Name: Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprende ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y plaquetas adherentes. Este método económico y versátil permite estudiar mecanismos de adhesión celular en condiciones de flujo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a los Drs. Martín M. Schmitt y Fraemohs línea. Este trabajo fue financiado por la fundación holandesa para la investigación científica (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Fundación para la investigación de la transfusión de sangre (LSBR Nr. 1638) y Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) otorgado a R.R.K.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la ética médica y Animal ético tableros de la Universidad de Maastricht.
1. flujo basada en el ensayo con células humanas
<ol><li>
Aislamiento de las plaquetas de sangre humana
	<ol>
<li>Extraer la sangre venosa en anticoagulante de citrato (3.2%).</li>
		<li>Añadir el 15/1 volumen de ácido citrato dextrosa (ACD: citrato trisódico 80 mM, 52 mM cítrico y 183 mM de glucosa) a la sangre.</li>
		<li>Centrifugue a 350 g de x sin freno durante 15 minutos obtener plasma rico en plaquetas (PRP).</li>
		<li>Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mL y añadir 1/20 volumen de ACD.</li>
		<li>Centrifugue a 1.110 g sin freno durante 15 minutos obtener plasma pobre en plaquetas (PPP).</li>
		<li>Deseche el sobrenadante. Corte el extremo de la punta de la pipeta (1000 P), lo que amplia del alesaje, que SIDA en la prevención de la activación plaquetaria y cuidadosamente suspender el sedimento de la plaqueta en el mismo volumen que el PRP en plaquetas de tampón pH 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM de MgCl2, seroalbúmina bovina al 0.1% y 0.1% de glucosa). Añadir el 20/1 volumen de ACD y mezclar suavemente.</li>
		<li>De la pelotilla de las plaquetas a 1.110 g sin freno durante 15 minutos.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y cuidadosamente suspender las plaquetas como por encima de 1 mL de tampón de plaquetas (pH 7.5).</li>
		<li>Medir la concentración de plaquetas en una dilución 1/10 con un analizador de la hematología automatizada.</li>
		<li>Ajuste el volumen con buffer de plaquetas (pH 7.5) para conseguir una cuenta de 2 x 107/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento de células polimorfonucleares de la sangre humana (adaptado de Brinkmann et al. 11 )
	<ol>
<li>Sorteo 24 mL de sangre en heparina (10 U/mL) como anticoagulante.</li>
		<li>Añadir 6 mL de medio de diatrizoato de sodio polysucrose de densidad de 1,077 g/mL (véase Tabla de materiales) a un tubo cónico de 15 mL y cuidadosamente capa 5-6 mL sangre en la parte superior.</li>
		<li>Centrifugar 20 min a 800 g de x sin freno.</li>
		<li>Aspirar y descartar la capa superior clara amarillenta y transferir la fase rojiza inferior que contiene granulocitos en frescos tubos cónicos de 15 mL. Lavar las células mediante la adición de PBS que contenía 2 mM EDTA hasta un volumen final de 14 mL y centrifugar 10 min a 300 x g sin freno.</li>
		<li>Mientras tanto, preparar un medio de gradiente de densidad (e.g., percoll, véase Tabla de materiales) solución de trabajo mezclando medio gradiente de densidad de 18 mL con 2 mL 10 x solución stock de PBS. Diluir esta solución de trabajo con PBS (1 x) para obtener 4,25 mL cada uno de 85%, 80%, 75%, 70% y 65% soluciones medio degradadas.</li>
		<li>Preparar 2 tubos cónicos con el gradiente de densidad por capas de 2 mL de cada medio porcentaje encima de la otra. Comenzar con la concentración más alta y continuar en orden decreciente. Marque las capas en el tubo con un marcador a prueba de agua.</li>
		<li>Cuidadosamente 2 mL de las suspensiones de células en cada uno de los dos gradientes preparados de la capa.</li>
		<li>Centrifugar por 20 min a 800 x g sin freno en una centrifugadora cuidadosamente equilibrada.</li>
		<li>Después de la centrifugación, retirar la capa superior y más del 65% (primer anillo) la capa con las PBMCs y recoger en nuevos tubos blanco restante interfases hasta el 85% de la capa (segundo anillo, PMN).</li>
