Name: Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende a cuantificar células madre de leucemia en muestras de leucemia mieloide aguda y xenoinjertos derivados de pacientes mediante citometría de flujo. Este protocolo permite evaluar la relevancia clínica de estas poblaciones celulares.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el francés Asociación Laurette Fugain, LigueContre le cáncer (centro norte), Fondation de France (Comité de leucemia), Oncolille SIRIC e Instituto Nacional del cáncer francés.

Seguimos las normas europeas para el uso de animales para fines científicos. Este estudio fue aprobado por el Comité de ética local (#3097-2015120414583482v3).
1. preparación de la muestra
<ol><li>Recoger de la médula (2 mL) de novo de AML en tubos que contienen el ácido etilendiaminotetracético anticoagulante (EDTA) en una concentración de 1,8 mg / mL de médula ósea.</li>
	<li>Realizar separación de Ficoll, una separación del gradiente de densidad para aislar las células mononucleares de eritrocitos y granulocitos, como sigue. Diluir la médula ósea en 3 volúmenes de solución salina buffer fosfato (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Cuidadosamente el recubrimiento 1 volumen de Ficoll con 1 volumen de médula diluida. 30 minutos a 300 x g sin freno de la vuelta. Transferir la capa blanca de la capa anteada de células mononucleated en un tubo estéril nuevo.</li>
	<li>Lavar las células dos veces en 10 mL de PBS) y centrifugar a 300 x g durante 5 min, con el fin de eliminar contaminantes componentes del suero.</li>
</ol>2. lisis de glóbulos rojos (RBC)
<ol><li>Añadir 2 mL de tampón de lisis (cloruro de amonio 0,8%) a la celda de pellets, vórtice suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos centrifugar a 300 x g durante 5 minutos. Nota: si es necesario, repita este paso.</li>
	<li>Células de lavado en PBS como describieron anteriormente (1.3.).</li>
</ol>3. paciente derivados de xenoinjertos.
<ol><li>Obtener blastocitos de la médula ósea después de la separación de Ficoll y después del agotamiento de los linfocitos mediante Inmunomagnética negativo selección (CD3 de T y CD20 de los linfocitos B). Siga las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Inyectar 5 x 106 células de la ráfaga AML en la vena de la cola de ratones NSG incondicionadas. Utilice un dispositivo de sujeción para facilitar la inyección de la vena de la cola. Mantenga ratones en condiciones convencionales y especialmente bajo condiciones libres de patógenos específicos en todo momento, mediante el uso de jaulas ventiladas individuales y por manipulación bajo campana de flujo laminar. Cada dos semanas, tome 60 μL de sangre por el método de colección submaxilar con un hematocrito capilar. Lugar del tubo capilar en 5 mL redondo tubo inferior. Detener el sangrado aplicando presión suave con una pequeña gasa estéril. Expulse la sangre con una jeringa limpia.</li>
	<li>Añadir 1ml de tampón de lisis e incubar durante 5 minutos. Luego centrifugar a 300 x g durante 5 min lavado con PBS y centrifugre a 300 x g durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante, agregar 100 μl PBS con 10% de albúmina sérica bovina (BSA) Mancha con 3 μl anti-humanos CD45 FITC y anti-murino de 1 μl CD45-APC e incube a 4 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Lavar el precipitado de células dos veces en PBS (2 mL) con 10% de BSA y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Alícuota hasta 1 x 106 células por 100 μl de PBS en tubos de citómetro de flujo.</li>
	<li>Engraftment encuesta cada dos semanas por el análisis del quimerismo de expresión de CD45 (humano y murino) mediante citometría de flujo (figura 2A y B).</li>
	<li>En sacrificio (cuenta de explosión periférica superior a 70% o severos signos clínicos de la enfermedad), recoger células mononucleares de la ráfaga de picado bazo y de médula ósea mediante lavado tibias y fémures con PBS como describieron anteriormente13. Eutanasia a ratones mediante dislocación cervical siguiendo las directrices internacionales.</li>
