Name: Ensayo de reparación de membrana de la célula utilizando un microscopio de dos fotones láser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprende a cuantificar la reparación de membrana plasmática en células de pacientes con distrofia muscular mediante ablación láser de dos fotones. Este protocolo permite la cuantificación en tiempo real de la cinética de resellado en células vivas.

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Este trabajo fue financiado por la Universidad de Alberta Facultad de medicina y odontología, los amigos de Garrett Cumming silla del fondo de investigación, HM Toupin neurológica fondo silla de la investigación de ciencia, Distrofia Muscular de Canadá, Fundación de Canadá para la innovación (CFI), Alberta educación y tecnología avanzada (AET), institutos canadienses de investigación en salud (CIHR), viaje de Jesse - la Fundación de Gene y terapia celular, las mujeres y el Instituto de investigación de salud de los niños (WCHRI), y Alberta Innovates Health Solutions (AIHS ).
Nos gustaría agradecer a Dr. Steven Laval por proveernos el plásmido de cuerpo entero del dysferlin. También nos gustaría agradecer a Dr. Katsuya Miyake por asesoramiento técnico.

Las células de fibroblastos humanos utilizadas en este estudio fueron utilizadas con la aprobación del Comité de ética humana de la Facultad de medicina y Odontología de la Universidad de Alberta.
1. transfección de células con el plásmido DYSF integral
<ol>
	<li>Células fibroblastos en cultivo en un matraz T225 que contiene 40 mL de medio de crecimiento - 36 mL Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), 4 mL de suero bovino fetal (FBS) y 20 μl de penicilina/estreptomicina (P/S) - en un incubador de CO2 a 37 ° C. Nota: Las células deben ser cultivadas a aproximadamente 70-80% de confluencia y no debe ser completamente confluente.</li>
	<li>Para preparar las células para la siembra, lavar las células con 40 mL de tampón fosfato salino (PBS) dos veces y, a continuación, añadir 5 mL de tripsina 0,05% para separar las células. Volver a las células a los 37 ° C CO2 incubadora e incubar las células durante 5 minutos.<ol>
		<li>Cuando las células están completamente separadas, añadir 40 mL de medio de crecimiento para detener la reacción de la tripsina.</li>
		<li>Contar las células usando un hemocitómetro u otro celular dispositivo de conteo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Semilla 2 mL de células 1 x 105 células/ml en platos de fondo de cristal colágeno cubierto de 35 mm. Incube las células durante la noche en un incubador de CO2 a 37 ° C. Nota: Las células deben ser aproximadamente 50-60% confluente al día siguiente.</li>
	<li>Quitar los medios de cultivo y reemplazarlo con 2 mL de suero privados medios (crecimiento sin SFB).</li>
	<li>Transfectar las células con el plásmido de cuerpo entero del dysferlin usando lipotransfection.<ol>
		<li>Preparar 150 μL de medios privados de suero en un tubo de 1,5 mL (un tubo para cada plato a ser transfectadas).</li>
		<li>Agregar 3 μl de reactivo de transfección a cada tubo de 1,5 mL que contiene los medios de comunicación privados de suero. Se incuban un mínimo de 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>En un tubo separado 1,5 mL, añadir 175 μl de medios privados de suero y 3,5 μg de ADN plásmido. Nota: Multiplique las cantidades anteriores para cada plato adicional a ser transfectadas.</li>
		<li>Mezcle 150 μL de medios que contiene ADN de plásmido en un tubo con 150 μL de reactivo de transfección y medios privados de suero. Incubar por 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Distribuir 300 μL de medio con el reactivo de plásmido y transfección en el plato. Incubar los platos por 24 h en un incubador de CO2 a 37 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sustituir los medios de comunicación con medios de cultivo fresco con suero e incubar durante 24 h adicional en un incubador de CO2 a 37 ° C.</li>
</ol>
2. preparación de células de ensayo hirió a dos fotones
<ol>
	<li>Quitar los medios de comunicación mediante pipeteo y enjuague las celdas una vez con 1 mL de solución de Tyrode, luego agregar 1 mL de solución de Tyrode fresca que contiene 1 μl de 2.5 mM FM tinte 4-64. Nota: La concentración final de tinte 4-64 de FM es de 2.5 μm.</li>
	<li>Si se desea la evaluación de la reparación de la membrana en un ambiente empobrecido en calcio, enjuague las células con 1 mL de PBS y luego añadir 1 mL de PBS con 1 mM EGTA. Nota: Como PBS hará que las células separar en el tiempo, el análisis de la herida debe completarse lo antes posible.</li>
</ol>
3. dos fotones láser hirió a ensayo
<ol>
	<li>Utilizando un microscopio confocal invertido y el software asociado de programa, crear un destino de μm 0.2 μm x 2 y colóquelo en el borde de la membrana celular para que la línea de blanco se superpone y se encuentra perpendicular a la dirección de la membrana celular (figura 2).</li>
	<li>Utilizar un láser de HeNe 543 nm para excitar la señal de FM tinte y establecer el rango de detección para 600-760 nm. Utilizar un láser de argón de 488 nm para excitar la señal GFP (figura 4) y ajustar el rango de detección de 500-550 nm.<ol>
		<li>Crear una serie de tiempo de 5 minutos de análisis de imagen secuencial, imagen células cada 5 s.</li>
		<li>Para generar una lesión de la membrana, las células de cloro usando un laser de dos fotones a 820 nm, utilizando el 15% energía con 10 iteraciones del laser y bleach células 25 s después del inicio de la serie de tiempo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para cuantificar FM fluorescencia de tinte 4-64, utilice el software para dibujar un 6 μm x 6 μm región de interés (ROI) y colocar adyacente a la localización de la herida y dentro de la célula (figura 3). Nota: Evite áreas de muestreo de sobresaturación de píxeles mediante la función "Indicador de rango" en el software - en esta aplicación, píxeles rojos representan píxeles sobresaturados. Valores de fluorescencia crudo de exportación en una hoja de cálculo electrónica para el análisis estadístico.</li>
	<li>Calcular los valores de fluorescencia relativa para cada punto del tiempo restando el valor de fondo (valor de fluorescencia promedio de los puntos de tiempo antes de herir la membrana) y dividiendo el aumento neto de la fluorescencia valor en t = 0 (figura 5, 6) .</li>
</ol>

