Name: Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a generar bibliotecas Hi-C de alta resolución desde embriones tempranos de Drosophila melanogaster. Este método permite estudiar la arquitectura de la cromatina y su influencia en la expresión génica durante el desarrollo.

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Esta investigación fue financiada por la sociedad Max Planck. C.B.H. fue apoyado por una beca de la International Max Planck Research School – biomedicina Molecular. Agradecemos Shelby Blythe y Eric Wieschaus amablemente ofreciendo la línea de eGFP-PCNA Drosophila melanogaster.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado aquí es muy eficaz en la generación de mapas de alta calidad de la arquitectura de la cromatina en los primeros embriones de Drosophila . En comparación con un anterior protocolo34, el enfoque descrito aquí utiliza una actualizada en situ Hi-C procedimiento5, resultando en el proceso más rápido, mayor resolución y menos uso de reactivo. Se espera que el procedimiento general, incluido el protocolo en situ Hi-C para trabajar en una amplia gama de escenarios y sistemas experimentales además de Drosophila. Puesto que el protocolo tiene un requisito de entrada de bajo, también podría utilizarse en poblaciones aisladas de la célula. En Drosophila, cuando utiliza el protocolo de embriones fuera del rango se describe aquí, algunos parámetros, en particular la fijación del material, que tenga que ajustarse. Puesto que más embriones desarrollan una cutícula muy impermeable, elevando la concentración de formaldehído y prolongar la fijación pueden ser apropiados. Para la recogida de embriones en etapas que no sean de ciclo nuclear 14, los tiempos de incubación de los embriones a 25 ° C en el paso 1.4 deben ajustarse como se indica a continuación: ciclo nuclear 12, minuto 70; ciclo nuclear 13, 90 min; hpf de 3 – 4, 3:30 h.
Durante las divisiones de la 13 división (etapa 1-4), la densidad de núcleos se duplica aproximadamente con cada división. Los núcleos se pueden identificar fácilmente por su fluorescencia de GFP brillante. Durante la mitosis, eGFP-PCNA no se encuentra en el núcleo, y su señal se dispersa en todo el embrión. Esta característica hace identificar los embriones que se someten a una posible división de hendidura sincrónica. Para estudiar la conformación de la cromatina, estos embriones mitóticos generalmente no son deseables, puesto que la organización mitotic de la cromatina es drásticamente diferente de la interfase organización35. Es posible adaptar el protocolo para seleccionar específicamente los embriones sometidos a una división mitótica sincrónica. En este caso, deben conservarse embriones sólo con distribución dispersa, no nuclear de eGFP-PCNA y todos los otros embriones deben ser descartados. Puesto que no puede determinarse la densidad nuclear, se deben emplear métodos alternativos a los embriones de etapa por su morfología en microscopía de luz transmitida. Presencia de células del polo y los núcleos en la periferia del embrión indican que el embrión ha completado por lo menos nuclear ciclo 9, mientras que cellularization visible en la periferia indica ciclo nuclear 1412.
Experimentos-C se pueden realizar con éxito usando una variedad de enzimas de restricción5. Enfoques actuales suelen utilizan enzimas que reconocen o una secuencia de base 4, como MboI, o un sitio de reconocimiento de la base de 6, como HindIII. La ventaja de base de 4 cortadores sobre base de 6 cortadores es que ofrecen mayor resolución posible, dada suficiente profundidad de la secuencia y una cobertura más uniforme de sitios de restricción en todo el genoma. Hay clara ventaja en la elección de una base de 4 cortador sobre otros5,23,36,37. Las dos enzimas más comúnmente utilizadas, MboI y DpnII, ambos reconocen el mismo sitio de reconocimiento GATC. DpnII es menos sensible a la metilación CpG, que es motivo de ninguna preocupación en Drosophila. El protocolo presentado aquí puede también completarse con éxito usando DpnII como una enzima de restricción. En la sección 4.2. enzima de la restricción y el tampón tienen que ajustarse para compatibilidad de DpnII, según las recomendaciones del fabricante.