	<li>Si el sedimento celulares contiene RBC, realizar lisis de glóbulos rojos con tampón de lisis (paso 2.1).</li>
	<li>Pellet de células de lavado dos veces en PBS (2 mL) con 10% de BSA y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Recoger las células y alícuota a 1 x 106 células por 100 μl de PBS en tubos de citómetro de flujo.</li>
</ol>4. coloración
<ol><li>Añadir vortex y anticuerpos conjugados (ver paso 4.2). Incube las células durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilice el panel siguiente para primaria humana o PDX muestras de 10 μl de anti-CD36-FITC, 5 μl de anti-CD19-ECD, 5 μl de anti-CD33-PC5.5, 5 μl de anti-CD90-APC, 5 μl de anti-CD34-AA700, 5 μl de anti-CD45RA-APC-H7, 5 μl de anti-CD38-Pacífico azul, 5 μl de anti-CD123-PC7 y 2,5 μl de anti-CD45-KO.</li>
	<li>Retirar los anticuerpos no Unidos lavando las células en 2 mL de PBS por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Resuspenda las células en 450 μl de PBS para análisis cytometric del flujo final.</li>
</ol>5. estrategia para el análisis de citometría de flujo que bloquean
<ol><li>Realizar adquisición de datos (por lo menos 500.000 células) en un citómetro de flujo equipado con láser rojo, azul y violeta. Compruebe la configuración de citómetro cada día 1) óptico de la alineación, 2) fluídico, sensibilidad 3) óptico, y 4) normalización utilizando fluorospheres</li>
	<li>Seguir la estrategia bloquea alternativamente para definir la expresión de CD38 (figura 1).<ol>
<li>Utilizan células de médula ósea normal muestras para definir hematogones o células plasmáticas que servirá como control positivo para la expresión de CD38. Nota: esta puerta es especialmente importante evaluar como poblaciones de LSC supuestas posteriores dependen de su definición.</li>
		<li>Definir células precursores fisiológicos (blastocitos normales) por criterios de población CD45dim/SSC (dispersión lateral) (figura 1A). Dentro de esta población de la ráfaga, definir hematogones, que muestran un CD38 ++ fenotipo CD19 + (figura 1B) y por último, expresión de CD36 y CD33 para definir los monoblasts y mieloblastos y eritroblastos (figura 1). Determinar la expresión de CD34 en hematogones como se muestra en la (Figura 1E). Evaluar varias subpoblaciones de precursores dentro de las células de la ráfaga definidas como P6-P10 (figura 1). Separar el compartimiento de CD34 de células de la ráfaga en P6, P7, P8 subpoblaciones de progenitor basadas en puertas de CD38 preestablecidos. Asegúrese de que el compartimiento P8 contiene las ráfagas que tienen la misma intensidad de CD38 como los hematogones, que P6 incluye células CD38-basado en la fluorescencia de CD38 menos uno control (FMO) y que P7 células entre los dos extremos en relación con CD38 expresión (figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>El CD34 + 38-(P6) células cerradas, separar HSC LSC putativo con expresión CD90 y CD45RA (Figura 1F). Nota: el fenotipo HSC es CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- y los progenitores multipotentes (MPP) se definen como CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. El fenotipo LSC putativo es CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + y la población aguas abajo más inmadura son los progenitores linfoides preparado (LMPP) definidos como CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.</li>
</ol>6. monitoreo por RT-PCR de MRD
<ol><li>Controlar los niveles de MRD por RT-PCR como se describió anteriormente14.</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una evaluación precisa y reproducible de membrana o marcadores citoplasmáticos por citometría de flujo requiere que opciones se verifican cada día para la alineación óptica, buen funcionamiento del sistema neumático, sensibilidad óptica y normalización con perlas de calibración.
Detección de poblaciones celulares de la ráfaga en AML mediante análisis de citometría de flujo multi-paramétricos CD90 y CD45RA es un método relativamente simple y confiable. Un paso fundamental en este análisis es un...