		<li>Lavar las células rellenando los tubos con PBS 2 mM EDTA y centrifugar 10 min a 300 x g sin freno.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y suspender las células sedimentadas (normalmente ≥ 95% son PMN) en 1 mL de tampón de Hank (pH 7.45), que contiene 10 mM Hepes y 0.2% de albúmina humana (tampón de ensayo).</li>
		<li>Contar las células usando un hemocitómetro y suspender las células en 1 x 106/ml.</li>
		<li>Continuar con perfusión de leucocitos (paso 3.3) y etiquetado fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de plaquetas adherentes - y monocapas de células vasculares
	<ol>
<li>
PREPARACION de cultura celular (células cultivadas)
		<ol>
<li>La capa de los platos de cultivo celular de 35 mm con 1 mL de colágeno de la cola de rata diluido (30 μg/mL diluido en PBS filtra sobre un filtro de 0.2 μm).</li>
			<li>Incubar durante 30 min a 37 ° C, eliminar la solución de colágeno y lave el plato una vez con PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Cultura de las células vasculares en platos de la cultura
		<ol>
<li>Separar primaria (p. ej., HUVEC, HAoEC, HAoSMC) o inmortalizadas las células vasculares (p. ej., EA. Hy926, SVEC) a confluencia en un matraz T75 con 1,5 mL de solución de la separación de la célula (e.g., accutase). Agregar 4,5 mL de medio de crecimiento apropiado para neutralizar la solución de la separación de células y determinar la concentración de células con un celular con cámara. Suspender las células en 0,5 x 105 células/mL en el medio de crecimiento apropiado (p. ej., medio de cultivo de células endoteliales completo).</li>
			<li>Añadir 2 mL de la suspensión celular en cada plato de 35 mm. La cultura de las células en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO2 hasta confluencia (de 24 a 48 h, dependiendo del tipo de célula).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Cubreobjetos de vidrio preparación (plaquetas adherentes)
		<ol>
<li>Sumerja el cubreobjetos de vidrio una vez en HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).</li>
			<li>Enjuague el cubreobjetos 2 veces en agua ultrapura.</li>
			<li>Seque el cubreobjetos bajo N2.</li>
			<li>La capa el cubreobjetos de vidrio con 100 μl, según la posición del canal de la cámara de perfusión de colágeno de cola de rata diluido tipo I (30 μg/mL diluido en PBS filtra sobre un filtro de 0.2 μm).</li>
			<li>Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, eliminar la solución de colágeno y lavar lo cubreobjetos 3 x con PBS.</li>
			<li>Bloque el cubreobjetos de colágeno recubierta con BSA 1% en HEPES de 0.5 h a TA.</li>
			<li>Lave y seque el cubreobjetos y montarlo en la cámara de perfusión. Aislar las plaquetas de humana o sangre de ratón como se indica en el paso 1.1 o 2.1, respectivamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inmovilización de las plaquetas
		<ol>
<li>Añadir 70 μl de una suspensión de plaquetas/ml de 2 x 107por canal e incubar durante 1,5 h a 37 ° C y 5% CO2.</li>
			<li>Vuelva a colocar cuidadosamente las plaquetas no adherente con solución de bloqueo (5% de BSA en HEPES) durante al menos 30 min a TA. continuar con etiquetado fluorescente y perfusión de los leucocitos (paso 3.3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Estimulación de la monocapa de células vasculares
		<ol>
<li>Estimular las células vasculares mediante la sustitución de los medios de comunicación con medio fresco que contiene 10 ng/mL factor de necrosis tumoral α (TNFα) durante 4 h a 37 ° C y 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. flujo basada en ensayo con células murinas
<ol><li>
Aislamiento de las plaquetas de la sangre de ratón
	<ol>
<li>Drenaje de sangre por punción cardiaca usando una aguja 21 G (~ 1 mL) de anestesia (ketamina 80 mg/kg y medetomidina 0,3 mg/kg) de 6 – 8 semanas-ratones viejos (C57Bl/6) en (3.2%) citrato como anticoagulante.</li>
		<li>Añadir el 1/6 volumen de ACD.</li>
		<li>Centrífuga x 220 g, freno medio durante 5 minutos obtener plasma rico en plaquetas (PRP).</li>
