Name: Medida simultánea de superóxido de Hidrógeno peróxido y la producción de NADH deshidrogenasas mitocondriales Flavin-que contiene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a medir simultáneamente superóxido/peróxido de hidrógeno y producción de NADH en deshidrogenasas mitocondriales con flavinas mediante fluorometría en microplacas. Este método permite cuantificar con precisión la capacidad de producción de especies reactivas de oxígeno en sitios individuales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC). Producción de video se llevó a cabo en colaboración con el centro para la innovación en la enseñanza y aprendizaje (CITL) en Universidad conmemorativa de Terranova.

1. productos químicos y enzimas purificadas
<ol><li>Adquirir los siguientes materiales: PDHC y KGDHC de corazón porcino origen (o de otro flavoenzyme mitocondrial purificado); H2O2 (solución al 30%), piruvato, α-cetoglutarato,+de NAD, NADH, CoASH, pirofosfato de tiamina (TPP), sacarosa manitol, HEPES, EGTA, 3-metil-2-oxo-ácido valeriánico (KMV), superóxido dismutasa (SOD), peroxidasa de rábano (HRP), 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine reactivo (AUR) y el CPI-613.</li>
</ol>2. planificación de los análisis y preparación de los reactivos
<ol><li>Configurar el ensayo según la tabla 1 en una placa de 96 pocillos. Nota: El volumen total para cada reacción es 200 μl. concentraciones de población se ajustan tales que se añade 20 μl del reactivo a cada pocillo. Esto asegura la rápida adición de cofactores y substratos a cada reacción bien antes de comenzar el ensayo.</li>
	<li>Preparar el tampón de reacción que contiene manitol de 220 mM de sacarosa de 70 mM, 1 mM EGTA y 20 mM HEPES (pH 7.4 con HCl). Nota: Esto puede cambiar dependiendo de las propiedades físicas de las diferentes enzimas purificadas.</li>
	<li>Examinar la KGDHC o la PDHC purificada de contaminación utilizando enzima actividad ensayos14,16,17 o por el immunoblot o tinción de Coomassie5.</li>
	<li>Preparar todos los reactivos en el tampón de reacción según las concentraciones de la solución de trabajo en la tabla 1.</li>
	<li>Conservar todos los reactivos como alícuotas de 1 mL a-20 ° C. Tienda piruvato y α-cetoglutarato a-80 ° C en alícuotas de 100 μL para evitar la degradación espontánea debido a la auto oxidación y congelación y descongelación repetida.</li>
	<li>Prepare el reactivo AUR stock principal en 1 mL de DMSO y luego diluya a 100 μm en buffer de reacción. Almacenar protegido de la luz. Nota: Aquí, la solución de trabajo de 100 μm es hecho frescas cada 2 a 3 semanas y protegidos de la luz.</li>
</ol>3. configuración de la plantilla de análisis
<ol><li>Establecer el procedimiento del ensayo con un lector de microplacas monocromática con capacidades de medición dual.</li>
	<li>Definir el procedimiento de lectura seleccionando "Protocolo". Haga clic en "Procedimiento".</li>
	<li>Establezca la "Temperatura" a 25 ° C (figura 1A).</li>
	<li>Haga clic en "Iniciar cinético" para establecer las condiciones de lectura (figura 1A). Ajustar la hora y el número de experimentos de intervalos de lectura.</li>
	<li>Haga clic en "leer" (figura 1B). Nota: Las muestras se leen desde la posición superior con una ganancia de 50. Tiempo: 5 minutos, leer en intervalos de 30 s. Canal 1: Fluorescencia Resorufin - excitación/emisión = 565 nm:600 nm, ancho de longitud de onda de 13,5 nm. Canal 2: NADH autofluorescence - excitación/emisión = 376 nm:450 nm, ancho de longitud de onda de 20 nm.</li>
	<li>En "Leer", seleccione pozos para monitor (por ejemplo, A1-A4 y B1-B4).</li>
	<li>Seleccione "Fin cinético".</li>
</ol>4. estándar de curvas
<ol><li>Descongelar los reactivos y almacenar en hielo hasta que se necesite.</li>
	<li>
Curva estándar de NADH (figura 2A)
	<ol>
<li>Preparar las soluciones de trabajo de NADH en el intervalo de concentraciones de 0.5 a 10 mM de tampón de reacción.</li>
		<li>Añadir 20 alícuotas μl de cada NADH trabajando la concentración de la solución a los pozos que contienen 180 μl de tampón de reacción. La concentración final de NADH en cada bien es de 0.05-1 mM.</li>