Leucemia mieloide aguda (AML) es la causa más común de mortalidad asociada a la leucemia. Inicialmente, la LMA es una enfermedad clonal de las células madre hematopoyéticas (HSC) caracterizado por la detención de la diferenciación, la posterior acumulación de células de la ráfaga y la producción de elementos hematopoyéticos funcionales. Recientemente, heterogeneidad clonal de la población de células de la ráfaga se ha establecido básicamente utilizando estrategias de secuenciación (NGS) de próxima generación y que muestra la existencia de la evolución intra clonal del tumor las células1.
Heterogeneidad se extiende a la presencia de células leucémicas (LSC). Se presume que este compartimiento celular dinámica evoluciona para superar distintas presiones de selección impuestas durante el tratamiento y la progresión de la leucemia. LSC, por tanto, debían ser resistentes a los regímenes quimioterapéuticos actuales y mediar la recaída de la enfermedad, con profundas implicaciones clínicas2. Se han descrito diversos marcadores para caracterizar la LSC como CD1233, 1 CLL4, CD975 o TIM-36. El CD34 + CD38-compartimiento de células de la ráfaga se considera para ser enriquecidos para LSC7 pero también incluye HSC normal. CD90 y CD45RA expresión aplicada a CD34 + CD38-compartimiento (P6) (figura 1) permite para segregar varias etapas de precursores hematopoyéticos normales y malignas8. En concreto, normales CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotentes progenitores (MPP) como CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-células CD34 + CD38-CD90-CD45RA + células progenitoras multipotentes linfoide preparado (LMPP) pueden determinarse en la mayoría de AML casos8 ,9. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de CD38 es particularmente importante a considerar dentro del compartimiento de la célula de CD34 +. Debido a intensidad de CD38 define sus tres compartimentos celulares nuevos: CD38 negativo (P6), CD38 dim (P7) y CD38 brillante (P8) (figura 1). El MFI de CD38 puede determinarse utilizando hematogones o células plasmáticas como control positivo interno, estas células expresan fuertemente CD38.
El modelo de ratónnulo (NSG) inmunodeficiente NOD/SCID/IL2Rγc es ampliamente utilizado para el engraftment de normal y humanos malignos hematopoyéticos células10,11. Xenotrasplante serie ensayos se utilizan para validar experimentalmente la función LSC o HSC. Estos estudios han sido ampliamente analizados por métodos de secuenciación a gran escala. Sin embargo, poco se sabe sobre el immunophenotype LSC y HSC de la población de la ráfaga AML engrafted en ratones NSG en comparación con la LMA primaria (figura 2).
Los números de LSC son inherentemente bajos así, identificación y cuantificación de LSC son desafiantes y el método descrito aquí puede utilizarse como un análisis de citometría de flujo en el diagnóstico y seguimiento clínico hasta evaluar la respuesta de la quimioterapia (como LSC residual puede causar recaída AML). La presencia de LSC puede indicar positivo enfermedad residual mínima (Milirutherford). Hasta la fecha, MRD monitoreo en AML en su mayoría dependen de métodos moleculares (es decir, RT-PCR, NGS)10,12. Sin embargo, en este protocolo se detecta expresión de la proteína simultáneo de varios marcadores HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) en las células primarias de la ráfaga de AML humano por citometría de flujo multiparamétrico2,8,9. Esta combinación de anticuerpos que puede ser aplicada en cualquier laboratorio de citometría de flujo estándar y este análisis MRD de flujo es particularmente interesante cuando MRD por reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR) no es posible, es decir, si la leucemia específica molecular los marcadores no son detectables en la muestra diagnóstico de AML. Además, este protocolo, es complementario a las técnicas moleculares más sensibles de MRD, como su objetivo es detectar y cuantificar las células progenitoras hematopoyéticas anormales que representa una característica funcional de la célula (figura 3).
Mostramos cómo cuantificar tres poblaciones hematopoyéticas progenitoras y el compartimiento supuesto de LSC con diferente grado de maduración mediante citometría de flujo con anticuerpos disponibles en la mayoría de los laboratorios clínicos. Además, confirmó la presencia de estos compartimentos celulares en correspondientes paciente-derivado-xenoinjertos (PDX) y en el tratamiento de seguimiento.