Si el tamaño del fragmento de la biblioteca de la secuencia se desvía significativamente de la gama que se muestra en la figura 2A, formación de grupos durante la secuencia puede ser menos eficiente o fracasan completamente. En este caso, debe revisarse la distribución de tamaño después de la esquila y parámetros de corte ajustado en consecuencia. Picos en la distribución de fragmentos de ADN de muy pequeño (< 100 bp) o muy grandes (> 1.000 bp) tamaños indica problemas con selección de tamaño, como llevar encima de granos o de sobrenadante que deben descartarse. A menudo estas bibliotecas con picos pequeños en estos tamaños no deseados, como la foto, son todavía secuenciaron con éxito con solamente una disminución menor en clustering eficiencia.
Altas tasas de duplicación de PCR deben evitarse ya que esto reduce drásticamente el número de lecturas de secuencia utilizable. El índice de PCR duplicados está directamente relacionada con la cantidad de material de entrada. Por lo tanto generalmente con el ingreso de más alivia problemas con la duplicación de la polimerización en cadena.
Números más altos de lectura filtrada debido a leer orientación ()figura 2B) indican la digestión insuficiente, que puede ser el resultado de utilizar muy poca enzima material demasiado entrada y homogenización incompleta de los embriones.

Captura de la conformación de la cromatina (3C) ha surgido como un método excepcionalmente útil para el estudio de la topología de la cromatina en el núcleo1. La variante de 3C Hi-C permite medir las frecuencias de contacto de todas las interacciones de cromatina que se producen en el núcleo en un solo experimento2. Aplicación de Hi-C ha jugado un papel importante en el descubrimiento y caracterización de muchos principios fundamentales de organización de la cromatina, como TADs, compartimentos y lazos3,4,5.
Estudios de arquitectura de la cromatina en el contexto de las transiciones del desarrollo y diferenciación de la célula se utilizan cada vez más para desentrañar los mecanismos de regulación génica durante estos procesos6,7,8, 9. Uno de los organismos modelo de gran interés es la Drosophila melanogaster, cuyo desarrollo y genoma están bien caracterizadas. Sin embargo, pocos estudios que investigan la arquitectura de la cromatina en Drosophila fuera en vitro el cultivo de tejidos han sido ajustes realizaron10,11. En embriones de 16-18 h. post fertilización, TADs y compartimientos de estructuras similares en los mamíferos fueron identificados10, que plantea la cuestión de qué papel juegan en la regulación de los genes en el embrión de Drosophila desarrollo. Especialmente en las primeras etapas de desarrollo, antes de la gastrulación, tales estudios son un desafío técnico. Antes de la gastrulación, Drosophila embriones pasan por 13 divisiones nucleares sincrónicas que proceden a un ritmo extremadamente rápido de 8 a 60 min por ciclo de12,13. Además, la falta de características visuales para distinguir las diferentes etapas hacen difícil obtener material de embrión bien escenificada en cantidades suficientes.
Para desarrollar un protocolo que permite el estudio de arquitectura de la cromatina en el desarrollo temprano de la Drosophila en resolución del ciclo nuclear, se combinaron dos técnicas existentes: en situ Hi-C, que permite la generación de alta resolución de todo contacto mapa de genoma5y puesta en escena embrión utilizando una línea transgénica de Drosophila expresaban eGFP-PCNA transgene13,14. Este transgén se localiza en el núcleo durante la interfase y se dispersa en el blastoderm sincitial durante la mitosis. Usando esta propiedad, es posible distinguir fácilmente distintas etapas por su densidad nuclear y mitóticos embriones por la dispersión de la señal de la GFP.
En conjunto, estas técnicas permiten estudiar la estructura tridimensional de la cromatina en alta resolución de tan sólo 20 embriones de Drosophila . Este protocolo incluye las instrucciones para la recolección y clasificación de embriones de Drosophila para obtener poblaciones de embriones de un ciclo único de división nuclear. Además describe cómo los embriones obtenidos se utilizan para llevar a cabo en situ Hi-C. El resultado final es una biblioteca de nucleótido adecuada para secuenciación de máquinas de secuenciación de próxima generación. La Lee de la secuencia resultante se puede procesar luego en cromatina detallados mapas de interacción que cubren el genoma completo de Drosophila .