		<li>Haga clic en "Leer" y sistema de excitación/emisión = 376 nm:450 nm, ancho de longitud de onda de 20 nm. Nota: Este es un extremo de sólo lectura, parámetros cinéticos no son obligatorios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Curva estándar de AUR (figura 2B)
	<ol>
<li>Preparar las acciones de trabajo del peróxido de hidrógeno en solución tampón de reacción; valores de las concentraciones entre 200-4.000 nM.</li>
		<li>Añadir 120 μl de tampón de la reacción a cada pocillo.</li>
		<li>Añadir 20 μl de HRP (concentración stock de trabajo = 30 U/mL, concentración final en el pozo = 3 U/mL), 20 μl de SOD (concentración stock de trabajo = 250 U/mL, concentración final en el pozo = 25 U/mL) y 20 μl de AUR (concentración stock de trabajo = 100 μm concentración final en el pozo = 10 μm) para cada bien que contiene tampón de reacción.</li>
		<li>Añadir 20 μl de cada H2O2 solución stock a cada bien que contenga reactivos tampón y ensayo. El volumen de reacción final es 200 μl y la concentración final de H2O2 en cada pozo es de 20-400 nM.</li>
		<li>Incubar las placas durante 1 min en el lector de placas a 25 ° C.</li>
		<li>Haga clic en "Leer" y sistema de excitación/emisión = 565 nm/600 nm, ancho de longitud de onda de 13,5 nm. Tenga en cuenta que se trata de un extremo de sólo lectura, parámetros cinéticos no son obligatorios.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. medición O2 ●/h2 O2 liberación y producción de NADH por KGDHC y PDHC
<ol><li>Vea la tabla 1 para la orden de adición de los diferentes reactivos, la concentración de cada solución de trabajo y el volumen añadido a cada pozo.</li>
	<li>Agregar 40 μl de tampón de reacción a cada pocillo. Para los ensayos de uso de KMV o CPI-613, añadir 20 μl de buffer a cada pocillo.</li>
	<li>Añadir 20 μl de la PDHC o KGDHC (bolsa de trabajo de 1 U/mL, concentración final por pozo = 0,1 U/mL) a cada pocillo.</li>
	<li>Incubar PDHC y KGDHC a 25 ° C por 2 min.</li>
	<li>Añadir 20 μl de KMV (bolsa de trabajo = 100 mM, concentración final = 10 mM) o 20 μl de CPI-613 (concentración stock de trabajo = 1,5 mM, concentración final = 150 μm) (tabla 2). Nota: Este paso puede ser excluido si no se utilizan inhibidores para los ensayos.</li>
	<li>Incubar durante 1 min a 25 ° C. Nota: Este paso puede ser excluido si no se utilizan inhibidores para los ensayos.</li>
	<li>Añadir 20 μl de HRP (concentración stock de trabajo = 30 unidades/mL, concentración final en el pozo = 3 unidades/mL) y 20 μl de SOD (concentración stock de trabajo = 250 unidades/mL, concentración final en el pozo = 25 unidades/mL) a cada pocillo.</li>
	<li>Añadir 20 μl de la coenzima A (concentración stock de trabajo = concentración final de 1 mM = 0,1 mM), 20 μl de TPP (concentración stock de trabajo = 3 mM, concentración final = 0,3 mM) y 20 μl de NAD+ (concentración stock de trabajo = 10 mM, concentración final = 1 mM) a cada w ELL.</li>
	<li>Eliminar el reactivo AUR de la cubierta protectora de papel de estaño y añadir 20 μl a cada pocillo.</li>
	<li>Añadir 20 μl de piruvato (trabajo concentración stock de 1 100 mM, concentración final de ensayos = 0.1-10 mM) en los pocillos que contengan PDHC y α-cetoglutarato (trabajo concentración stock de 1 100 mM, concentración final de ensayos = 0.1-10 mM) a pozos que contienen KGDHC.</li>
	<li>Haga clic en "Leer" para iniciar la medición cinética.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Mantenga pulsada la tecla 'CTRL' en el teclado y haga clic en la opción de pozos para generar un gráfico que contiene todas las medidas cinéticas correspondientes para canal 1 (Figura 3A).</li>
	<li>Haga clic en "datos" en el icono Vista en la esquina superior derecha para valores crudos para las unidades de fluorescencia relativa (RFU) medidas en los puntos de tiempo diferentes (figura 3B).</li>
	<li>Exportar los valores para el análisis (tabla 3).</li>
	<li>Haga clic en el menú en la parte superior derecha (figura 3B) desplegable "Gráfico" para obtener acceso a valores RFU asociados al canal 2 de la fluorescencia.</li>
	<li>Repita los pasos 6.1 a 6.3 para el canal 2.</li>
</ol>