<table><tbody><tr><td>Pancoll</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10x)</td><td>Ozyme</td><td>BLE420301</td><td>RBC Lysis solution A : 8,29 g de NH4Cl + 0,037 g de Na2EDTA en 100 mL de solución estéril de H2O y RBC Lysis B: 1 g de KHCO3 en 100 mL de H2</td></tr><tr><td>O NOD/SCID/IL2R&gamma estéril; cnull&nbsp; (NSG)&nbsp; ratones</td><td>JACKSON LABORATORY</td><td>Nº de inventario: 005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco de life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer &ndash; Tampón de separación</td><td>MACS Tampón MACS Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD36-FITC (clon FA6-152, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33-PC5.5 (clon D3HL60.251, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-APC (clon 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-ECD (clon J3-119, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-AA700 (clon 581, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45RA-APC-H7 (clon HI100)&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-Pacific Blue (clon LSI98-4-3, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-KO (clon J.33, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD123-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Set</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD BD</td><td>Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>Kit de selección de PE humano EasySep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&nbsp; imán&nbsp;</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Leucemia mieloide aguda (AML) es heterogénea y si no se trata, la enfermedad fatal. Es la causa más común de mortalidad asociada a la leucemia en adultos. Inicialmente, la LMA es una enfermedad de las células madre hematopoyéticas (HSC) caracterizado por la detención de la diferenciación, la posterior acumulación de células de la ráfaga de la leucemia y la producción de elementos hematopoyéticos funcionales. Heterogeneidad se extiende a la presencia de células de la leucemia (LSC), con esta dinámica celular compartimiento evolucionando para superar distintas presiones de selección impuestas durante el tratamiento y la progresión de la leucemia. Para definir la población de la LSC, la adición de CD90 y CD45RA permite la discriminación de HSCs normales y progenitores multipotentes dentro del compartimiento de células CD34 + CD38. Aquí, describimos un protocolo para detectar la expresión simultánea de varios marcadores LSC putativos (CD34, CD38, CD45RA, CD90) en las células primarias de la ráfaga de AML humana mediante citometría de flujo multiparamétrico. Además, mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos. Este método de detección y cuantificación de LSC putativo pueden usarse para el seguimiento clínico de la respuesta de la quimioterapia (ej., enfermedad residual mínima), como LSC residual puede causar recaída AML.