<table><tbody><tr><td>Biotina-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524016</td><td></td></tr><tr><td>MboI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0147L</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa I Fragmento de Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0012</td><td>T4 T4 ADN Ligasa T4 Tampón incluido</td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>AppliChem</td><td>A4392</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores completos de la proteasa ultra libres de EDTA</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina&nbsp;( 1)El adaptador</td> de secuenciación <td>E7335</td> <td>de New England Biolabs</td><td>, el cebador de PCR directo (no indexado) y el cebador de PCR inverso (indexado) y la enzima USER utilizados en la sección de preparación de la biblioteca son componentes de este kit</td></tr><tr><td>El kit de preparación de la biblioteca NEBNext Ultra II</td> DNA Library Mix de <td>New England Biolabs</td><td>E7645</td>, <td>el tampón de reacción de preparación final, el potenciador de la ligadura, la mezcla maestra de ligadura y la mezcla maestra de polimerasa utilizados en la sección de preparación de la biblioteca son componentes de este kit</td></tr><tr><td>Covaris S2 AFA System</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108051</td><td></td></tr><tr><td>Falcon cell strainer 100 &micro; m</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Cestas de recogida de embriones</td></tr><tr><td>37% formaldehído</td><td>VWR</td><td>437536C</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>AppliChem</td><td>122062.1612</td><td></td></tr><tr><td>M165 FC Microscopio estereoscópico fluorescente</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC Cámara DFC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro mortero</td> metálico <td>Carl Roth</td><td>P985.1</td><td>Se utiliza para lisar embriones en paso 4.1.4</td></tr><tr><td>ARNasa A</td><td>AppliChem</td><td>A3832,0050</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65002</td><td>Perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina Perlas</td></tr><tr><td>Ampure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorímetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>moscas eGFP-PCNA</td><td>Regalo de S. Blythe y E. Wieschaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio 13%</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris pH 8,0 (1 M) para biología molecular</td><td>AppliChem</td><td>A4577</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Greiner</td><td>Bio-One</td><td></td> 616201 <td></td></tr><tr><td>SDS para biología molecular</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón</td> <td>CutSmartNew England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Tampón enzimático de restricción</td></tr><tr><td>Mezcla de nucleótidos de PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814362001</td><td>dCTP, dGTP, dTTP BSA sin modificar</td></tr>, grado <tr>de<td>biología molecular</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M solución para biología molecular</td><td>AppliChem</td><td>A4892</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio 3 M pH 5.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Soporte magnético</td></tr><tr><td>Intelli-Mixer RM-2L</td><td>Omnilab</td><td>5729802</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5384000012 Mixer</td></tr><tr><td>Jaulas de recolección de embriones pequeños</td><td>Flystuff.com</td><td>59-100 Jaula de recolección de</td><td>huevos</td></tr><tr><td>Centrífuga 5424&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>tiras de tubo PCR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673275</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td>T4 T4 Tampón de ADN polimerasa</td></tr></tbody></table>

generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de drosophila

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigar la arquitectura tridimensional de la cromatina ofrece una visión inestimable de los mecanismos de regulación génica. Aquí, describimos un protocolo para realizar la cromatina conformación captura técnica en situ Hi-C en las poblaciones de embriones de Drosophila melanogaster en escena. El resultado es una biblioteca de secuenciación que permite el mapeo de todas las interacciones de cromatina que se producen en el núcleo en un solo experimento. Clasificación de embriones se realiza manualmente utilizando un microscopio estéreo fluorescente y una línea de mosca transgénica que contiene un marcador nuclear. Usando esta técnica, las poblaciones de embrión de cada ciclo de división nuclear y con el estado del ciclo celular definida, puede obtenerse con una pureza muy alta. El protocolo también se puede adaptar a ordenar más embriones más allá de la gastrulación. Embriones clasificados se utilizan como entradas para en situ Hi-C. Todos los experimentos, incluyendo la preparación de la biblioteca, la secuencia pueden realizarse en cinco días. El protocolo tiene bajos requisitos de entrada y trabaja confiablemente usando 20 embriones en fase blastoderm como material de entrada. El resultado final es una biblioteca de secuenciación para la siguiente secuencia de generación. Después de la secuencia, los datos pueden procesarse en mapas de interacción genoma cromatina que pueden analizarse utilizando una amplia gama de herramientas disponibles para obtener información acerca de asociar topológico estructura de dominios (TAD), bucles de cromatina y cromatina compartimientos durante el desarrollo de Drosophila .

