Ensayo de reparación de membrana de la célula utilizando un microscopio de dos fotones láser

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la reparabilidad de la membrana plasmática en células de pacientes con distrofia muscular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la distrofia muscular, como cuál es la relación entre una mutación determinada y la cinética de resellado de la membrana. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación en tiempo real de la cinética de resellado de membranas en células vivas.

Comience cultivando células de fibroblastos en un matraz T225 que contenga 40 mililitros de medio de crecimiento en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Cuando el cultivo alcance un 70 a 80% de confluencia, enjuague las células dos veces con 40 mililitros de PBS por lavado, seguido de la adición de cinco mililitros de tripsina al 0,05% durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con 40 mililitros de medio de crecimiento fresco y siembre dos mililitros de células a una concentración de 100.000 células por mililitro en placas de vidrio recubiertas de colágeno de 35 milímetros para una incubación nocturna a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Agregue 150 microlitros de medio privado de suero fresco a un tubo de 1,5 mililitros por cultivo de transfección. A continuación, añada tres microlitros de reactivo de transfección a cada tubo e incube los tubos durante al menos cinco minutos a temperatura ambiente. Mientras los tubos se incuban, agregue 175 microlitros de medio derivado del suero y 3,5 microgramos de ADN plasmídico de disferlina a un tubo adicional de 1,5 mililitros por placa.

A continuación, combine 150 microlitros de la solución de ADN plasmídico con 150 microlitros del reactivo de transfección en un nuevo tubo por placa para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, reemplace el medio de crecimiento con dos mililitros de medio derivado del suero. Al final de la incubación, distribuya uniformemente los 300 microlitros completos de solución de plásmido en cada placa e incube las placas durante 24 horas en la incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, reemplace el sobrenadante plásmido con medio de crecimiento fresco y devuelva las placas a la incubadora durante otras 24 horas. Para preparar las células para un ensayo de herida de dos fotones, enjuague los cultivos transfectados una vez con un mililitro de la solución de Tyrode. A continuación, añada un mililitro de solución fresca de Tyrode suplementada con un microlitro de colorante FM4-64 de 2,5 milimolares a las células.

A continuación, utilizando un microscopio confocal invertido, cree un objetivo de 0,2 por dos micras en el software del microscopio y coloque el objetivo en el borde de la membrana celular de modo que la línea objetivo se superponga y quede perpendicular a la membrana celular. Seleccione un láser de neón de helio de 543 nanómetros para excitar la señal de tinte FM y un láser de argón de 488 nanómetros para excitar la señal GFP, y establezca el rango de detección de 600 a 760 nanómetros y de 500 a 550 nanómetros respectivamente. A continuación, cree una serie temporal de cinco minutos de escaneos secuenciales de imágenes.

Para generar una lesión en la membrana, utilice un láser de dos fotones a 820 nanómetros a una potencia láser del 15% con 10 iteraciones para blanquear las células 25 segundos después del comienzo de la serie temporal. Para cuantificar la fluorescencia del colorante FM4-64, utilice el software para dibujar una región de interés de seis por seis micras y coloque la región de interés adyacente a la ubicación de la herida dentro de la celda. A continuación, reste el valor de fondo y divida el aumento neto por el valor de fluorescencia en el tiempo cero para calcular los valores de fluorescencia relativos para cada punto de tiempo.

Las células sanas de fibroblastos humanos muestran bajos niveles de activación de fluorescencia FM4-64 después de la herida con láser, mientras que los fibroblastos de pacientes no tratados exhiben un alto grado de intensidad de fluorescencia relativa después de la lesión. Las células de los pacientes que se transfectaron con plásmido de disferlina de longitud completa muestran una intensidad relativa de fluorescencia FM4-64 reducida en comparación con los controles de pacientes no tratados, pero similar a los valores de fluorescencia observados en los controles sanos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las células morirán lentamente en la solución tampón, así que trabaje rápidamente y cambie a células frescas a intervalos regulares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo regenerar las lesiones de la membrana utilizando un microscopio de dos fotones y cómo cuantificar el resellado de la membrana en tiempo real.