		<li>Transferir el sobrenadante (~ 600 μL) más 1/3 de células de sangre rojas a un tubo nuevo</li>
		<li>Centrifugue a 95 g de x sin freno durante 6 minutos.</li>
		<li>Transferir el sobrenadante (PRP) y medir la concentración de plaquetas en una dilución 1/10 en buffer de Tyrode (buffer de TH: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM de MgCl2, seroalbúmina bovina al 0.1% y 0.1% glucosa) con un analizador de la hematología automatizada.</li>
		<li>Lavar las plaquetas mediante la adición de 1/25 volumen de ACD + 0.1 apyrase U/mL y centrifugar a 2.870 g, freno media durante 2 minutos.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y añadir 600 μl de tampón de TH, 1/10 volumen de ACD y 0.1 apyrase U/mL. Cortar la punta de la pipeta (1000 P), lo que amplia alesaje, que ayuda en la prevención de la activación plaquetaria y suspender suavemente el sedimento.</li>
		<li>Centrifugar a 2.870 g, freno medio durante 2 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y suavemente suspender las plaquetas en tampón de TH.</li>
		<li>Ajuste el volumen con buffer de TH para conseguir una cuenta de 2 x 107/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de monocapas de plaquetas adherentes
	<ol>
<li>Preparar el vidrio cubreobjetos (plaquetas adherentes) según 1.3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inmovilización de las plaquetas
	<ol>
<li>Añada 100 μl de una suspensión de plaquetas/ml de 2 x 107por canal e incubar durante 1,5 h a 37 ° C y 5% CO2.</li>
		<li>Vuelva a colocar cuidadosamente las plaquetas no adherente con solución de bloqueo (5% de BSA en HEPES) durante al menos 30 min a RT. continuar con perfusión de leucocitos (paso 3.3) y etiquetado fluorescente</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estimulación de monocapa de plaquetas de ratón
	<ol>
<li>Antes de la perfusión de los leucocitos (paso 3.3), estimular las plaquetas por la perfusión de la trombina (0,5 nM) en tampón HHHSA durante 3 minutos a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. etiquetado fluorescente y perfusión de leucocitos (PMN o THP-1 264.7 y humanos o monocitos primario de ratón para ensayo de flujo murino)
<ol><li>
Etiquetado fluorescente
	<ol>
<li>Etiqueta de los leucocitos (1 x 106/ml) con la tinción de ácido nucleico de fluorescente verde florescente de la célula (1 μm). Incube las células durante 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Lavar las células con PBS por centrifugación a 300 x g durante 5 min y suspender las células a una concentración de 0,5 x 106 células/mL (5 mL por la condición de prueba, dependiendo de la velocidad de flujo) en tampon de ensayo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación del análisis de flujo de cámara
	<ol>
<li>Para la adherencia del leucocito en una monocapa de células, desechar el medio de cultivo celular de la fuente y montar en la cámara de flujo. Conecte la tubería a la jeringa. Para la adherencia del leucocito en plaquetas inmovilizadas, conecte el micro slide a la jeringa. Caliente previamente un baño de agua a 37 ° C.</li>
		<li>Tome una jeringa de perfusión (50 mL), jeringa de instalar en el soporte de jeringa y retirar la bomba en conjunto modo. Ajuste el volumen de la bomba a 0 mL y selecciona el diámetro mm 26,70 para la jeringa de 50 mL.</li>
		<li>Conecte un conector luer de codo a un extremo de la tubería. Colocar un acoplador de la cerradura de luer a la jeringa y conectar el tubo con el conector luer de codo al acoplador de la cerradura de luer. Conecte el extremo libre de la tubería a la cámara de flujo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adherencia y perfusión del leucocito
	<ol>
<li>Para la adherencia del leucocito en una monocapa de células, desechar el medio de cultivo celular de la fuente y montar en la cámara de flujo. Conecte la tubería a la jeringa. Para la adherencia del leucocito en plaquetas inmovilizadas, conecte el micro slide a la jeringa.</li>
