Name: Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a secuenciar el ARN ribosomal 16S de leche humana y muestras de baja biomasa mediante un protocolo semi-automatizado. Este método facilita el estudio del microbioma humano en salud y enfermedad.

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Nos gustaría agradecer a Helty Adisetiyo, PhD y Shangxin Yang, PhD para el desarrollo del protocolo. Apoyo total para el internacional materno pediátrico adolescentes SIDA clínico ensayos grupo (IMPAACT) fue proporcionada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud (NIH) números de premio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) y UM1AI106716 (IMPAACT LC), con cofinanciación de Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD) y el Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de los NIH.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Objetivo generación secuenciación de 16S rRNA es una técnica ampliamente utilizada, rápida para microbioma caracterización18. Sin embargo, muchos factores, incluyendo efectos de lote, contaminación ambiental, contaminación de la muestra, sensibilidad y reproducibilidad pueden adversamente afectar resultados experimentales y confundir su interpretación7,19 , 20. para mejor facilitar el análisis de 16S robu...

Las comunidades microbianas que colonizan seres humanos se creen que son críticamente importantes para la salud y la enfermedad que influyen en el metabolismo, desarrollo inmune, susceptibilidad a la enfermedad y las respuestas a la vacunación y medicamentos terapia1, 2. esfuerzos para comprender la influencia de la microbiota en la salud humana en la actualidad destacan la identificación de los microbios asociados con compartimentos anatómicos definidos (es decir, piel, intestinal, oral, etc.), así como de sitios localizados dentro de Estos compartimentos3,4. Estos esfuerzos de investigación que se basa es la rápida aparición y mayor accesibilidad de tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) que proporcionan una plataforma masiva y en paralelo para el análisis del contenido genético microbiano (microbioma) de una muestra. Para muchos las muestras fisiológicas, el microbioma asociado es complejo y abundante (es decir, heces), pero, para algunas muestras, el microbioma está representada por la baja biomasa microbiana (es decir, leche humana, tracto respiratorio inferior) donde sensibilidad, artefactos experimentales y posible contaminación se convierten en cuestiones importantes. Los desafíos comunes de microbioma estudios y el diseño experimental apropiado han sido objeto de varios artículos de revisión5,6,de7,8.
Presentados en este documento es una tubería experimental robusta de NGS en base específica secuenciación del rRNA 16S V4 región9 para caracterizar el microbioma de la leche humana. Análisis de microbioma de la leche humana son complicado no sólo por una de biomasa microbiana inherentemente baja10, pero además por altos niveles de ADN humano fondo11,12,13,14 y potencial remanente de PCR inhibidores15,16 en ácido nucleico extraído. Este protocolo se basa en kits de extracción disponibles en el mercado y plataformas semi-automatizadas que pueden ayudar a minimizar la variabilidad entre lotes de preparación de muestra. Incorpora una comunidad simulada bacteriana bien definida que es procesada junto a las muestras como un control de calidad para validar cada paso en el protocolo y proporcionar una métrica independiente de robustez de la tubería. Aunque el protocolo como se describe es específico para las muestras de leche humana, es fácilmente adaptable a otros tipos de muestras como heces, rectal, vaginal, piel, frotis oral y areolar10,17y puede servir como punto de partida para investigadores que deseen realizar análisis de microbioma.

