Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

El objetivo general de este procedimiento es realizar con éxito una microinyección en embriones de nasonia vitripennis para facilitar la manipulación genómica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la biología de Nasonia vitripennis, como la producción de veneno y la determinación del sexo. La principal ventaja de utilizar esta técnica es que permite la manipulación directa en el genoma de la avispa y ofrece una amplia variedad de modificaciones genómicas avanzadas.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Ming Li, un post-doc de nuestro laboratorio. Para empezar, establezca varias colonias de N. vitripennis colocando de 200 a 500 adultos con una proporción de tres a uno de hembras y machos en jaulas de insectos. Mantenga las avispas a 25 más o menos un grado centígrado con 30% de humedad relativa y un ciclo de luz/oscuridad de 12 a 12

Durante dos días, permita que las hembras apareadas se alimenten de pupas frescas de S. bullata, así como de pequeñas gotas de una solución de agua de sacarosa de uno a diez volúmenes. Durante los dos días siguientes, retire las pupas de mosca para privar a las avispas hembras de un sitio de oviposición, haciéndolas muy grávidas. Para mantener frescos los huéspedes de las pupas de S. bullota, guárdelos a 4 grados centígrados inmediatamente después de obtenerlos y retírelos solo cuando sea necesario.

Diferencie entre los huéspedes jóvenes que tienen un pupario de color rojo y los huéspedes mayores que tienen un pupario de color más oscuro. Permita que las avispas hembras parasiten al huésped joven colocando pupas frescas individuales de S. bullata en un tapón de espuma con un agujero del tamaño de una pupa cortado en el centro. Para obtener la máxima concentración de parasitación y facilitar la recolección de embriones, exponga solo unos 0,2 centímetros del extremo anterior del huésped, que es redondeado, en comparación con el extremo posterior, que es más grueso y contiene una abertura en forma de cráter.

Coloque las pupas del huésped en este arreglo en la jaula y espere aproximadamente 45 minutos para permitir que las avispas las parasiten. Elimine los huéspedes parasitados recuperándolos con la mano y golpeando suavemente o soplando las avispas residuales. Reemplácelos con huéspedes frescos aproximadamente cada 15 minutos para continuar recolectando huevos en etapa temprana durante las inyecciones.

Bajo un microscopio de disección, use fórceps para pelar cuidadosamente el extremo posterior del pupario exterior de un huésped recién parasitado para exponer los huevos de N. vitripennis. Luego, prepare un portaobjetos de alineación de embriones usando adhesivo líquido para pegar un portaobjetos de cubierta en un portaobjetos de vidrio limpio. Con un pincel húmedo de punta fina, cepille cuidadosamente los embriones del huésped, asegurándose de no dañar la suave piel de pupa del huésped.

Luego, con el pincel húmedo, transfiera aproximadamente 20 embriones uno por uno al portaobjetos, inmediatamente adyacente al costado del cubreobjetos. Oriente el extremo anterior del embrión contra el borde del portaobjetos, de modo que los extremos posteriores del embrión apunten en la misma dirección. Esto permitirá una mayor precisión de inyección en la misma posición entre todos los embriones.

Después de tirar de las agujas de inyección de acuerdo con el protocolo de texto, biselar la punta de la aguja tocando ligeramente la punta con una placa abrasiva de diamante a 25 grados centígrados durante aproximadamente 10 segundos. Prepare la mezcla de inyección que consiste en reactivos de modificación del genoma y manténgala en hielo. Utilice una punta de microcargador para cargar la aguja de inyección con dos microlitros de mezcla de inyección.

Luego, coloque el portaobjetos de vidrio con los embriones alineados en la platina de un microscopio compuesto. Inserte con cuidado la aguja en el extremo posterior del embrión con un ángulo vertical de 25 a 35 grados. Luego, inyecte de uno a cinco picolitros de mezcla de inyección y asegúrese de que el embyro se hinche ligeramente con la inyección.

Si se produce una obstrucción, intente volver a biselar las agujas. El citoplasma de los embriones de N. vitripennis es inusualmente viscoso y pegajoso, lo que conduce a la obstrucción frecuente de las agujas. Inyecte aproximadamente de 20 a 40 óvulos a la vez y luego deténgase.

Transfiera los huevos inyectados con un pincel húmedo tocando ligeramente los huevos inyectados y colóquelos en un huésped. Luego, continúe inyectando, usando un lote de huevos frescos y recién puestos. Idealmente, este paso es más efectivo cuando una persona está recolectando y alineando óvulos, mientras que otra persona está inyectando componentes de modificación del genoma y trasplantando embriones inyectados en pupas del huésped.

Después de la microinyección, use un pincel húmedo para colocar cuidadosamente hasta 40 embriones G zero inyectados, uno a la vez, sobre pupas de S. bullata previamente picadas. Coloque las pupas huésped en una placa de Petri con papel de filtro húmedo y bolas de algodón e incube a 25 grados centígrados con aproximadamente un 70% de humedad hasta que los embriones inyectados eclosionen en aproximadamente uno o dos días. Es importante destacar que los huéspedes pueden quedar con un pupario pelado, y los huevos de N. vitripennis se desarrollarán normalmente, siempre y cuando se incuben en una cámara humidificada para evitar la desecación.

Después de que eclosionen los embriones G zero, transfiera las pupas huésped a una nueva placa de Petri e incube a 25 grados centígrados y 70% de humedad. Monitoree diariamente las pupas del huésped y las larvas G zero inyectadas. Si las pupas del huésped tienen un olor desagradable, transfiera las larvas inyectadas a nuevas pupas sanas del huésped.

Para una penetración efectiva de la aguja y la microinyección en embriones de N. vitripennis, se probaron diferentes extractores de micropipetas con varios tipos de agujas de vidrio capilar con filamentos, incluidos cuarzo, aluminosilicato y borosilicato, para tener una punta larga hipodérmica deseada, efectiva para la microinyección de embriones de N. vitripennis. Los componentes de modificación del genoma utilizados aquí fueron ARN guía mixtos y proteína cas9 para la edición del genoma mediada por Crisper. En este experimento, se inyectó un sgRNA dirigido al gen del cinabrio en cantidades variables, junto con la proteína cas9, en N. vitripennis.

Esta tabla muestra que las tasas de supervivencia fueron dependientes de la dosis, ya que el aumento de la concentración de sgRNA y la proteína cas9 condujo a una disminución de las tasas de supervivencia. Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado de no perforar ni desecar los embriones de avispa durante la manipulación o transferencia utilizando cuidadosamente un pincel de punta fina humedecido o un palillo de embriones. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recuperar, microinyectar y trasplantar embriones de avispa de manera eficiente para realizar con éxito modificaciones avanzadas del genoma.