		<li>Para la perfusión del leucocito y adherencia sobre un vascular- o monocapa de plaquetas, coloque el segundo tubo en un tubo cónico de 50 mL que contiene tampón de ensayo y llenado de la tubería con pipeta de 1 mL, luego apriete el tubo y conectarlo a una cámara de flujo.</li>
		<li>Antes de la perfusión del leucocito, añadir 3 mM CaCl2 y 2 mM de MgCl2 a la suspensión de células e incubar 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Tampón de ensayo antes de la perfusión de las células para eliminar el posible aire de la cámara y el tubo de perfusión.</li>
		<li>Cerrar los extremos del tubo, apretando firmemente y cambiar tubo de tampón de ensayo, suspensión de la célula, impidiendo el quedar atrapado burbujas de aire. Perfusión de las células con el esfuerzo de velocidad/esfuerzo cortante flujo apropiado hasta que lleguen las primeras células.</li>
		<li>Perfusión de las células con la tensión de velocidad/esfuerzo cortante flujo apropiado durante 2 min y captura al menos 6 cuadros entre 2 – 6 min de balanceo y adherentes de células con un microscopio de contraste de la fluorescencia de fase invertida (por ejemplo, EVOS-FL) de 100 aumentos conectado para una cámara digital CCD o CMOS. Nota: Tensión de frecuencia/esquileo del flujo depende de las dimensiones de la cámara de flujo y viscosidad de la solución. Para cámara de perfusión utilizada aquí (véase Tabla de materiales): Τ =η* 97.1*Φ Τ: esfuerzo cortante (1 dyn/cm2) Η: viscosidad (0.015 dyn * s/cm2) Φ: caudal (0,67 mL/min)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La adherencia del leucocito
	<ol>
<li>Para de-adhesion, cambiar tubo de suspensión celular, tampón de ensayo apretando el tubo, evitando burbujas de aire quede atrapada.</li>
		<li>Separar las células, perfusión con tampón de ensayo con una tensión de tasa/esquileo del flujo apropiado (véase 3.3.7 la nota).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transmigración de leucocitos
	<ol>
<li>Para transmigración leucocitaria, perfusión leucocitos (paso 3) hasta que la cantidad de leucocitos se adhieren (~ 50 campo de células/vista).</li>
		<li>Reemplazar la suspensión de leucocitos con tampón de ensayo.</li>
		<li>Grabar las células transmigrating por lapso de tiempo cada 10 – 15 s durante 30 – 60 min a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immune+system+interactions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+engagement+of+platelet+glycoprotein+Ibalpha+via+the+integrin+Mac-1+is+critical+for+the+biological+response+to+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury.</a> Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).</li>
<li>Zhao, Z., Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+junctional+adhesion+molecule+A+from+platelets+increases+early-stage+neointima+formation+after+wire+injury+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice.</a> Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).</li>
<li>Wang, Y., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrin+Mac-1+regulates+thrombosis+via+interaction+with+platelet+GPIb%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα.</a> Nature communications. 8, 15559(2017).</li>
<li>Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016793170200494X">PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications.</a> Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).</li>
<li>Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032386106013061">Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel.</a> Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724(2010).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este ensayo en vitro es un método sencillo para investigar mecanismos subyacentes del reclutamiento de leucocitos durante la inflamación vascular, pero hay algunos puntos críticos a ser observado. El primer requisito para la realización con éxito de este ensayo es la perfusión de leucocitos en un intacto y confluentes vasculares o monocapa de plaquetas. Esto puede lograrse por capa previa de las superficies con colágeno de tipo I. En general, cuando se trabaja con las células vasculares primarias, es importante ...