<table><tbody><tr><td>AllPrep Mini kit de ARN/ADN</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>Kit de extracción de ADN/ARN</td></tr><tr><td>Eliminasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>Descontaminante de ARNasa, DNasa, ADN</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>tampón de vórtice con control de temperatura</td></tr><tr><td>RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>tampón de lisis de tiocianato de guanidinio/ Parte del kit</td></tr> <tr><td>Allprep&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig;-ME es un agente reductor que desnaturalizará irreversiblemente las RNasas al reducir los enlaces disulfuro</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>tubo de bolas</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td> juego <td>de adaptadores disruptores de muestra automatizados</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td></td><td></td> QIAgen RB <td>tubo de microcentrífuga del fabricante en kit</td></tr><tr><td>QIAcube y artículos de plástico relacionados</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>solución de descontaminación no enzimática</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>tampón de elución</td></tr><tr><td>QIAgility y artículos de plástico</td> <td>relacionadosQiagen</td><td>9001532</td><td>manipulador de líquidos robótico</td></tr><tr><td>PCR agua</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Imprimadores inversos con código de barras</td><td>Eurofin</td><td>No Catálogo # Diseñado</td><td>y ordenado</td></tr><tr><td>Placa PCR de 96 pocillos</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 y artículos</td> <td>de plástico relacionadosAgilent</td><td>G2964AA</td><td>analizador automatizado de fragmentos de ADN/ARN</td></tr><tr><td>Reactivos D1000 para Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>El tampón de muestra y la escalera forman parte de este kit</td></tr><tr><td>Kit de extracción de inhibidores de PCR OneStep Investigación</td><td>50444470 Zymo Research</td><td></td><td>La eliminación del inhibidor de PCR se realiza según las instrucciones del fabricante.</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td> Kit de limpieza de ADN <td>Qiagen</td><td>28104</td><td>: purificación de productos de PCR basada en membrana de sílice</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de dilución</td> y colorante <td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>a base de dimetilsulfóxido forman parte de este kit.</td></tr><tr><td>Qubit Fluorómetro</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Espectrofotómetro de microvolumen</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Kit MiSeq 300 V2</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>Sin catálogo # secuenciador de</td><td>próxima generación</td></tr></tbody></table>

un método de secuenciación de 16s específica de las muestras de leche humana

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Estudios de comunidades microbianas se han generalizado con el desarrollo de la secuencia relativamente barato, rápido y alto rendimiento. Sin embargo, al igual que con todas estas tecnologías, la reproducibilidad depende de un flujo de trabajo de laboratorio que incorpora controles y precauciones apropiadas. Esto es particularmente importante con las muestras de baja biomasa donde contaminantes ADN bacteriano pueden generar resultados engañosos. Este artículo detalla un flujo de trabajo semi automatizado para identificar microbios de las muestras de leche materna humana utilizando secuenciación específica de la región de V4 de ARN ribosómico (ARNr) 16S en una escala de bajo a medio throughput. El protocolo describe la preparación de las muestras de leche entera, incluyendo: lisis, extracción de ácidos nucleicos, la amplificación de la región V4 del gene del rRNA 16S y preparación de la biblioteca con las medidas de control de calidad de la muestra. Lo importante, el protocolo y la discusión consideran cuestiones que son salientes a la preparación y análisis de muestras de baja biomasa incluyendo controles positivos y negativos adecuados, eliminación de inhibidor de la polimerización en cadena, contaminación de las muestras ambiental, reactivo, o fuentes experimentales y experimentales mejores prácticas destinadas a garantizar la reproducibilidad. Mientras que el protocolo como se describe es específico para las muestras de leche humana, es adaptable a numerosos tipos de muestras de biomasa de baja y alta, incluyendo las muestras recogidas en torundas, congelados aseado o estabilizado en un buffer de conservación.

El protocolo que presentamos incluye pasos importante control de calidad (QC) para asegurar que la reunión de datos generados puntos de referencia para el control de sensibilidad, especificidad y la contaminación de protocolo. Primer paso de control de calidad del protocolo sigue la amplificación por PCR de la región 16S de V4 (figura 2). Un μl del producto de PCR de cada muestra se analizó por electroforesis para confirmar que estaba dentro del rango de tama...

Se presenta un flujo de trabajo semi-automático para específica secuenciación de 16S rRNA de la leche humana y otros tipos de biomasa, bajo muestra.

Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

El objetivo general de este método es amplificar 16 SRRNA de leche humana y otras muestras de baja biomasa utilizando un protocolo semiautomatizado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo y las perturbaciones del microbioma humano en relación tanto con la salud como con la enfermedad. La principal ventaja de la técnica es que es semiautomatizada, relativamente fácil de realizar y adaptable a múltiples tipos de muestras, incluidas secreciones, hisopos y heces.Después de descongelar y asignar leche entera de acuerdo con el protocolo de texto, centrifugar las muestras a 5000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para pellet las células. Utilice una espátula de plástico o una punta de pipeta de gran diámetro para eliminar la capa superior de grasa. Luego, sin alterar el pellet, retire todo el sobrenadante, excepto 100 microlitros.Con un mililitro de PBS, vuelva a suspender y lave el pellet. A continuación, prepare un control negativo añadiendo un mililitro de PBS estéril a un tubo de cinco mililitros. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga limpio de un punto cinco mililitros y gírelo a 5000 veces G a temperatura ambiente durante un

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Inmunología e Infección

La caracterización de la comunidad microbiana ha sido un objetivo de larga data en microbiología ambiental. Los métodos de secuenciación de próxima generación ahora permiten la caracterización de comunidades microbianas a una profundidad sin precedentes con un costo y mano de obra mínimos. Detallamos aquí nuestro enfoque para secuenciar genes de ARN ribosómico 16S bacterianos utilizando un secuenciador de sobremesa.

