización18. Sin embargo, muchos factores, incluyendo efectos de lote, contaminación ambiental, contaminación de la muestra, sensibilidad y reproducibilidad pueden adversamente afectar resultados experimentales y confundir su interpretación7,19 , 20. para mejor facilitar el análisis de 16S robu...

Las comunidades microbianas que colonizan seres humanos se creen que son críticamente importantes para la salud y la enfermedad que influyen en el metabolismo, desarrollo inmune, susceptibilidad a la enfermedad y las respuestas a la vacunación y medicamentos terapia1, 2. esfuerzos para comprender la influencia de la microbiota en la salud humana en la actualidad destacan la identificación de los microbios asociados con compartimentos anatómicos definidos (es decir, piel, intestinal, oral, etc.), así como de sitios localizados dentro de Estos compartimentos3,4. Estos esfuerzos de investigación que se basa es la rápida aparición y mayor accesibilidad de tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) que proporcionan una plataforma masiva y en paralelo para el análisis del contenido genético microbiano (microbioma) de una muestra. Para muchos las muestras fisiológicas, el microbioma asociado es complejo y abundante (es decir, heces), pero, para algunas muestras, el microbioma está representada por la baja biomasa microbiana (es decir, leche humana, tracto respiratorio inferior) donde sensibilidad, artefactos experimentales y posible contaminación se convierten en cuestiones importantes. Los desafíos comunes de microbioma estudios y el diseño experimental apropiado han sido objeto de varios artículos de revisión5,6,de7,8.
Presentados en este documento es una tubería experimental robusta de NGS en base específica secuenciación del rRNA 16S V4 región9 para caracterizar el microbioma de la leche humana. Análisis de microbioma de la leche humana son complicado no sólo por una de biomasa microbiana inherentemente baja10, pero además por altos niveles de ADN humano fondo11,12,13,14 y potencial remanente de PCR inhibidores15,16 en ácido nucleico extraído. Este protocolo se basa en kits de extracción disponibles en el mercado y plataformas semi-automatizadas que pueden ayudar a minimizar la variabilidad entre lotes de preparación de muestra. Incorpora una comunidad simulada bacteriana bien definida que es procesada junto a las muestras como un control de calidad para validar cada paso en el protocolo y proporcionar una métrica independiente de robustez de la tubería. Aunque el protocolo como se describe es específico para las muestras de leche humana, es fácilmente adaptable a otros tipos de muestras como heces, rectal, vaginal, piel, frotis oral y areolar10,17y puede servir como punto de partida para investigadores que deseen realizar análisis de microbioma.

<table><tbody><tr><td>AllPrep Mini kit de ARN/ADN</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>Kit de extracción de ADN/ARN</td></tr><tr><td>Eliminasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>Descontaminante de ARNasa, DNasa, ADN</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>tampón de vórtice con control de temperatura</td></tr><tr><td>RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>tampón de lisis de tiocianato de guanidinio/ Parte del kit</td></tr> <tr><td>Allprep&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig;-ME es un agente reductor que desnaturalizará irreversiblemente las RNasas al reducir los enlaces disulfuro</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>tubo de bolas</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td> juego <td>de adaptadores disruptores de muestra automatizados</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td></td><td></td> QIAgen RB <td>tubo de microcentrífuga del fabricante en kit</td></tr><tr><td>QIAcube y artículos de plástico relacionados</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>solución de descontaminación no enzimática</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>tampón de elución</td></tr><tr><td>QIAgility y artículos de plástico</td> <td>relacionadosQiagen</td><td>9001532</td><td>manipulador de líquidos robótico</td></tr><tr><td>PCR agua</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Imprimadores inversos con código de barras</td><td>Eurofin</td><td>No Catálogo # Diseñado</td><td>y ordenado</td></tr><tr><td>Placa PCR de 96 pocillos</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 y artículos</td> <td>de plástico relacionadosAgilent</td><td>G2964AA</td><td>analizador automatizado de fragmentos de ADN/ARN</td></tr><tr><td>Reactivos D1000 para Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>El tampón de muestra y la escalera forman parte de este kit</td></tr><tr><td>Kit de extracción de inhibidores de PCR OneStep Investigación</td><td>50444470 Zymo Research</td><td></td><td>La eliminación del inhibidor de PCR se realiza según las instrucciones del fabricante.</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td> Kit de limpieza de ADN <td>Qiagen</td><td>28104</td><td>: purificación de productos de PCR basada en membrana de sílice</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de dilución</td> y colorante <td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>a base de dimetilsulfóxido forman parte de este kit.</td></tr><tr><td>Qubit Fluorómetro</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Espectrofotómetro de microvolumen</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Kit MiSeq 300 V2</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>Sin catálogo # secuenciador de</td><td>próxima generación</td></tr></tbody></table>