<ol><li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li>
<li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li>
<li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emergency+response+team+for+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li>
<li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Repair%3A+Mechanisms+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li>
<li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+free+Ca2%2B+and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li>
<li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li>
<li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li>
<li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li>
<li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+behave+as+Ca2%2B-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca%282%2B%29-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li>
<li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li>
<li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi%2Fbeige+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li>
<li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos%3A+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li>
<li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li>
<li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298(2012).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li>
<li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li>
<li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li>
<li>Lee, J., Yokota, T. Ch 6. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Translational+Research+in+Muscular+Dystrophy%22">Translational Research in Muscular Dystrophy</a>. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. , Springer Japan. 87-102 (2016).</li>
<li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Dos fotones láser herir de la membrana celular es una técnica precisa y versátil para la evaluación de la dinámica de la membrana de cierre in vitro. En este artículo, describe un protocolo para determinar la membrana de la célula resellado capacidad en dysferlinopathy paciente células usando el laser de dos fotones hiriendo a ensayo. Nuestros resultados muestran que las células pacientes dysferlinopathy son defectos de cierre de la membrana de la célula, que es consistente con hallazgos de otros investigadores ...

La membrana celular de las células eucariotas consiste en una doble capa de fosfolípidos proteína tachonada, que define el entorno intra/extracelular de la célula y es esencial para mantener la homeostasis celular, supervivencia celular. Lesiones de la membrana de la célula derivados de insultos mecánicos o químicos son comunes en varios tipos de células de mamífero, incluyendo esquelético y músculo cardiaco, estómago y pulmón células1,2,3,4. Además de lesiones consiguientes a función fisiológica diaria, las membranas celulares también pueden dañarse por insultos ambientales, toxinas bacterianas y reperfusión isquémica5. Falta para sellar roturas en la membrana celular conduce a un flujo no regulado de extracelular Ca2 +- junto con otros componentes extracelulares potencialmente tóxicos - en la célula, activación de cascadas de la señal descendente que pueden resultar rápidamente en la célula muerte1,4,5,6.
Hasta la fecha, ha habido varios modelos propuestos para la reparación de la membrana en las células. Mecanismos de reparación diferente pueden activarse dependiendo del tamaño y naturaleza de la ruptura de la membrana. Por ejemplo, se sugiere que las membranas celulares pueden utilizar flujo lateral u obstrucción para reparar pequeñas alteraciones de proteínas (&#60; 1 nm). El modelo de fusión lateral propone que rupturas de la membrana son rápidamente reparados a través reclutamiento lateral del dysferlin-que contiene la membrana7, mientras que la proteína que el modelo sugiere que se reparar pequeñas perforaciones a través de las agregaciones de la proteína (en su mayoría anexinas) 8. por el contrario, provocar lesiones de membrana más grandes Ca2 +-fusión de la vesícula dependiente, dysferlin-mediada y la formación de un parche de reparación. En el modelo del parche de reparación, una rápida Ca2 + afluencia en la célula provoca la contratación de múltiples proteínas (dysferlin, anexinas, mitsugumin-53 y EDH proteínas) que forman un complejo o un "parche", junto con una fusión de vesículas intracelulares o lisosomas en el sitio de la membrana de dañan4,9,10,11,12. Es importante tener en cuenta que estos modelos no son necesariamente excluyentes y pueden trabajar en conjunto para facilitar la reparación de la membrana. Fracaso para sellar correctamente el daño de la membrana celular está asociado con varios Estados de enfermedad, incluyendo la distrofia muscular (dysferlinopathy - incluyendo Miyoshi myopathy, miembro-rodea distrofia muscular tipo IIB y Miopatía distal con inicio tibial anterior) 13, miocardiopatía14y Chediak-Higashi síndrome (CHS)15.