<ol><li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+years+of+Mitchell%27s+proton+circuit%3A+From+little+grey+books+to+little+grey+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li>
<li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li>
<li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress.</a> Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).</li>
<li>Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28675747">Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling.</a> Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+cellular+energy+transduction+and+its+implications+for+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity.</a> Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).</li>
<li>Ambrus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+reactive+oxygen+species+by+human+and+bacterial+pyruvate+and+2-oxoglutarate+dehydrogenase+multienzyme+complexes+reconstituted+from+recombinant+components%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components.</a> Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).</li>
<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li>
<li>Slade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+forming+and+quenching+potential+of+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).</li>
<li>O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glutathionylation+alters+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+emission+from+pyruvate+dehydrogenase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex.</a> Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).</li>
<li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li>
<li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+%28E3%29+deficiency%3A+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li>
<li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li>
<li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29+from+bovine+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li>
<li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart%3A+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li>
<li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase%2C+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li>
</ol>

No hay nada que revelar.

Este protocolo es ventajosa desde, 1) que elimina cualquier competencia reacciones que de lo contrario pueden interferir con la detección de H2O2 (p. ej., sistemas antioxidantes u otras fuentes de ROS), 2) ofrece una evaluación directa de la tasa natural de ROS liberar por una deshidrogenasa mitocondrial de flavin-que contiene, 3) permite la comparación del nativo ROS liberar las tasas de dos o más purificaron basada en flavin Deshidrogenasas, 4) puede permitir una comparación directa de la...