un método de secuenciación de 16s específica de las muestras de leche humana

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Estudios de comunidades microbianas se han generalizado con el desarrollo de la secuencia relativamente barato, rápido y alto rendimiento. Sin embargo, al igual que con todas estas tecnologías, la reproducibilidad depende de un flujo de trabajo de laboratorio que incorpora controles y precauciones apropiadas. Esto es particularmente importante con las muestras de baja biomasa donde contaminantes ADN bacteriano pueden generar resultados engañosos. Este artículo detalla un flujo de trabajo semi automatizado para identificar microbios de las muestras de leche materna humana utilizando secuenciación específica de la región de V4 de ARN ribosómico (ARNr) 16S en una escala de bajo a medio throughput. El protocolo describe la preparación de las muestras de leche entera, incluyendo: lisis, extracción de ácidos nucleicos, la amplificación de la región V4 del gene del rRNA 16S y preparación de la biblioteca con las medidas de control de calidad de la muestra. Lo importante, el protocolo y la discusión consideran cuestiones que son salientes a la preparación y análisis de muestras de baja biomasa incluyendo controles positivos y negativos adecuados, eliminación de inhibidor de la polimerización en cadena, contaminación de las muestras ambiental, reactivo, o fuentes experimentales y experimentales mejores prácticas destinadas a garantizar la reproducibilidad. Mientras que el protocolo como se describe es específico para las muestras de leche humana, es adaptable a numerosos tipos de muestras de biomasa de baja y alta, incluyendo las muestras recogidas en torundas, congelados aseado o estabilizado en un buffer de conservación.

El protocolo que presentamos incluye pasos importante control de calidad (QC) para asegurar que la reunión de datos generados puntos de referencia para el control de sensibilidad, especificidad y la contaminación de protocolo. Primer paso de control de calidad del protocolo sigue la amplificación por PCR de la región 16S de V4 (figura 2). Un μl del producto de PCR de cada muestra se analizó por electroforesis para confirmar que estaba dentro del rango de tama...

Se presenta un flujo de trabajo semi-automático para específica secuenciación de 16S rRNA de la leche humana y otros tipos de biomasa, bajo muestra.

Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

El objetivo general de este método es amplificar 16 SRRNA de leche humana y otras muestras de baja biomasa utilizando un protocolo semiautomatizado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo y las perturbaciones del microbioma humano en relación tanto con la salud como con la enfermedad. La principal ventaja de la técnica es que es semiautomatizada, relativamente fácil de realizar y adaptable a múltiples tipos de muestras, incluidas secreciones, hisopos y heces.Después de descongelar y asignar leche entera de acuerdo con el protocolo de texto, centrifugar las muestras a 5000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para pellet las células. Utilice una espátula de plástico o una punta de pipeta de gran diámetro para eliminar la capa superior de grasa. Luego, sin alterar el pellet, retire todo el sobrenadante, excepto 100 microlitros.Con un mililitro de PBS, vuelva a suspender y lave el pellet. A continuación, prepare un control negativo añadiendo un mililitro de PBS estéril a un tubo de cinco mililitros. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga limpio de un punto cinco mililitros y gírelo a 5000 veces G a temperatura ambiente durante un minuto.A continuación, utilice una punta de pipeta filtrada estéril de 1000 microlitros para desechar toda la capa grasa sobrenadante. Para interrumpir y homogeneizar la muestra, agregue 600 microlitros de tampón de lisis que contiene beta mercaptoetanol al pellet y transfiera la suspensión a un tubo de perlas. Prepare un control positivo con tampón de lisis y 20 microlitros de la muestra bacteriana simulada.Agite vigorosamente todos los tubos de cuentas durante 15 segundos. A continuación, caliente las muestras en un vórtice de temperatura controlada a 37 grados centígrados y de 700 a 800 RPM durante 10 minutos. Cargue los tubos en el juego de adaptadores de disruptores de muestra automatizados.A continuación, batir las muestras a 30 hercios durante un minuto. Desmonte el juego de adaptadores y cámbielo manualmente con las placas de muestra del brazo robótico izquierdo al brazo robótico derecho del instrumento. Bead batió los tubos a 30 hercios durante otro minuto y luego centrifugó los tubos a 17, 200 veces G y 25 grados Celsius durante tres minutos.Con una pipeta de 200 microlitros, retire todo el sobrenadante, teniendo cuidado de no tomar nada de la capa grasa en la parte superior o los residuos de perlas en la parte inferior de la muestra. Aplique el sobrenadante a las columnas homogeneizadoras. A continuación, centrifugar las columnas a máxima velocidad y a 25 grados centígrados durante tres minutos.Transfiera 350 microlitros de eluid a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros del fabricante. Para aislar el ADN de acuerdo con el protocolo de texto, corte las tapas y alise los bordes de las columnas de espín individuales para el ADN y el ARN. Inserte la columna de centrifugado de ADN sin el tubo de recolección en el adaptador del rotor.A continuación, deseche el tubo de recolección. A continuación, inserte los tubos de dos mililitros en vórtice en un agitador, siguiendo la tabla de carga del instrumento de purificación automática de ADN/ARN según las instrucciones del fabricante. Etiquete un punto cinco tubos de recolección de mililitros e insértelos en los adaptadores del rotor.A continuación, coloque los adaptadores del rotor en la centrífuga siguiendo la tabla de carga del instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN. Después de insertar las puntas de filtro, el agua libre de RNasa y los reactivos en el bloque de reactivos del instrumento, cierre la tapa del instrumento y ejecute el programa de purificación de ADN personalizado en el instrumento. Cuando se complete la reacción, recoja la muestra que contiene tubos del agitador y, si queda alguna muestra, guárdela a menos 20 grados Celsius para almacenamiento a corto plazo o a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo.Después de preparar el área de trabajo y la mezcla maestra de PCR, de acuerdo con el protocolo de texto, cargue de 50 a 100 microlitros de muestras de ADN en un adaptador de muestra de instrumento de 32 pocillos, siguiendo el mapa de placa de 96 pocillos. Para cada placa de PCR, configure dos controles negativos pipeteando 30 microlitros de agua PCR en un tubo de recolección limpio de un punto cinco mililitros. A continuación, coloque todas las muestras en el adaptador de muestras de instrumento de 32 pocillos con las tapas bloqueadas en la posición abierta.En el adaptador de reactivo del instrumento, retire la tapa de cada cebador inverso con números de código de barras específicos de uno en uno. Para cargar el manipulador de líquidos robótico, coloque el adaptador de reactivo en posición B1.In evitar un efecto de borde, coloque con cuidado un borde del adaptador contra el lado de agarre y baje lentamente el otro borde. Asegúrese de empujar todas las esquinas de los adaptadores.Coloque el adaptador de muestra en la posición C1, asegurándose de empujar todas las esquinas de los adaptadores. A continuación, vórtice la mezcla maestra de cinco mililitros. Abra la tapa y colóquela en la posición A en la mezcla maestra y el bloque de reactivos del instrumento.Coloque la placa de PCR en el adaptador del instrumento de 96 pocillos que está diseñado para sostener placas de PCR con medio faldón. A continuación, inicie la ejecución y guárdela como un nuevo archivo. Una vez completada la ejecución, compruebe que no haya habido errores.Luego use 12 u ocho tapas de tiras para sellar la placa. Realice un vórtice vigoroso y use un girador de placas de 96 pocillos para girar las placas durante un minuto. Finalmente, coloque la placa en hielo hasta que se traslade a la sala de postamplificación y se cargue en el termociclador.Después de la amplificación por PCR, lleve a cabo el control de calidad y la preparación de la biblioteca de acuerdo con el protocolo de texto. El primer paso de control de calidad del protocolo sigue a la amplificación por PCR de la región 16SV4. Como se muestra aquí, se analizó un microlitro de producto de PCR de cada muestra por electroforesis para confirmar que estaba dentro del rango de tamaño esperado de 350 a 450 pares de bases.Algunas muestras de leche materna generaron cantidades más bajas de un producto específico, lo que sugiere bajos niveles de ADN microbiano extraído en esas muestras o arrastre de inhibidores de PCR durante la extracción. La cuantificación del producto específico para cada muestra fue esencial para determinar el volumen requerido para la agrupación molar igual de las muestras para la secuenciación. Una biblioteca agrupada para la secuenciación dirigida suele estar dominada por un producto de PCR específico.Si hay una cantidad significativa de producto no específico en la biblioteca, se debe agregar un paso de purificación de gel al flujo de trabajo. Los resultados de la secuenciación demuestran una alta diversidad en los taxones asociados con el microbioma de la leche humana y variabilidad en el número de recuentos de cañas de secuenciación para cada muestra. Por el contrario, la composición de los taxones y los recuentos de cañas para el simulacro bacteriano fueron comparables con los resultados obtenidos para el simulacro en ejecuciones de flujo de trabajo anteriores, lo que sugiere que la variabilidad observada para las muestras de leche humana es un resultado experimental auténtico y no una función de la variabilidad intrínseca del flujo de trabajo.Si se deja un secuenciador funcionando durante la noche, esta técnica se puede realizar en dos días, para 12 a 24 muestras, si todas las muestras se amplifican en la ejecución inicial de PCR. De lo contrario, se necesita otro día de concha. Al intentar este procedimiento, es importante viajar solo desde el área pre-PCR hasta el área post-PCR para evitar la contaminación.También es fundamental cambiar los guantes con frecuencia para evitar cualquier contaminación cruzada. No olvide que trabajar con muestras humanas puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el equipo de protección adecuado y los gabinetes de bioseguridad.

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