Sobre la lesión, inflamación o infección, leucocitos responden rápidamente al patógeno o daños asociada - molecular (PAMPs, humedades), cambiar a un estado activado y salir del torrente sanguíneo a sitios de inflamación y tejido de daños. La capacidad de interactuar con su entorno celular y molecular de los leucocitos es esencial para su correcto funcionamiento como las células inmunes, como resaltado por trastornos genéticos como de deficiencia de adhesión leucocitaria1. Adherencia del leucocito ha sido objeto de intensa investigación durante las últimas décadas y esto ha derivado en el concepto de la cascada de adhesión leucocitaria en los comienzos del decenio de 19902,3. Adherencia del leucocito es iniciada por la captura de selectina-mediada de los leucocitos al endotelio, causando las células a rodar sobre la superficie vascular. Este balanceo permite leucocitos buscar señales migratorias endotelio-limite, por ejemplo, quimiocinas, que inducen la activación de las integrinas. Posteriormente, las integrinas activadas median la Unión a ligandos endoteliales, dando por resultado la detención firme del leucocito. Leucocitos pueden posteriormente preparar a extravasate de arrastre y difusión, antes de penetrar en la monocapa endotelial y transmigrating en el tejido subyacente. El concepto básico de la cascada del leucocito canónico ha permaneció prácticamente sin cambios desde su introducción, con algunos pasos intermedios adicionales4. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos y los roles de los jugadores muchos involucrados en el reclutamiento leucocitario no aclarados hasta el momento, y reclutamiento leucocitario sigue siendo un tema importante en el campo de la infección, la inflamación y (auto-) inmune investigación.
Por ejemplo, durante enfermedades inflamatorias vasculares como la aterosclerosis, mayor reclutamiento leucocitario en el desarrollo de placa buque pared unidades. Las placas ateroscleróticas inestables podrían romperse, llevando a la activación masiva de las plaquetas y el sistema de coagulación y posteriormente a la obstrucción de los vasos5. Esto puede resultar en resultados cardiovasculares graves como infarto de miocardio o accidente cerebrovascular. Además, denudación endotelial, como ocurre clínicamente, por ejemplo, después de stenting de la arteria coronaria, conduce a una multitud de interacciones de los leucocitos y las plaquetas en el interior de pared expuesta del recipiente (p. ej., componentes de la matriz y liso las células del músculo) y de leucocitos con las plaquetas cubriendo la lesión vascular. Estas interacciones son importantes para el desarrollo de la enfermedad como interacciones de monocito plaquetas podrían conducir la formación de neoíntima6,7. Además, las interacciones plaquetas leucocitos mediaron por la integrina leucocitaria Mac-1 (α βM2) y plaquetas GPIbα recientemente han sido identificadas como nuevos controladores de la trombosis en ratones8.
Dada la amplia disponibilidad de sangre humana y animal como fuente de leucocitos y plaquetas para la investigación y el amplio espectro de moléculas de matriz aislada y líneas celulares inmortalizadas de leucocito y de origen vascular, es factible simular del leucocito interacciones bajo flujo en un laboratorio de creación, utilizando cámaras de perfusión de flujo especialmente diseñada. Muchas variantes se han diseñado en las últimas décadas, que van de vacío a cámaras de perfusión auta-adhesivo. Todas las variantes tienen en común que la parte inmóvil (p. ej., células vasculares cultivadas o proteínas de la matriz) está montada en una cámara de prueba de fugas más grande equipada con un canal predefinido que permite la perfusión de fluidos sobre la parte inmóvil. Además, avances en la tecnología de moldeo permitieron el desarrollo de soluciones a medida basadas en polímeros de sílice9. La viscosidad y la velocidad de flujo de los líquidos perfundidos y la altura del canal principalmente determinan las características de la tensión de esquileo del flujo perfusión dispositivo10. En este artículo presentamos un método en vitro para estudiar los mecanismos subyacentes de la adherencia, la adherencia y transmigración de leucocitos bajo regímenes de flujo venoso y arterial. La ventaja de los métodos presentados aquí es que se puede realizar utilizando un microscopio de fluorescencia con cámara conectada común y no requieren un experimentadores poseer alto nivel técnico. El ensayo en vitro puede ser manipulado de muchas maneras (por ejemplo, mediante la adición de inhibidores o anticuerpos de bloqueo) y por lo tanto es aplicable en diferentes modelos de inflamación vascular y permite la investigación de la adherencia de funciones de la proteína o la evaluación de compuestos específicos.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida p. ej. EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pump p. ej. modelo: 210-CE</td><td>&nbsp; world precision instruments</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Tratado TC Estilo de fácil agarre Placa de cultivo celular</td><td>corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona&nbsp;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Conector Luer de codo macho</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Acoplador de bloqueo Luer hembra</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de flujo</td><td>Hospital Universitario RWTH Aquisgrán</td><td></td><td>Patente DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&auml; ngen an Zelloberfl&auml; Chen. Año 2005.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ibdi sticky slide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos para portaobjetos pegajosos&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I, cola de rata</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>TNF-& alfa humano recombinante;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Activador del receptor de trombina para el péptido 6 (TRAP - 6)</td><td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 tinción de ácido nucleico fluorescente verde</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solución salina equilibrada 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solución tampón 1M, líquida</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATE Albúmina, 25%&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Agua inyectable</td><td>B. Braun 3624315</td><td>Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de calcio dihidratado</td><td>Merck</td><td>102382&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apirasa</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células endoteliales (listo para usar)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales aórticas humanas primarias (HAoEC)</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Medio basal de células vasculares&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Crecimiento de Células Endoteliales-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Células Primarias de Músculo Liso Aórtico Humano (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Crecimiento de Células de Músculo Liso Vascular ATCC</td><td></td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular endotelial humana, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Medio de Eagle modificado (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular endotelial de ratón, SV 40 transformada (SVEC4-10)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular monocítica humana, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con ultra-glutamina</td><td></td><td>Lonza BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Monocitos de ratón/macrófagos RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), alto contenido de glucosa</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Vacutainer Tubos de Extracción de Sangre de Plástico con Heparina de Sodio</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>TUBO DE VACUETTE 9 ml 9NC Citrato de Sodio de Coagulación 3.2%&nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de HCl/EtOH (1,2 mol/L de HCl y 50% de etanol) en agua</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Prepare mezclando 0,3 L de HCl (4 mol/L) con 0,7 L de etanol al 70 % v/v en una campana extractora</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