El objetivo final del metabolismo de nutrientes es hacer trifosfato de adenosina (ATP). En células de mamíferos, esto ocurre en las mitocondrias, orgánulos de doble membrana que convierten la energía almacenada en el carbón en ATP. La producción de ATP comienza cuando el carbón es quemado por las mitocondrias formando dos portadores de electrones, NADH y flavin-adenin-dinucleótido (FADH2)1. NADH y FADH2 es entonces oxidado por complejos respiratorios de multi-subunidades I y II, respectivamente, y los electrones liberados se transportaron para el oxígeno molecular (O2) de terminal del electrón aceptor en el complejo IV1. La termodinámicamente favorable "cuesta abajo" transferencia de electrones al O2 en el final de la cadena se acopla a la exportación de protones en la intermembrana del espacio por los complejos I, III y IV. Esto crea un gradiente electroquímico transmembrana de protones (fuerza protón-motriz), una forma temporal de la energía libre de Gibbs que es aprovechada por el complejo V para hacer ATP2. Reacciones de transferencia de electrones en las mitocondrias no están perfectamente acopladas a la producción de ATP. En varios puntos en el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria, los electrones prematuramente pueden interactuar con O2 para formar ROS3. El ROS biológicamente más relevante generado por las mitocondrias son O2● - y H2O2. Aunque O2●- a menudo se considera el ROS proximal formado por mitocondrias, ahora es evidente que los sitios de producción forman una mezcla de O2● - y H2O2, que se asocia con el libre los grupos de química radical de flavin prótesis4,5. En niveles elevados, ROS puede ser peligroso, dañar a los componentes biológicos necesarios para la función de la célula dando como resultado sufrimiento oxidativo6. Sin embargo, en bajas cantidades, ROS mitocondriales cumplir funciones vitales de señalización. Por ejemplo, liberación H2O2 las mitocondrias se ha implicado en el control de la activación del T-cell, señalización de estrés (p. ej., inducción de vías de señalización Nrf2), la inducción de proliferación celular y diferenciación, señalización de la insulina y liberación, alimentación y comportamiento7. Considerables progresos en la comprensión de la función de señalización de ROS. Sin embargo, importantes preguntas permanecen con respecto a que las enzimas de las mitocondrias sirven como las fuentes más importantes y cómo se controla la producción.
Liberación ROS por un sitio de producción depende de varios factores: 1) la concentración de la donación de electrones del sitio, 2) el estado redox del sitio donando electrones, 3) acceso a oxígeno y 4) la concentración y tipo de sustrato de oxidación3, 8 , 9. en las mitocondrias, otros factores como la concentración de NADH y la membrana fuerza potencial también influyen ROS producción8,10. Por ejemplo, la tasa de O2●/h2O2 producción purificada PDHC o KGDHC aumenta con la creciente disponibilidad de NADH5,11. En este escenario, los electrones están fluyendo hacia atrás de NADH para el centro de la moda en la subunidad de3 E de la PDHC o KGDHC, el sitio de O2●-/ h2O2 producción12. Asimismo, la disposición de NAD+ tiene el efecto contrario, disminuyendo la liberación ROS de KGDHC12. Así, control entrada o salida de electrones de sitios de producción de ROS puede alterar la cantidad O2●-/ h2O2 está formado. Por ejemplo, el bloqueo de la subunidad de2 E de la PDHC o KGDHC con CPI-613, un ácido lipoico analógico, resultados en un casi 90% disminución O2●-/ h2O2 producción13. Resultados similares pueden obtenerse con la química S glutathionylation catalizadores, diamida y disulfiram, que casi abolir O2●/h2O2 producción PDHC o KGDHC a través de la conjugación del glutatión para el E 2 subunidad14. La compensación por bloqueo del flujo de electrones a través de la subunidad de2 E de la PDHC y KGDHC es una disminución en la producción de NADH que disminuye la formación de ROS por la cadena de transporte del electrón (e.g., complejo III). Esto también puede disminuir la producción de ATP por la cadena de transporte de electrones. En general, bloqueo de entrada de electrones a los sitios de producción de ROS puede ser un medio muy eficaz de controlar O2●/h2O2 producción.
Las mitocondrias pueden contener hasta 12 posibles O2●-/ h2O2 fuentes6. La mayoría de estos sitios son el flavin-que contiene las enzimas que generan una mezcla de O2● - y H2O2. Uso de combinaciones de inhibidor y sustrato diferentes han permitido la identificación de que complejos respiratorios y deshidrogenasas mitocondriales sirven dealta capacidad O2●-/ h2O2 formando sitios en diferentes tejidos3. PDHC y KGDHC han demostrado servir de alta capacidad O2●-/ h2O2 sitios emisores en músculo y hígado mitocondria13,15. Sin embargo, quedan algunas dificultades en relación con el examen de la O2●-/ h2O2 formando potenciales de sitios individuales en las mitocondrias y el impacto que tienen sustrato diferentes y combinaciones del inhibidor en las actividades de las enzimas. Esto es debido a la presencia de reacciones laterales no deseadas (por ejemplo, la formación de O2●-/ h2O2 por sitios con excepción de la enzima de interés), contaminante nutrientes endógenos (p. ej.,grasos ácidos) u organelos (e.g., peroxisomas que también forman O2●-/ h2O2) y uso de inhibidores que carecen de selectividad, o uso de compuestos que no inhibir totalmente la producción de ROS. Ciertos inhibidores también pueden alterar la bioenergética mitocondrial y la dirección del flujo de electrones, y esto altera la liberación ROS de otros sitios de la producción y confunde los resultados. Tasas absolutas para O2●/h2O2 liberación de sitios individuales en las mitocondrias también son difíciles de cuantificar debido a la alta concentración de O2● - y H2O2 la eliminación de enzimas en el espacio intermembrana matriz. Por lo tanto, eliminación de reacciones concurrentes que pueden interferir con O2●/h2O2 liberación mediciones puede ser útil identificar alta capacidad O2● -/H2O2 formación de sitios.
Aquí, presentamos un método simple que permite el examen simultáneo de O2●/h2O2 producción y formación de NADH deshidrogenasas dependientes de flavina purificadas. Mediante el uso de enzimas purificadas, no deseados ROS formando reacciones secundarias y ROS degradando enzimas pueden eliminarse permitiendo una medida más precisa de nativos O2●-/ h2O2 tasas de producción para flavoenzymes individual. Este método puede utilizarse para comparar directamente el O2●-/ h2O2 formando la capacidad de diferentes Deshidrogenasas purificadas o inhibidores específicos del sitio potencial de pantalla O2●-/ h2O liberación de 2 . Por último, medición O2●-/ h2O2 y producción de NADH al mismo tiempo permite una evaluación en tiempo real de la relación entre la actividad enzimática y la capacidad de liberación ROS.