Dado integridad de la membrana de célula apropiada y resellado juega un papel tan importante en la salud y la enfermedad, una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares subyacentes de la reparación de la membrana de la célula sería beneficiosa en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, es necesario poseer técnicas experimentales adecuadas para la cinética de monitorear y evaluar la capacidad de reparación de la membrana de la célula. Se han diseñado varios métodos en vitro para el modelado de reparación de la membrana. Una estrategia implica lesión mecánica, que puede facilitarse a través de células raspando con una cuchilla/navaja pipeta, quirúrgico o haciendo rodar los granos de cristal sobre el de las células16. Sin embargo, este tipo de lesión mecánica genera lesiones más grandes y crea un alto grado de variación en lesión de la célula, tanto dentro como entre las culturas.
Otro método de generar heridas de membrana es la ablación del laser por microscopia de dos fotones. En contraste con la microscopía confocal de láser tradicional que emplea la excitación de fotones individuales, el láser de dos fotones simultáneamente utiliza dos fotones de longitud de onda larga, bajo consumo de energía para facilitar la excitación de un electrón de alta energía17. Este proceso no lineal produce excitación exclusivamente en el plano focal y no a lo largo de la trayectoria de la luz entera17 (figura 1). Esto reduce la excitación volumen ayuda a minimizar el fotodaño imágenes de células vivas18,19. Los investigadores son capaces de generar lesiones precisa en la membrana de la célula y monitor membrana resellado en tiempo real mediante el uso de tintes fluorescentes y observar cambios en la intensidad de la fluorescencia como la membrana de la célula se rompe y luego reseals.
Este enfoque se ha utilizado repetidamente para estudiar Membrana hiriendo a in vitro y en vivo y en células múltiples tipos de20,21. Por ejemplo, la membrana reparar los defectos en fibroblastos y miotubos derivados de dysferlinopathy los pacientes fueron evaluados utilizando esta técnica22,23. También, solo fibras musculares aisladas de ratones fueron utilizadas para controlar la reparación parche formación13,24,25. También se pueden observar el movimiento de proteínas fluorescente etiquetados durante la reparación de la membrana en fibras musculares individuales9. Además, el proceso de reparación sarcolemales siguiendo dos fotones láser hiriendo en embriones de pez cebra puede observarse en tiempo real en vivo26.
En este artículo, describiremos una metodología para la evaluación dinámica de reparación membrana celular en fibroblastos con dos fotones láser herir, aunque esta metodología puede aplicarse a varios tipos de células con el fin de cuantificar la capacidad de cierre de la membrana del plasma en vitro. En este método, las células se incuban con FM4-64, cargada de un tinte lipofílico, células impermeables que rápidamente aparece como negativa se une a fosfolípidos dentro del citoplasma al entrar en la célula a través de la lesión de la membrana (figura 2&#38; 3). cuantificación de la fluorescencia del tinte adyacente a la lesión de membrana permite supervisar el tiempo que tarda para que la membrana de la célula sellar a sí mismo. Para ejemplificar la utilidad de este método, utilizamos fibroblastos pacientes dysferlinopathy transfectados con GFP conjugados completos dysferlin (DYSF) plásmidos para evaluar el rescate de la reparación de la membrana de la célula.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio recubiertos de colágeno de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Medios privados de suero</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Dye</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s Solución de sales</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Láser de dos fotones</td><td>coherente</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de reparación de membrana de la célula utilizando un microscopio de dos fotones láser