Ordenadas poblaciones de embriones en el ciclo nuclear, 12, 13 y 14 (correspondiente a la 1:30, 1:45 y 2:10 horas post fecundación, respectivamente12) y fertilización post de 3 – 4 h (hpf) fueron obtenidos según los procedimientos descritos en el protocolo. Por tomar fotografías de la señal de eGFP-PCNA de cada lote de embriones ordenados, es posible documentar el estado precisa de la etapa y el ciclo celular de cada embrión individual que se utiliza en experimentos posteriores. Imágenes de ejemplo de embriones de poblaciones ordenadas se muestran en la figura 1B-E. La salida del protocolo en situ Hi-C es una biblioteca de nucleótido lista para ser ordenados en máquinas de secuenciación de próxima generación. Para ello, una concentración final de la biblioteca de al menos 2-4 nM es generalmente necesaria. Utilizar las cantidades recomendadas de material de entrada, esta concentración es confiablemente alcanzado (tabla 1).
La distribución del tamaño esperado de fragmentos de ADN después de selección de tamaño entre 300 – 600 bp, con un máximo de alrededor de 500 bp ()figura 2A), dependiendo el corte exacto y parámetros de selección de tamaño. Secuenciación, se recomiendan extremo apareado lecturas de al menos 75 longitud bp para reducir al mínimo el número de fragmentos de restricción no asignable en el genoma. Mapas de alta resolución con tamaño de cubo de 1 – 2 kb pueden obtenerse lecturas 400 millones. Recomendamos secuenciar múltiples repeticiones biológicas a una profundidad menor de 150 millones cada uno, en lugar de secuenciar una sola repetición en profundidad muy alta Lee. Esto permite la evaluación de la variación biológica y conduce a un número inferior de desechados Lee debido a duplicaciones de PCR. Para la representación visual, las repeticiones pueden combinarse. Antes de comprometerse a secuenciar una muestra en profundidad, se recomienda ejecutar muestras usando secuencia superficial (unos pocos millones lecturas por muestra) para determinar parámetros de calidad de la biblioteca básica como en la figura 2B.
Análisis de datos Hi-C requiere considerable experiencia computacional de recursos y la bioinformática. Como una descripción áspera, lecturas emparejadas se asignan independientemente para el genoma de referencia, los alineamientos resultantes se filtran por la calidad y orientación, luego una matriz de contactos a nivel de resolución o fragmento bin dada puede ser generada de la filtrada alineaciones. La matriz de contacto es la base para todos más abajo análisis explorar TADs, bucles y compartimientos. Para el análisis inicial de la Lee de la secuencia, existen varias tuberías de Bioinformática que permiten la transformación de la materia prima lee en contacto matrices sin mucho conocimiento especializado bioinformática18,19, 20,21,22,23. Como análisis adicional depende en gran medida la cuestión biológica exacta bajo estudio y podría requerir experiencia en programación y scripting en Python o en R. Sin embargo, varias herramientas y algoritmos para llamar TADs están disponibles5,24,25,26,27,28, así como software para analizar y explorar los datos Hi-C en el navegador web y aplicaciones de escritorio independientes29,30,31,32.