<table><tbody><tr><td>Complejo de piruvato deshidrogenasa</td><td>SIGMA</td><td>P7032-10UN</td><td>flavoenzima purificada</td></tr> complejo <tr><td>alfa-cetoglutarato deshidrogenasa</td><td>SIGMA</td><td>K1502-20UN</td><td>flavoenzima purificada</td></tr><tr><td>solución de peróxido de hidrógeno al 30%</td> Reactivo <td>SIGMA</td><td>HX0640-5</td><td>, curvas estándar</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>SIGMA</td><td>Reactivo N0632-1G</td><td>, ensayo</td></tr> <tr><td>de actividad/liberación de ROSNADH</td><td>SIGMA</td><td>N4505-100MG</td><td>reactivo, curvas estándar</td></tr><tr><td>piruvato</td><td>SIGMA</td><td>P2256-5G</td><td>reactivo, actividad/ensayo de liberación de</td></tr><tr><td>ROS alfa-cetoglutarato</td><td>SIGMA</td><td>75892-25G</td><td>reactivo, actividad/ensayo de liberación de ROS</td></tr><tr><td>CoASH</td><td>SIGMA</td><td>C3019-25MG</td><td>reactivo, actividad/ensayo de liberación de ROS pirofosfato</td></tr><tr>de<td>tiamina</td><td>SIGMA</td><td>C8754-1G</td><td>reactivo, ensayo, de actividad/liberación de ROS</td></tr><tr><td>manitol</td><td>SIGMA</td><td>M4125-100G</td><td>componente tampón</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SIGMA</td><td>H3375-25G</td><td>componente tampón</td></tr><tr><td></td><td>sacarosa SIGMA</td><td>S7903-250G</td><td>componente tampón</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889-10G</td><td>componente tampón</td></tr><tr><td>KMV</td><td>SIGMA</td><td>198978-5G</td><td>reactivo, inhibidor de liberación de ROS</td></tr><tr><td>CPI-613</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-482709</td><td>reactivo, inhibidor de liberación de ROS</td></tr><tr><td>SOD</td><td>SIGMA</td><td>S9697-15KU</td><td>reactivo, detección de liberación de ROS</td></tr><tr><td>peroxidasa de rábano picante</td><td>reactivo SIGMA</td><td>P8375-1KU</td><td>, detección de liberación de ROS</td></tr><tr><td>Amplex Ultra Red</td><td>Reactivo Thermofisher</td><td>A36006</td><td>, detección de liberación de ROS</td></tr><tr><td>Lector de microplacas Biotech Synergy 2 BioTek</td><td>Instruments</td><td></td><td>lector de microplacas para ensayos</td></tr><tr><td>software Gen5</td> software <td>BioTek Instruments</td><td></td><td>, utilizado para la recopilación de RFU en bruto</td></tr><tr><td>Graphpad Prisma</td><td>software</td><td></td> Graphpad<td>, análisis de datos</td></tr><tr><td>Microsoft EXCEL</td> Software <td>Microsoft</td><td></td><td>, análisis de datos</td></tr></tbody></table>

medida simultánea de superóxido de hidrógeno peróxido y la producción de nadh deshidrogenasas mitocondriales flavin-que contiene

