Medida simultánea de superóxido de Hidrógeno peróxido y la producción de NADH deshidrogenasas mitocondriales Flavin-que contiene
24 de febrero de 2018
Las mitocondrias contienen varias enzimas flavin dependientes que pueden producir especies reactivas del oxígeno (ROS). Monitoreo ROS liberación de sitios individuales en la mitocondria es difícil debido a reacciones secundarias no deseadas. Presentamos un método fácil y económico para la evaluación directa de tasas nativas para la liberación ROS con flavoenzymes purificada y microplacas fluorometría.
El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la tasa de producción de superóxido/peróxido de hidrógeno y NADH de las deshidrogenasas mitocondriales purificadas que contienen flavina mediante fluorometría en microplaca. Las mitocondrias pueden contener hasta 12 sitios diferentes de formación de superóxido/peróxido de hidrógeno que se han identificado utilizando diferentes combinaciones de sustratos e inhibidores con mitocondrias aisladas. Sin embargo, aún persisten algunas dificultades en lo que respecta a la cuantificación precisa de la capacidad de liberación de los sitios individuales de producción en mitocondrias aisladas.
Y esto se asocia a reacciones secundarias no deseadas que también producen especies reactivas de oxígeno, pero también a la presencia de antioxidantes y al uso de inhibidores que carecen de especificidad, además del uso de aditivos que pueden interferir en las mediciones. Aquí presentamos el método para la medición simultánea de la producción de superóxido/peróxido de hidrógeno y NADH mediante deshidrogenasas mitocondriales purificadas dependientes de flavina. Este método es ventajoso, ya que puede permitir la cuantificación directa y precisa del potencial de producción de ROS de sitios individuales de producción al eliminar las reacciones secundarias no deseadas y cualquier sistema de enfriamiento de especies reactivas de oxígeno.
La medición simultánea de la producción de ROS y NADH también permite la comparación directa del potencial de formación de superóxido/peróxido de hidrógeno y la actividad de las enzimas individuales, lo que puede ser valioso para la detección de inhibidores para la producción de ROS antes de realizar ensayos con mitocondrias. Para nuestros propósitos aquí, usaremos como ejemplos el complejo piruvato deshidrogenasa y el complejo alfa-cetoglutarato deshidrogenasa de origen porcino. Ambas son enzimas que contienen flavina y fuentes conocidas de especies reactivas de oxígeno.
Además, estas dos enzimas se pueden purificar fácilmente. La medición simultánea de superóxido/peróxido de hidrógeno y NADH se logra mediante el seguimiento de los cambios en la florescencia. El NADH tiene sus propias propiedades intrínsecas de florescencia que permiten una fácil medición de su producción.
Mientras tanto, los cambios en el superóxido/peróxido de hidrógeno requieren superóxido dismutatasa, peroxidasa de rábano picante y reactivo ultrarojo amplex. En presencia de peroxidasa de rábano picante y peróxido de hidrógeno, el amplex ultrared se convierte de una molécula no fluorescente en resorufina fluorescente. La superóxido dismutasa asegura que cualquier superóxido formado por la deshidrogenasa que se está estudiando se convierta en peróxido de hidrógeno.
Antes de configurar el ensayo, se preparan las soluciones de trabajo. Para agilizar el ensayo, todos los reactivos se añaden a los pocillos de una placa negra de 96 pocillos en alícuotas de 20 microlitros. El volumen de cada reacción en el pozo es de 200 microlitros, por lo tanto, las soluciones de trabajo son 10 veces la concentración que se encuentra en el pozo de reacción.
A continuación, programe el lector de microplacas para ejecutar un ensayo cinético para la medición dual de la autoflorescencia del NADH y la fluorescencia del resorufina. Esto se hace seleccionando primero Procedimiento y configurándolo a 25 grados Celsius. A continuación, haga clic en Iniciar cinético.
Configure el tiempo de ejecución durante aproximadamente cinco minutos, seguido de la selección de un intervalo de lectura fluorescente de 30 segundos. A continuación, haga clic en Leer y configure los parámetros de medición fluorescente para su ensayo. Aquí se introducen en el software la posición de la sonda, las longitudes de onda utilizadas para el seguimiento de los cambios en la florescencia y los pozos que se leerán.
También se seleccionan los diferentes canales para las lecturas fluorescentes, uno dedicado a la autofluorescencia del NADH, que se establece en 376 nanómetros de excitación y 450 nanómetros de longitud de onda de emisión. Los cambios en la florescencia de la resorufina se rastrean a 565 nanómetros y 600 nanómetros. Una vez que se han establecido las condiciones de ensayo, los pozos individuales se cargan con tampón y diferentes reactivos necesarios para medir la producción de NADH y superóxido/peróxido de hidrógeno al mismo tiempo.