Una vez procesada, la calidad de la biblioteca puede ser determinada utilizando diferentes métricas (figura 2B). En primer lugar, la tasa de duplicados de la polimerización en cadena, que es el número de secuenciadas leerlas pares derivados de la misma molécula original, debe ser tan baja como sea posible limitar la cantidad de Lee de la secuencia perdida. Sin embargo, incluso las bibliotecas con &gt; 40% duplicación de PCR se puede procesar en mapas de contacto de alta calidad si se filtran los duplicados. En segundo lugar, la tasa de filtrado Lee debido a su orientación, como se describe en4, constantemente debe inferior al 10% de pares alineados de leer.
Durante el desarrollo pre-gastrular de Drosophila entre ciclo nuclear 12 y 14, la arquitectura nuclear es drásticamente remodeladas33 (figura 3). En el ciclo nuclear 12, TADs pocos son detectados, y la distribución general de contactos es muy suave sin muchas características discernibles. Esto es dramáticamente cambió en el ciclo nuclear 13 y 14, cuando TADs son cada vez más prominentes y contactos a larga distancia se agotan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> Figura 1: cuadros representativos de embriones de eGFP-PCNA durante clasificación. Señal de eGFP-PCNA (A) de una población base de embriones después de que colección de 60 min y 2 h de incubación a 25 ° C (B-E) ejemplos de embriones de poblaciones clasificadas en el ciclo nuclear 12 (B), nuclear ciclo 13 (C), (14) ciclo nuclear D) y de embriones que experimentan mitosis síncrono (E). Barras de escala = 200 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> Figura 2: Ejemplos de en situ Hi-C métricas de calidad de biblioteca. Rastros del equipo Bioanalyzer (A) que muestra la distribución de tamaños de fragmento de ADN de una éxito Hi-C biblioteca (1, arriba) y de una biblioteca que muestra un pico de fragmentos que son demasiado grandes para la secuencia (biblioteca 2, abajo). Biblioteca 2 fue secuenciado con éxito, pero incluso grandes cantidades de fragmentos de ADN no deseados pueden conducir a la secuencia de la disminución de rendimientos. (B) filtrado estadísticas de dos bibliotecas de Hi-C: muestra es el número de pares de leer alineados que están excluidos del análisis debido a leer orientación y distancia (interior, exterior)4 o duplicación de PCR (duplicada). En cada barra, el número de lecturas, pasando por el filtro (restante) y falla (filtrado) se traza. Además, el porcentaje de lecturas pasa el filtro se muestra como texto. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> Figura 3: interacción-C mapas de embriones escenificados. Mapas de interacción-C son agrupadas en 10 kb resolución y equilibradas como se describe antes33. Es una región en el cromosoma 2 L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Biblioteca</td>
			<td>Etapa</td>
			<td>Número de embriones</td>
			<td>Cantidad de ADN antes de corte (ng)</td>
			<td>Ciclos PCR</td>
			<td>Concentración final de la biblioteca (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>ciclo nuclear 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>ciclo nuclear 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>ciclo nuclear 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>ciclo nuclear 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>ciclo nuclear 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>ciclo nuclear 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>ciclo nuclear 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>ciclo nuclear 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>ciclo nuclear 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: lista de las estadísticas de biblioteca de secuencias representativas. Para cada biblioteca en la lista, el número de embriones que fueron utilizados para su generación, la cantidad de ADN total antes de telecine de biotina y de corte medido por Qubit, el número de PCR ciclos usados para la amplificación y la concentración final de la biblioteca de la secuencia después de la purificación y el tamaño de la selección son los indicados.

Este trabajo describe un protocolo para la generación de alta resolución en situ Hi-C bibliotecas de bien escenifica la gastrulación Drosophila melanogaster embriones.

Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la arquitectura de la cromatina, como cómo la estructura 3D de la cromatina puede influir en la expresión y el desarrollo del gen. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una visión de alta resolución de la arquitectura de la cromatina y los embriones de mosca escenificadas con precisión. Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización y el desarrollo de la cromatina, también se pueden utilizar líneas existentes de bibliotecas de moscas transgénicas para probar su efecto en la organización de la cromatina.Para comenzar el protocolo, ajuste el volumen total de embriones previamente recogidos a dos mililitros con PBST. Añadir seis mililitros de heptano y 100 microlitros de 37% formaldehído en agua. Después de añadir formaldehído, agita vigorosamente el tubo hacia arriba y hacia abajo durante un minuto.La fase acuosa y orgánica se combinará para formar una consistencia similar al champú. Agitar la mezcla en un mezclador rotativo durante 10 minutos. Centrifugar el tubo a 500 veces g durante un minuto a temperatura ambiente para recoger embriones en la parte inferior del tubo.Aspirar todo el líquido similar al champú y desecharlo, teniendo cuidado de no aspirar ningún embrión. 15 minutos después de la adición de formaldehído, resuspender los embriones en cinco mililitros de PBST con 125 glicina milimétrica. Agitar los embriones hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante un minuto.Después de centrifugar, aspirar el sobrenadante. Usando una pipeta de 1.000 microlitros, transfiera un lote de 100 embriones a un pequeño recipiente de vidrio adecuado para la clasificación, preferiblemente sobre un fondo oscuro y colóquelo sobre hielo. Ordene los embriones por densidad nuclear y estado del ciclo celular utilizando una aguja o una punta de jeringa.Elimine todos los embriones mitóticos reconocibles por su distribución dispersa y no nuclear de PCNA EGFP y embriones que muestren parcialmente una señal de PFG no nuclear. Para ayudar a la clasificación, alinee los embriones de referencia en los ciclos nucleares 12, 13 y 14 en cada lote para que coincidan con los embriones con uno de los embriones de referencia. Pipetee los embriones deseados utilizando una pipeta de 1.000 microlitros.Transfieralos a un tubo fresco y colóquelos en hielo. Continúe hasta que se clasifen suficientes embriones para el experimento planeado. Gire los tubos brevemente a 100 g a temperatura ambiente.Retire el sobrenadante y asegúrese de que los embriones estén lo más secos posible para la congelación. Congelar los embriones al sumergir los tubos en nitrógeno líquido y almacenar a menos 80 grados Celsius. Coloque los tubos con embriones congelados sobre hielo.Resuspender los embriones en 500 microlitros de tampón de lelisis helada. Espere un minuto para permitir que el embrión se asiente en la parte inferior del tubo. A continuación, moler los embriones con un micro peste de metal pre-enfriado sobre hielo que está diseñado para encajar firmemente un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Para evitar agitar los embriones, inserte el pestillo lentamente hasta que toque la parte inferior del tubo. Empuje hacia abajo y luego muele girando el pestle dos veces en ambas direcciones. Levante el pestle muy ligeramente.Empuje hacia la parte inferior del tubo de nuevo y repita el procedimiento de molienda 10 veces o hasta que los embriones estén completamente separados. La solución debe ser homogénea y no deben permanecer grandes trozos residuales de embriones. Incubar la suspensión homogeneizada sobre hielo durante 15 minutos.Gire a 1.000 veces g cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet resuspendiendo en 500 microlitros de tólizar de lysis fría de hielo y pipeteando arriba y abajo. Después de otro giro, deseche el sobrenadante.Resuspender el pellet lavado en 100 microlitros de 0.5%Dodecyl Sulfate o SDS. A continuación, permeabilizar los núcleos incubando la muestra durante 10 minutos a 65 grados Celsius en un bloque de calentamiento. Añadir 50 microlitros de 10%Triton X100 y 120 microlitros de agua.Deslice el tubo para mezclar el contenido e incubar el tubo a 37 grados Centígrados durante 15 minutos en un bloque de calor. Añadir 25 microlitros de tampón de enzimas de restricción 10X y 20 unidades de cinco unidades por