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Se ha reportado que las mitocondrias pueden contener hasta 12 fuentes enzimáticas de especies reactivas del oxígeno (ROS). La mayoría de estos sitios incluyen complejos respiratorios dependiente de flavin y Deshidrogenasas que producen una mezcla de superóxido (O2● -) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Cuantificación precisa del potencial de producción de ROS de sitios individuales en mitocondrias aisladas puede ser difícil debido a la presencia de reacciones laterales que también forman O2●-/ h2O2y sistemas de defensa antioxidantes. Uso de inhibidores no específicos que pueden perturbar la bioenergética mitocondrial también puede comprometer medidas alterando la liberación ROS de otros sitios de producción. Aquí, presentamos un método sencillo para la medida simultánea de H2O2 liberación y producción de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) por Deshidrogenasas purificadas flavin-ligado. Para nuestros propósitos aquí, hemos utilizado el complejo de purificado de la piruvato deshidrogenasa (PDHC) y α-cetoglutarato deshidrogenasa complejo (KGDHC) de origen porcino corazón como ejemplos. Este método permite una medida exacta nativas H2O2 liberación de las tasas de sitios individuales de la producción mediante la eliminación de otras posibles fuentes de ROS y antioxidante. Además, este método permite una comparación directa de la relación entre la liberación de H2O2 y la actividad enzimática y la proyección de la eficacia y selectividad de los inhibidores para la producción de ROS. En general, este enfoque puede permitir la evaluación en profundidad de nativas tasas de liberación ROS para enzimas individuales antes de la realización de experimentos más sofisticados con mitocondrias aisladas o fibra muscular permeabilized.

Figura 3A proporciona un rastro representativo para la RFU recopilado durante la medición simultánea de la producción de NADH y H2O2 por KGDHC purificada. Los datos brutos de la RFU para cada intervalo de tiempo se representan en la figura 3B. Entonces se exportan los datos brutos de la RFU para el análisis. Por extrapolación de curvas estándar presentadas en la figura 2, se pue...

Las mitocondrias contienen varias enzimas flavin dependientes que pueden producir especies reactivas del oxígeno (ROS). Monitoreo ROS liberación de sitios individuales en la mitocondria es difícil debido a reacciones secundarias no deseadas. Presentamos un método fácil y económico para la evaluación directa de tasas nativas para la liberación ROS con flavoenzymes purificada y microplacas fluorometría.

Medida simultánea de superóxido de Hidrógeno peróxido y la producción de NADH deshidrogenasas mitocondriales Flavin-que contiene