El orden para cargar los pozos con diferentes reactivos es el siguiente. En primer lugar, se añade al pocillo la cantidad necesaria de tampón, seguida de 20 microlitros de solución enzimática purificada. La enzima se equilibra en el tampón durante unos minutos dentro del instrumento.
Y luego, los reactivos restantes se agregan en el siguiente orden. Una vez añadido el sustrato, pulsar Inicio. El portador de la placa entrará en el lector y se iniciará el protocolo.
Durante el ensayo, las salidas en tiempo real de las unidades fluorescentes relativas en bruto, o RFU, se pueden rastrear mediante el software. El usuario puede alternar entre las diferentes lecturas fluorescentes utilizando la pestaña Datos sobre el diseño del pozo. Tenga en cuenta que se pueden seleccionar curvas para las diferentes lecturas fluorescentes.
Además, al mantener presionada la tecla Control en el teclado y hacer clic con el botón izquierdo en los pozos, se puede obtener un gráfico compuesto que permite comparaciones en tiempo real de las diferentes reacciones. Una vez finalizado el experimento, el portador de la microplaca saldrá del instrumento. En este punto, los resultados en el gráfico representativo de los cambios en RFU se exportan a Excel.
Los valores brutos de RFU se exportan haciendo clic primero en Datos en el gráfico representativo de RFU. Esto producirá una tabla de valores brutos de RFU para NADH y florescencia de resorufina. No es que los números brutos de RFU correspondientes a cambios en la floración de NADH o resorufin no se puedan exportar simultáneamente.
Una vez exportados, los resultados se organizan para su análisis. Utilizando curvas estándar para la fluorescencia de NADH y resorufina generadas antes de realizar el ensayo, se puede calcular la cantidad de NADH en el micromol y de superóxido/peróxido de hidrógeno en el picomol formado a lo largo del tiempo. A esto le puede seguir calculando la tasa de producción de NADH y superóxido/peróxido de hidrógeno.
Para este procedimiento, es vital comprobar la pureza de la flavina deshidrogenasa aislada antes de realizar los ensayos. Esto se puede lograr mediante la realización de una simple tinción de Coomassie para proteínas o mediante el ensayo de la actividad de la enzima en presencia de diferentes sustratos. Tenga en cuenta que se recomienda omitir del ensayo los agentes reductores como el DTT, ya que pueden servir como sustrato para la producción de superóxido/peróxido de hidrógeno mediante deshidrogenasas unidas a flavina.
En general, este método es muy flexible en el sentido de que puede utilizarse para detectar inhibidores de la producción de superóxido/peróxido de hidrógeno y también permite una comparación directa de la capacidad de formación de ROS de diferentes deshidrogenasas mitocondriales ligadas a flavina. Después de ver este video, debería tener una comprensión íntima de cómo medir la producción de ROS y NADH mediante deshidrogenasas purificadas. Este ensayo puede servir como trampolín para experimentos más sofisticados con mitocondrias aisladas.
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Descripción general
Este estudio presenta un método para cuantificar las tasas de producción de superóxido/peróxido de hidrógeno y NADH a partir de deshidrogenasas mitocondriales purificadas que contienen flavina, utilizando fluorometría en microplaca. El método aborda los desafíos en la medición de la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) provenientes de sitios mitocondriales individuales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Biología mitocondrial
Antecedentes
- Las mitocondrias contienen diversas enzimas dependientes de flavina que generan ERO.
- La cuantificación precisa de la liberación de ERO a partir de sitios individuales es difícil.
- Las reacciones laterales no deseadas y la presencia de antioxidantes complican las mediciones.
- Se han utilizado diferentes combinaciones de sustratos e inhibidores para identificar los sitios de producción de ERO.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la medición simultánea de la producción de superóxido/peróxido de hidrógeno y NADH.
- Eliminar reacciones laterales no deseadas en la cuantificación de ERO.
- Proporcionar una evaluación directa del potencial de producción de ERO en sitios mitocondriales.
Métodos Utilizados
- Se utilizaron deshidrogenasas mitocondriales dependientes de flavina purificadas.
- Se empleó fluorometría en microplaca para las mediciones.
- Se realizó la cuantificación simultánea de superóxido/peróxido de hidrógeno y NADH.
- Se utilizaron inhibidores y sustratos específicos para evaluar sitios individuales de producción.
Resultados principales
- El método permite la cuantificación precisa de las tasas de producción de ERO.
- Las reacciones laterales no deseadas se minimizaron eficazmente.
- Se evaluaron con éxito sitios individuales de producción de ERO.