microlitor MBO1. Deslice el tubo para mezclar el contenido e incubar el tubo en un bloque de calor para digerir el ADN.Añade otras 20 unidades de MBO1. Continúe la incubación durante 90 minutos. Después de la segunda incubación de 90 minutos, incubar la muestra a 62 grados centígrados durante 20 minutos para inactivar el MBO1.A continuación, añada 18 microlitros de 0,4 biotina miliamperosas 14-dATP, 2,25 microlitros de una mezcla dCTP-dGTP-dTTP de 3,3 millimolares sin modificar, y ocho microlitros de cinco unidades por microlitro de ADN polimerasa I fragmento De Klenow. Deslice el tubo para mezclar el contenido e incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 90 minutos. A continuación, añadir 657 microlitros de agua, 120 microlitros de 10X T4 DNA ligasa buffer, 100 microlitros de 10%Triton X100, seis microlitros de 20 miligramos por mililitro de albúmina sérica bovina, y finalmente cinco microlitros de cinco unidades por microlitro T4 ligasa de ADN.A continuación, gire el tubo suavemente a 20 RPM a temperatura ambiente durante dos horas. Añadir otros cinco microlitros de cinco unidades por microlitro T4 ligase de ADN. Continúe girando durante dos horas más, luego gire hacia abajo los núcleos a 2, 500 veces g durante cinco minutos.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en 500 microlitros de tampón de extracción y añadir 20 microlitros de 20 miligramos por mililitro proteinasa K.Flick el tubo e incubar el tubo para digerir la proteína. Añadir 130 microlitros de cinco molares de cloruro sódico e incubar durante la noche para des-crosslink.Al día siguiente, pipetear la muestra en un nuevo tubo de dos mililitros con características bajas de unión al ADN. Añadir 0,1X volumen de tres molares de acetato de sodio y dos microlitros de 15 miligramos por mililitro GlycoBlue. Añadir 1,6 volúmenes de etanol absoluto puro e invertir el contenido, luego incubar la muestra a menos 80 grados Celsius durante 15 minutos.Después de la incubación, centrifugar el contenido. Localice el pellet de ADN que sólo puede ser detectado por el GlycoBlue. Retire el sobrenadante cuidadosamente, moviendo la punta de la pipeta en el tubo a lo largo de la pared opuesta del pellet de ADN.Lavar el pellet con 800 microlitros de 70% etanol. Mezcle la muestra invirtiendo y centrifugarlo a 20.000 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Retire las gotas restantes durante este paso y los siguientes lavados empujándolas fuera de los tubos con una punta P10, luego abra la tapa para secar al aire durante un máximo de cinco minutos.Una vez que no quede líquido, agregue 50 microlitros de cloruro de tris de 10 milimolares. Pipetear repetidamente la solución sobre el área donde se localizó el pellet para solubilizar el ADN. Añadir un microlitro de 20 miligramos por mililitro RNase A.Mix moviendo el tubo.Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos para digerir el ARN. Por último, guarde la muestra en el congelador o en el refrigerador hasta la preparación de la biblioteca. Las imágenes de la señal EGFP PCNA de cada lote de embriones clasificados revelan estados precisos de etapa y ciclo celular de cada embrión para experimentos posteriores.Las trazas de bioanalizador muestran que la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN después de la selección del tamaño está entre 300 y 700 pares base con un máximo de alrededor de 450 pares base. Los mapas de interacción Hi-C muestran que en el ciclo nuclear 12, se detectan pocos dominios o TAD topológicamente asociados que cambian drásticamente en los ciclos nucleares 13 y 14 cuando los TAC son cada vez más prominentes e inespecíficos contactos de largo alcance se agotan. Al intentar este procedimiento, es importante recordar lavar las cuentas a fondo y no prolongar los tiempos de incubación innecesariamente, especialmente a altas temperaturas, ya que esto puede conducir a bibliotecas Hi-C de baja calidad.Esta técnica que combina la puesta en escena precisa y el mapeo de confirmación de cromatina de alta resolución allanaron el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran el papel de la organización de la cromatina tridimensional en un entorno de desarrollo in vivo.

generation-genome-wide-chromatin-conformation-capture-libraries-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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