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerosos insultos fisiopatológicos pueden causar daño a las membranas celulares y, cuando está juntado con defectos naturales en la reparación de la membrana de la célula o integridad, pueden resultar en enfermedad. Comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes que rodean la reparación de la membrana de la célula es, por tanto, un objetivo importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para enfermedades asociadas a la membrana celular disfuncional dinámica. Muchos estudios in vitro e in vivo para entender el cierre de membrana de la célula en diversos contextos de la enfermedad utilizan la ablación del laser de dos fotones como un estándar para la determinación de los resultados funcionales después de tratamientos experimentales. En este ensayo, las membranas celulares son sometidas a heridas con un láser de dos fotones, que hace que la membrana de la célula a la ruptura y el colorante fluorescente para infiltrarse en la célula. La intensidad de fluorescencia dentro de la célula puede controlarse entonces para cuantificar la capacidad de la célula para sellar a sí mismo. Existen varios métodos alternativos para evaluar la respuesta de membrana de la célula a la lesión, así como gran variación en el láser de dos fotones hiriendo a enfoque sí mismo, por lo tanto, un modelo de célula herir unificada beneficioso serviría para disminuir el variación entre estas metodologías. En este artículo, describiremos un láser simple de dos fotones hiriendo a protocolo para la evaluación de membrana celular reparación en vitro en ambos sanos dysferlinopathy paciente fibroblastos y las células transfected con o sin un plásmido de cuerpo entero del dysferlin.

Fibroblastos humanos saludables, fibroblastos de pacientes no tratados dysferlinopathy y fibroblastos pacientes transfectados con un plásmido que contiene la secuencia completa del dysferlin fueron sometidos a dos fotones láser hiriendo a evaluar la capacidad de cierre de membrana en tiempo real. Las células de fibroblastos humanos sanos muestran bajos niveles de activación de la fluorescencia de FM 4-64 después de heridas de láser y fibroblastos de pacientes no tratados exhiben un alto g...