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la tasa de producción de superóxido/peróxido de hidrógeno y NADH de las deshidrogenasas mitocondriales purificadas que contienen flavina mediante fluorometría en microplaca. Las mitocondrias pueden contener hasta 12 sitios diferentes de formación de superóxido/peróxido de hidrógeno que se han identificado utilizando diferentes combinaciones de sustratos e inhibidores con mitocondrias aisladas. Sin embargo, aún persisten algunas dificultades en lo que respecta a la cuantificación precisa de la capacidad de liberación de los sitios individuales de producción en mitocondrias aisladas.Y esto se asocia a reacciones secundarias no deseadas que también producen especies reactivas de oxígeno, pero también a la presencia de antioxidantes y al uso de inhibidores que carecen de especificidad, además del uso de aditivos que pueden interferir en las mediciones. Aquí presentamos el método para la medición simultánea de la producción de superóxido/peróxido de hidrógeno y NADH mediante deshidrogenasas mitocondriales purificadas dependientes de flavina. Este método es ventajoso, ya que puede permitir la cuantificación directa y precisa del potencial de producción de ROS de sitios individuales de producción al eliminar las reacciones secundarias no deseadas y cualquier sistema de enfriamiento de especies reactivas de oxígeno.La medición simultánea de la producción de ROS y NADH también permite la comparación directa del potencial de formación de superóxido/peróxido de hidrógeno y la actividad de las enzimas individuales, lo que puede ser valioso para la detección de inhibidores para la producción de ROS antes de realizar ensayos con mitocondrias. Para nuestros propósitos aquí, usaremos como ejemplos el complejo piruvato deshidrogenasa y el complejo alfa-cetoglutarato deshidrogenasa de origen porcino. Ambas son enzimas que contienen flavina y fuentes conocidas de especies reactivas de oxígeno.Además, estas dos enzimas se pueden purificar fácilmente. La medición simultánea de superóxido/peróxido de hidrógeno y NADH se logra mediante el seguimiento de los cambios en la florescencia. El NADH tiene sus propias propiedades intrínsecas de florescencia que permiten una fácil medición de su producción.Mientras tanto, los cambios en el superóxido/peróxido de hidrógeno requieren superóxido dismutatasa, peroxidasa de rábano picante y reactivo ultrarojo amplex. En presencia de peroxidasa de rábano picante y peróxido de hidrógeno, el amplex ultrared se convierte de una molécula no fluorescente en resorufina fluorescente. La superóxido dismutasa asegura que cualquier superóxido formado por la deshidrogenasa que se está estudiando se convierta en peróxido de hidrógeno.Antes de configurar el ensayo, se preparan las soluciones de trabajo. Para agilizar el ensayo, todos los reactivos se añaden a los pocillos de una placa negra de 96 pocillos en alícuotas de 20 microlitros. El volumen de cada reacción en el pozo es de 200 microlitros, por lo tanto, las soluciones de trabajo son 10 veces la concentración que se encuentra en el pozo de reacción.A continuación, programe el lector de microplacas para ejecutar un ensayo cinético para la medición dual de la autoflorescencia del NADH y la fluorescencia del resorufina. Esto se hace seleccionando primero Procedimiento y configurándolo a 25 grados Celsius. A continuación, haga clic en Iniciar cinético.Configure el tiempo de ejecución durante aproximadamente cinco minutos, seguido de la selección de un intervalo de lectura fluorescente de 30 segundos. A continuación, haga clic en Leer y configure los parámetros de medición fluorescente para su ensayo. Aquí se introducen en el software la posición de la sonda, las longitudes de onda utilizadas para el seguimiento de los cambios en la florescencia y los pozos que se leerán.También se seleccionan los diferentes canales para las lecturas fluorescentes, uno dedicado a la autofluorescencia del NADH, que se establece en 376 nanómetros de excitación y 450 nanómetros de longitud de onda de emisión. Los cambios en la florescencia de la resorufina se rastrean a 565 nanómetros y 600 nanómetros. Una vez que se han establecido las condiciones de ensayo, los pozos individuales se cargan con tampón y diferentes reactivos necesarios para medir la producción de NADH y superóxido/peróxido de hidrógeno al mismo tiempo.El orden para cargar los pozos con diferentes reactivos es el siguiente. En primer lugar, se añade al pocillo la cantidad necesaria de tampón, seguida de 20 microlitros de solución enzimática purificada. La enzima se equilibra en el tampón durante unos minutos dentro del instrumento.Y luego, los reactivos restantes se agregan en el siguiente orden. Una vez añadido el sustrato, pulsar Inicio. El portador de la placa entrará en el lector y se iniciará el protocolo.Durante el ensayo, las salidas en tiempo real de las unidades fluorescentes relativas en bruto, o RFU, se pueden rastrear mediante el software. El usuario puede alternar entre las diferentes lecturas fluorescentes utilizando la pestaña Datos sobre el diseño del pozo. Tenga en cuenta que se pueden seleccionar curvas para las diferentes lecturas fluorescentes.Además, al mantener presionada la tecla Control en el teclado y hacer clic con el botón izquierdo en los pozos, se puede obtener un gráfico compuesto que permite comparaciones en tiempo real de las diferentes reacciones. Una vez finalizado el experimento, el portador de la microplaca saldrá del instrumento. En este punto, los resultados en el gráfico representativo de los cambios en RFU se exportan a Excel.Los valores brutos de RFU se exportan haciendo clic primero en Datos en el gráfico representativo de RFU. Esto producirá una tabla de valores brutos de RFU para NADH y florescencia de resorufina. No es que los números brutos de RFU correspondientes a cambios en la floración de NADH o resorufin no se puedan exportar simultáneamente.Una vez exportados, los resultados se organizan para su análisis. Utilizando curvas estándar para la fluorescencia de NADH y resorufina generadas antes de realizar el ensayo, se puede calcular la cantidad de NADH en el micromol y de superóxido/peróxido de hidrógeno en el picomol formado a lo largo del tiempo. A esto le puede seguir calculando la tasa de producción de NADH y superóxido/peróxido de hidrógeno.Para este procedimiento, es vital comprobar la pureza de la flavina deshidrogenasa aislada antes de realizar los ensayos. Esto se puede lograr mediante la realización de una simple tinción de Coomassie para proteínas o mediante el ensayo de la actividad de la enzima en presencia de diferentes sustratos. Tenga en cuenta que se recomienda omitir del ensayo los agentes reductores como el DTT, ya que pueden servir como sustrato para la producción de superóxido/peróxido de hidrógeno mediante deshidrogenasas unidas a flavina.En general, este método es muy flexible en el sentido de que puede utilizarse para detectar inhibidores de la producción de superóxido/peróxido de hidrógeno y también permite una comparación directa de la capacidad de formación de ROS de diferentes deshidrogenasas mitocondriales ligadas a flavina. Después de ver este video, debería tener una comprensión íntima de cómo medir la producción de ROS y NADH mediante deshidrogenasas purificadas. Este ensayo puede servir como trampolín para experimentos más sofisticados con mitocondrias aisladas.