Aquí presentamos un método para determinar las poblaciones progenitoras en muestras de médula ósea de humanos normales y malignas. Recogió la médula ósea y el bazo de un éxito PDX y realizar citometría de flujo multiparamétrico, como se describe anteriormente. Se compararon varias subpoblaciones de células de la ráfaga entre la muestra del paciente diagnóstico y PDX correspondiente y particularmente, el compartimiento del progenitor de CD34 + CD38, notablemente enriquecidas en LSC putativo. Hemos encontrado que la fracci...

Contorneamos un protocolo para detectar la expresión simultánea de marcadores de células madre de leucemia en las células de la leucemia mieloide aguda primaria por citometría de flujo. Mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos.

Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

El objetivo general de este procedimiento es estimar las células madre de la leucemia en la leucemia mieloide aguda y en los xenoinjertos derivados del paciente mediante citometría de flujo en el momento del diagnóstico y en el seguimiento del tratamiento. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la hematología/oncología, como la relevancia clínica de la evaluación cuantitativa de las células madre de la leucemia mediante citometría de flujo en la leucemia mieloide aguda. La principal ventaja de esta técnica es que es aplicable a la mayoría de los laboratorios de hematología/oncología con anticuerpos de uso común.Este procedimiento será demostrado por Thomas, un postdoctorado, Fanny, una estudiante de posgrado, y Adeline, una ingeniera de mi laboratorio. Para empezar, recoja dos mililitros de médula ósea de la LMA de novo en tubos que contengan 1,8 miligramos por mililitro del anticoagulante EDTA. Aísle las células mononucleares de los glóbulos rojos y los granulocitos diluyendo primero la médula ósea en tres volúmenes de PBS.Luego, superponga cuidadosamente un volumen de ficol con un volumen de médula ósea diluida. Gira el gradiente de densidad a 300 g durante 30 minutos sin interrupción. A continuación, transfiera la capa de células mononucleadas de la capa leucitaria blanca a un nuevo tubo estéril.Para eliminar los sobrenadantes que contaminan los componentes del suero, agregue 10 mililitros de PBS y centrifugue las células a 300 g durante cinco minutos antes de repetir el lavado. Lisar los glóbulos rojos añadiendo dos mililitros de tampón de lisis a la pastilla celular y al vórtice suave. Luego, incuba las células a temperatura ambiente durante cinco minutos.Centrifugar las células a 300 g durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante. Luego, use PBS para lavar las celdas. Después de aislar las células blásticas de la médula ósea de acuerdo con el protocolo de texto, bajo una campana de flujo laminar, inserte un ratón NSG no condicionado en un dispositivo de restricción e inyecte cinco veces 10 a la sexta células blásticas de AML en la vena de la cola.Devolver el ratón a una jaula individual ventilada en condiciones convencionales y específicas libres de patógenos. Cada dos semanas, utilice un método de recolección submandibular con un capilar de hematocrito para extraer 60 microlitros de sangre. Transfiera el capilar a un tubo de cinco mililitros y luego, con una gasa estéril, aplique una presión suave para detener el sangrado.Agregue un mililitro de tampón de lisis al tubo y haga un vórtice suave. Luego, incuba las células a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrifugar las células a 300 g durante cinco minutos.Luego, después de eliminar el sobrenadante, agregue 100 microlitros de PBS con 10% de BSA, tres microlitros de FITC CD45 antihumano, incube durante 30 minutos. A continuación, lavar el pellet de célula dos veces en PBS, dos mililitros, con 10%BSA y centrifugar a 300g durante cinco minutos. Cada dos semanas, utilice la citometría de flujo para analizar el injerto mediante un análisis de quimerismo de la expresión humana frente a la murina.Cuando el recuento de blastos sea superior al 70% o se observen signos clínicos graves de enfermedad, se sacrifique al animal y recoja las células blastas mononucleares de un bazo triturado y de la médula ósea mediante el uso de PBS para lavar las tibias y los fémures como se describió anteriormente. Para llevar a cabo la tinción en panel, combine anticuerpos conjugados con muestras de xenoinjerto primario humano o derivado del paciente, o PDX, y agite los tubos. Luego, incube las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos.Elimine los anticuerpos no unidos mediante el uso de dos mililitros de PBS para lavar las células. Vuelva a suspender las células en 450 microlitros de PBS, luego proceda al análisis de citometría de flujo y al monitoreo de MRD. Para evaluar de forma precisa y reproducible la membrana de los marcadores citoplasmáticos mediante citometría de flujo, verifique la alineación óptica.La puesta a punto adecuada del sistema 3D y la sensibilidad óptica y la estomatización mediante la calibración de la estomacina late todos los días. Use médula ósea normal para establecer las compuertas para CD38. Se requiere un mínimo de 500.000 eventos y se verifica que cada ejecución de flujo sea regular y homogénea.Además, se eliminan los dobletes, así como las células muertas y los restos de células. Las células hematopoyéticas inmaduras se definen por ser CD45 intermedias, SSC bajas. Y los CD38 positivos de control o hematógonos, son CD19/CD38 doble positivos.A continuación, se definen P8 o CD38 positivo, P7 o CD38 intermedio y P6 o CD38 negativo. Las células P6 se pueden subdividir a su vez en HSC, MPP y LSC. Al tratarse de una médula ósea normal, es LSC negativa.Mediante citometría de flujo multiparamétrica, se encontró que la fracción blástica CD34 positiva y CD38 negativa fue mayor en PDX en comparación con la muestra de paciente diagnóstico. Curiosamente, se encontró un mayor porcentaje de LSC putativo en el PDX en comparación con la muestra principal del paciente, lo que sugiere un posible enriquecimiento de células progenitoras malignas en los tejidos hematológicos en este modelo de ratón. Al comparar las poblaciones de progenitores blásticos en dos muestras diferentes de pacientes, la fracción CD34 positiva y CD38 negativa aumentó del 0,06 % en el diagnóstico al 3,33 % en el primer seguimiento del tratamiento en el primer paciente.Por el contrario, la fracción CD34 positiva y CD38 negativa disminuyó en el segundo paciente del 7,8% en el diagnóstico al 2,27% en el primer seguimiento del tratamiento. En consecuencia, la fracción putativa de LSC aumentó en el primer paciente del 0% al 0,65% en el momento del diagnóstico al 0,65% y disminuyó en el segundo paciente del 6,57% al diagnóstico al 1,44% en el seguimiento del tratamiento. El seguimiento de la enfermedad residual mínima o de la ERM, utilizando como marcadores moleculares la mutación NPM1 en el paciente uno y la fusión del gen CBF-beta MYH11 en el paciente dos, mostró que la ERM molecular disminuyó menos en el primer paciente en comparación con el segundo paciente en el primer punto de seguimiento del tratamiento.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente. Mientras intenta este procedimiento, es importante verificar la configuración de la citometría de flujo y la medición de CD38. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales, como la clasificación de células por citometría de flujo, con el fin de responder a preguntas adicionales como la evaluación de células madre de leucemia funcional.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar y cuantificar células madre de leucemia en muestras de pacientes en xenoinjertos derivados de pacientes. No olvide que trabajar con muestras de pacientes puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como las pautas del GOP y los procedimientos de seguridad institucionales mientras realiza este procedimiento.