- El enfoque proporciona una comprensión más clara de la dinámica mitocondrial de ERO.
Conclusiones
- Este método mejora la capacidad de estudiar la producción de ERO mitocondriales.
- Ofrece una herramienta confiable para investigadores que estudian la función mitocondrial.
- Los hallazgos podrían tener implicaciones para comprender el estrés oxidativo en las células.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) a partir de enzimas mitocondriales individuales es fundamental para la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos relacionados con el estrés oxidativo. Este método permite la comparación directa entre la formación de ROS y la actividad enzimática, facilitando la reducción mecanicista de riesgos en dianas de deshidrogenasas ligadas a flavinas. Al eliminar sistemas antioxidantes interferentes y reacciones secundarias, proporciona una confianza predictiva para el cribado de inhibidores antes de realizar ensayos mitocondriales o celulares más complejos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de las tasas de liberación nativas de ERO a partir de deshidrogenasas dependientes de flavina purificadas.
- Valor operativo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante la medición directa de superóxido/peróxido de hidrógeno y la producción de NADH a partir de sitios enzimáticos individuales.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al permitir la evaluación de la selectividad y eficacia de inhibidores sobre la producción de ERO antes de realizar ensayos mitocondriales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores al proporcionar lecturas cuantitativas estandarizadas de ERO y NADH.
- Reproducibilidad: Utiliza fluorometría en microplaca con longitudes de onda de excitación/emisión definidas (NADH: 376/450 nm; resorufina: 565/600 nm) para una detección de señal consistente.
- Escalabilidad: Permite la selección de alto rendimiento de inhibidores usando formato de placa de 96 pocillos con volúmenes de reacción de 200 microlitros.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Sirve como un paso intermedio hacia experimentos más sofisticados con mitocondrias aisladas o fibras musculares permeabilizadas, al establecer relaciones enzimáticas de ROS como línea base.
- Sistema Relevante para Enfermedades: Utiliza el complejo de piruvato deshidrogenasa (PDHC) y el complejo de alfa-cetoglutarato deshidrogenasa (KGDHC) derivados del corazón de cerdo como modelos para fuentes mitocondriales de ROS relevantes en enfermedades metabólicas y cardiovasculares.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Aclara si los cambios observados en el ROS se originan en la actividad de la enzima diana o en efectos fuera del blanco o en interferencias con antioxidantes.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de compuestos líderes, proporcionando datos cuantitativos de ERO y actividad que orientan las decisiones de avance o interrupción antes de pasar a modelos fenotípicos complejos o preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de la producción de ERO a partir de deshidrogenasas específicas ligadas a flavina, reduciendo la ambigüedad mecanicista en el análisis de vías.
- Tamizaje: Permite la preparación del ensayo mediante la detección estandarizada y simultánea de la autofluorescencia de NADH y la fluorescencia de resorufina, posibilitando la evaluación fiable de compuestos.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos (NADH en micromoles, superóxido/peróxido de hidrógeno en picomoles a lo largo del tiempo) que permiten calcular tasas de producción para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante la definición de tasas nativas de liberación de ERO para enzimas individuales antes de su evaluación en sistemas mitocondriales intactos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el tamizaje de dianas enzimáticas dependientes de flavina en diversos proyectos, reduciendo el desarrollo redundante de ensayos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la atribución de la fuente de ERO.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante el orden definido de reactivos, ajustes cinéticos y separación de canales de fluorescencia.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la criba temprana de inhibidores, reduciendo los fracasos en fases avanzadas debido a toxicidad mediada por ERO no anticipada.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al cuantificar el potencial de producción de ERO de sitios enzimáticos individuales, informando las decisiones de selección y avance de objetivos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la purificación de enzimas y el establecimiento de ensayos fluorométricos, incluida la validación de la pureza de deshidrogenasas que contienen flavina mediante tinción con coomassie o ensayos de actividad.
- Depende de un lector de microplacas capaz de realizar lecturas cinéticas de doble longitud de onda (376/450 nm para NADH, 565/600 nm para resorufina) con control de temperatura a 25°C.
- Necesita la exclusión de agentes reductores como el DTT, que pueden actuar como sustratos para la producción de superóxido/peróxido de hidrógeno y confundir los resultados.
- Requiere la preparación de soluciones de trabajo a una concentración 10x debido al volumen final de 200 microlitros a partir de alícuotas de 20 microlitros en placas de 96 pocillos.
- Implica limitaciones prácticas, como la necesidad de superóxido dismutasa para convertir el superóxido en peróxido de hidrógeno para su detección mediante el sistema amplex ultrared/peroxidasa de rábano picante.