simultaneous-measurement-superoxidehydrogen-peroxide-nadh-production

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se describe la utilización de un instrumento de flujo detenido para investigar tanto los reductores y oxidativa semirreacciones...

El seguimiento de los reductores y oxidativo semirreacciones de una flavina monooxigenasa dependiente del uso de espectrofotometría de flujo detenido

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Fuente:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste video explica cómo se utiliza el flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células de mamíferos vivas y permeabilizadas. Demuestra el uso secuencial de digitonina, sustratos metabólicos, ADP, un desacoplador y un inhibidor para caracterizar diferentes estados respiratorios. El perfil de flujo de oxígeno resultante revela la función mitocondrial y la eficiencia de acoplamiento...

Mediciones de flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células vivas y permeabilizadas

La microscopía confocal de barrido se aplica para obtener imágenes de los eventos mitocondriales individuales en el corazón perfundido o los músculos esqueléticos en animales vivos. Monitoreo en tiempo real de los procesos mitocondriales individuales, como accesos repentinos superóxido y potencial de membrana fluctuaciones permite la evaluación de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante y durante perturbaciones patológicas.

Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o En Vivo

Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 +), lo que les permite dar forma Ca 2+ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.

Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Esta técnica describe un flujo de trabajo efectivo para visualizar y medir cuantitativamente el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido dentro de las células HeLa utilizando imágenes en vivo basadas en fluorescencia.

Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa

Este estudio presenta una metodología para estudiar los efectos de los xenobióticos sobre la función mitocondrial a través de ensayos respirométricos y enzimáticos. Examina la modulación de la cadena de transporte de electrones en varias especies, ofreciendo información para el desarrollo de bioplaguicidas dirigidos contra enfermedades transmitidas por insectos vectores.

Revelando el transporte y los efectos de los xenobióticos en las mitocondrias aisladas: perspectivas de los ensayos respirométricos y enzimáticos

Aprende a medir simultáneamente superóxido/peróxido de hidrógeno y producción de NADH en deshidrogenasas mitocondriales con flavinas mediante fluorometría en microplacas. Este método permite cuantificar con precisión la capacidad de producción de especies reactivas de oxígeno en sitios individuales.

Medida simultánea de superóxido de Hidrógeno peróxido y la producción de NADH deshidrogenasas mitocondriales Flavin-que contiene (Video) | JoVE Journal

Medida simultánea de superóxido de Hidrógeno peróxido y la producción de NADH deshidrogenasas mitocondriales Flavin-que contiene

Explorar más videos