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Detección de enfermedad residual mínima o medible (Milirutherford) es un biomarcador pronóstico importante para refinar la evaluación de riesgo y predicción de la recaída en la leucemia mieloide aguda (AML). Estas directrices amplias y recomendaciones con las mejores prácticas de identificación consistente y precisa y detección de MRD, puede ayudar en la toma de decisiones eficaces de tratamiento de AML.

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

La diagnosis MDS es difícil en ausencia de criterios morfológicos o citogenética no informativo. MFC podría ayudar a perfeccionar el proceso de diagnóstico de MDS. Para ser de utilidad para la práctica clínica, el análisis MFC debe basarse en parámetros con suficiente especificidad y sensibilidad, y resultados deben ser reproducibles entre diferentes operadores.

Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula

Describimos un método para utilizar citometría de flujo multiparámetro para detectar especies de oxígeno reactivo mitocondrial (ROS) en células hematopoyéticas sanas murinas (HSCCP) y células de leucemia a partir de un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda (LMA) impulsada por MLL-AF9.

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

Presentamos dos diversos protocolos de coloración para la detección del ligand de NKG2D (NKG2DL) en muestras agudas primarias humanas de la leucemia mieloide (AML). El primer enfoque se basa en una proteína de fusión, capaz de reconocer todos los ligandos conocidos y potencialmente desconocidos, mientras que el segundo protocolo se basa en la adición de múltiples anticuerpos anti-NKG2DL.

Dos Enfoques Citométricos De Flujo De La Detección De Superficie Del Ligando NKG2D Para Distinguir Las Células Madre De Las Subpoblaciones A Granel En La Leucemia Mieloide Aguda

Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.

Identificación de poblaciones microambientales de médula ósea en el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda

Utilizamos la tinción de proliferación celular para identificar células quiescentes en el modelo de leucemia linfoblástica aguda T de pez cebra. La tinción se retiene en las células que no se dividen y se reduce durante la proliferación celular, lo que permite la selección de células inactivas para su posterior interrogación. Este protocolo proporciona una herramienta funcional para estudiar la autorrenovación en el contexto de la quiescencia celular.

Identificación de células quiescentes en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra mediante tinción de proliferación celular 

Aquí, se describe un método basado en citometría de fosfoflujo para analizar la señalización aguas abajo de las vías mTORC1, JAK/STAT5 y MAPK en células de leucemia mieloide humana aguda xenoinjertadas en ratones y obtenidas de aspirados de médula ósea. Los niveles de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 y p-ERK1/2 se miden simultáneamente utilizando un citómetro de flujo espectral de última generación con alta sensibilidad.

Citometría de fosfoflujo intracelular de xenotrasplantes derivados de pacientes con leucemia mieloide aguda

Este protocolo describe el xenoinjerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B y T derivadas del paciente, que ocurre 4 días después de la inyección.

En Ovo Xenoinjerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-ALL)

El protocolo tiene como objetivo describir un modelo de ratón para generar recaídas de leucemia linfoblástica aguda, basado en la dinámica de la respuesta a la quimioterapia de inducción.

Modelo murino de leucemia Recaída a quimioterapia de inducción para la leucemia linfoblástica aguda

Este protocolo describe el uso de elutriación centrífuga para separar las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula.

Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

Aprende a cuantificar células madre de leucemia en muestras de leucemia mieloide aguda y xenoinjertos derivados de pacientes mediante citometría de flujo. Este protocolo permite evaluar la relevancia clínica de estas poblaciones celulares.

Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta (Video) | JoVE Journal

Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

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