La secuenciación de próxima generación de 16S ARN ribosomal genes Amplicones

Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

La leche es una fuente primaria de nutrición para el recién nacido. El análisis de los componentes de la leche puede proporcionar información sobre los factores maternos que afectan la salud de la descendencia. Este protocolo describe un método manual de recolección de muestras de leche de la rata lactante, que luego se pueden utilizar para análisis posteriores.

Leche Colección de la rata utilizando tubos capilares y Estimación del contenido de grasa de la leche por Creamatocrit

Se describe un método eficiente y robusta, y rentable para la extracción de ácido nucleico a partir de hisopos para la caracterización de las comunidades bacterianas utilizando 16S rRNA secuenciación de genes de amplificación. El método permite un enfoque de procesamiento común para múltiples tipos de muestras y acomoda un número de procesos de análisis de aguas abajo.

Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

Este manuscrito describe un detallado protocolo estandarizado de secuenciación de amplicones de rRNA 16S de alto rendimiento. El protocolo presenta un protocolo integrado, uniformado, factible y de bajo costo a partir de la recolección de muestras fecales a través de análisis de datos. Este protocolo permite el análisis de un gran número de muestras con estándares rigurosos y varios controles.

Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

Describimos aquí el alto rendimiento detección y cuantificación de fucosylated oligosacáridos de leche humana (HMO) utilizando un biosensor de célula entera. También demostramos aquí, la adaptación de esta plataforma hacia análisis de cepas de producción de HMO, centrándose en mejorar la relación señal a ruido.

Análisis de los trisacáridos de leche Fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores

Aquí se describe un procedimiento operativo estándar simplificado para la elaboración de perfiles de microbiomas mediante la secuenciación y el análisis metagenómicos de 16S rRNA utilizando herramientas disponibles gratuitamente. Este protocolo ayudará a los investigadores que son nuevos en el campo del microbioma, así como aquellos que requieren actualizaciones sobre los métodos para lograr el perfilado bacteriano a una resolución más alta.

Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

Este artículo describe cómo ensamblar un dispositivo que se puede usar para recolectar leche de ratones de laboratorio. Este dispositivo es asequible, portátil y permite la recolección de 0,1 a 0,5 ml de leche por parte de una persona capacitada. También se incluye un protocolo de ordeño detallado.

Una técnica eficiente para una sola persona para el muestreo de leche de ratones de laboratorio

El artículo describe un protocolo para reconstituir la microbiota láctea pasteurizada de donante a partir de la propia microbiota láctea materna en entornos prácticos y reales. Demuestra un crecimiento bacteriano y una modulación del microbioma eficaces, lo que respalda la aplicación factible de este procedimiento dentro de la atención rutinaria de un hospital de maternidad y su banco de leche humana asociado.

Reconstitución individualizada de la microbiota de la leche materna: un enfoque factible en entornos reales

Este protocolo está diseñado para acelerar y permitir el aislamiento efectivo de vesículas extracelulares de la leche materna humana con alta pureza.

Aislamiento rápido de vesículas extracelulares derivadas de la leche materna humana

Este protocolo permite una evaluación rápida y rentable de la composición microbiana en los productos lácteos mediante la combinación de la culturomica con MALDI-TOF MS. Ofrece resultados de taxonomía comparables a la secuenciación de ARNr 16S con un tiempo de respuesta más corto que los métodos de cultivo tradicionales.

Evaluación de la seguridad microbiana de las lecherías mediante perfiles proteómicos bacterianos mediante el enfoque MALDI

Aprende a secuenciar el ARN ribosomal 16S de leche humana y muestras de baja biomasa mediante un protocolo semi-automatizado. Este método facilita el estudio del microbioma humano en salud y enfermedad.

Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana

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