Herir la membrana de la célula a través de dos fotones láser es un método ampliamente utilizado para evaluar la capacidad mismo-resellado de la membrana y se puede aplicar a múltiples tipos de células. Aquí, describimos un protocolo en vitro en vivo imágenes de cierre de membrana en células de pacientes dysferlinopathy después de la ablación láser de dos fotones.

Ensayo de reparación de membrana de la célula utilizando un microscopio de dos fotones láser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la reparabilidad de la membrana plasmática en células de pacientes con distrofia muscular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la distrofia muscular, como cuál es la relación entre una mutación determinada y la cinética de resellado de la membrana. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación en tiempo real de la cinética de resellado de membranas en células vivas.Comience cultivando células de fibroblastos en un matraz T225 que contenga 40 mililitros de medio de crecimiento en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Cuando el cultivo alcance un 70 a 80% de confluencia, enjuague las células dos veces con 40 mililitros de PBS por lavado, seguido de la adición de cinco mililitros de tripsina al 0,05% durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con 40 mililitros de medio de crecimiento fresco y siembre dos mililitros de células a una concentración de 100.000 células por mililitro en placas de vidrio recubiertas de colágeno de 35 milímetros para una incubación nocturna a 37 grados Celsius y 5% de dióxido

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí descritos son protocolos que se utilizan para visualizar el proceso dinámico de la MG53 mediada por reparación de la membrana celular en todo el animal y en el nivel celular. Estos métodos se pueden aplicar para investigar la biología celular de volver a sellar la membrana plasmática y la medicina regenerativa.

Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

Este video describe la ablación de axones con láser de dos fotones en una larva de Drosophila melanogaster y un ejemplo de protocolo para inducir lesiones e imágenes del sitio de la lesión.

Lesión neuronal inducida por láser de dos fotones: un método para observar la degeneración y regeneración de los axones en larvas de Drosophila

Este video muestra un ensayo para estudiar la eficiencia de resellado de la membrana plasmática en células de mamíferos. Las células están expuestas a una toxina bacteriana formadora de poros, que forma poros en la membrana celular. En presencia de iones de calcio extracelulares, el poro provoca la entrada de calcio, induciendo eventos de resellado de la membrana. La eficiencia del resellado se evalúa utilizando un colorante de yoduro de propidio que se une al ADN, que solo ingresa a las...

Un ensayo in vitro basado en fluorescencia para medir la eficiencia de resellado de la membrana plasmática

Formación de imágenes en vivo de las células expuestas a la colorante lipófilo FM1-43 permite la determinación precisa de la cinética por el cual las toxinas formadoras de poros son retirados de la membrana plasmática. Este es un ensayo sensible que puede ser utilizado para evaluar las necesidades del Ca 2 +, esfingomielinasa y otros factores en la reparación de la membrana de plasma.

Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

El proceso de las células de curación heridas implica el tráfico de proteínas específicas y los compartimentos subcelulares al sitio de la lesión de la membrana celular. Este protocolo describe ensayos para controlar estos procesos.

Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

El método de punción termoplasmónica integra microscopía confocal, pinzas ópticas y nanopartículas de oro para estudiar las respuestas de las proteínas durante la reparación de la membrana plasmática en células y vesículas unilamelares gigantes. La técnica permite la punción rápida y localizada de la membrana, lo que permite la identificación de proteínas clave y sus funciones en la intrincada maquinaria de reparación de la membrana plasmática.

Un enfoque termoplasmónico para investigar la reparación de la membrana plasmática en células vivas y membranas modelo

Aprende a cuantificar la reparación de membrana plasmática en células de pacientes con distrofia muscular mediante ablación láser de dos fotones. Este protocolo permite la cuantificación en tiempo real de la cinética de resellado en células vivas.

Ensayo de reparación de membrana de la célula utilizando un microscopio de dos fotones láser

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