El reclutamiento de los leucocitos sobre lesiones o inflamación a los sitios de lesión o daño tisular ha sido investigado durante las últimas décadas y se ha traducido en el concepto de la cascada de adhesión leucocitaria. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos involucrados en el reclutamiento leucocitario todavía no sido plenamente identificados. Puesto que el reclutamiento del leucocito sigue siendo un tema importante en el campo de la infección, la inflamación y la (auto) inmune investigación, presentamos un ensayo sencillo basado en el flujo laminar para estudiar los mecanismos subyacentes de la adherencia, la adherencia, y transmigración de leucocitos bajo regímenes de flujo venoso y arterial. El ensayo en vitro puede utilizarse para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares en diferentes modelos de inflamación vascular. Este protocolo describe un ensayo de flujo laminar usando una cámara de flujo paralelo y un microscopio invertido de contraste de fase conectada a una cámara para estudiar las interacciones de los leucocitos y las células endoteliales o plaquetas, que pueden ser visualizadas y registradas entonces Análisis fuera de línea. Las células endoteliales, plaquetas y leucocitos pueden ser pretratados con inhibidores o anticuerpos para determinar el papel de moléculas específicas durante este proceso. Condiciones de esfuerzo cortante, tensión de esquileo es decir, arterial o venoso, pueden ser adaptadas fácilmente por la viscosidad y la velocidad de flujo de los líquidos perfundidos y la altura del canal.

Para estudiar la adhesión endotelial leucocitaria, fluorescencia etiquetadas células THP-1 fueron perfundidas en una monocapa endotelial TNFα - o no-estimulados por 2 min a 3 Dina/cm2. El número total de células monocytic adherentes se determinó después de 2 min de la perfusión por la captura de 6 campos independientes durante un período de 2-6 min. Las células adherentes se cuantificaron en al menos 6 imágenes capturadas con un microscopio de contraste de la fluorescencia de f...

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

El objetivo general de este experimento es investigar los mecanismos detrás de las interacciones de los leucocitos con las células vasculares adherentes o las plaquetas en condiciones de flujo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo se reclutan los leucocitos para los sitios de inflamación. La principal ventaja de esta técnica es que es rentable, fácil de usar y permite la investigación de una gran variedad de condiciones experimentales.Este método puede proporcionar información sobre la adhesión de los leucocitos. También se puede aplicar a otros sistemas como la adhesión de células tumorales a células inmovilizadas o sustratos en condiciones de flujo. Annemiek Dickhout, ingeniera y estudiante de doctorado que trabaja en mi laboratorio, demostrará el procedimiento.Después de obtener muestras de sangre, agregue 1/15 de volumen de citrato ácido dextrosa a la sangre. A continuación, centrifugar la muestra de sangre poniendo los frenos a 350 veces g durante 15 minutos para obtener plasma rico en plaquetas. A continuación, transfiera el sobrenadante obtenido a un tubo cónico de 15 mililitros y añada 1/10 de volumen de citrato ácido

laminar-flow-based-assays-to-investigate-leukocyte-recruitment-on

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La cascada de adhesión de las plaquetas se lleva a cabo en presencia de flujo de tensiones, no es un factor en cuenta en convencional (estática) y placa-ensayos. Este artículo informa sobre un ensayo de agregación plaquetaria utilizando una placa de microfluidos bien en formato de imitar las condiciones fisiológicas de flujo de corte.

Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

Estamos describiendo un método de someter a las células adherentes al esfuerzo cortante de flujo laminar en un circuito de flujo continuo estéril. Adhesión de las células, la morfología puede ser estudiado a través de la cámara transparente, las muestras obtenidas de los circuitos para el análisis de metabolitos y células recolectadas después de la exposición de corte para futuros experimentos o la cultura.

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Este video muestra un ensayo basado en flujo laminar para caracterizar la interacción de leucocitos y socios celulares como las células endoteliales. Este método proporciona información dinámica sobre la adhesión, la muerte y la transmigración de los leucocitos cuando se perfunden sobre una capa intacta y confluente de células vasculares.

Ensayo basado en flujo laminar para estudiar las interacciones entre los leucocitos y las células endoteliales

El video muestra un método para investigar el impacto de las células estromales en el reclutamiento de leucocitos. En un modelo de cámara de flujo de placas paralelas, las citocinas proinflamatorias inducen la expresión de receptores de adhesión por parte de las células endoteliales, lo que facilita el reclutamiento y la migración de neutrófilos. La diafonía entre las células estromales y las células endoteliales disminuye el reclutamiento de neutrófilos a las células endoteliales.

Una investigación de flujo in vitro del efecto de las células estromales en el reclutamiento de leucocitos

El reclutamiento de leucocitos en el hígado se produce dentro de los canales especializados de los sinusoides hepáticos que se alinean por las células endoteliales sinusoidales hepáticas únicas. Microscopía de contraste de fase de reclutamiento de leucocitos a través del endotelio sinusoidal hepático humano en condiciones de tensión de cizallamiento fisiológica puede facilitar la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

A continuación, presentamos un protocolo que permite al investigador evaluar la dinámica de reclutamiento de leucocitos ex vivo mediante la conexión de una cámara recubierta con moléculas de adhesión endoteliales derivado al sistema circulatorio de un ratón. Este método ofrece ventajas significativas ya que permite la evaluación de leucocitos en condiciones biológicas relativas.

La evaluación de las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo en un Ex Vivo Ensayo Autoperfused Cámara Microflow

La capacidad del endotelio inflamado para reclutar leucocitos de flujo se regula por las células estromales mesenquimales. Se describen dos modelos in vitro que incorporan células humanas primarias que se pueden utilizar para evaluar el reclutamiento de neutrófilos de flujo y examinar el papel que las células estromales mesenquimales desempeñan en la regulación de este proceso.

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Este trabajo describe un método basado en microscopía de fluorescencia para el estudio de la adhesión plaquetaria, la extensión y la secreción bajo flujo. Esta plataforma versátil permite la investigación de la función plaquetaria para la investigación mecánica sobre trombosis y hemostasia.

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Aquí, presentamos un protocolo integrado que mide la subpoblación de monocito tráfico bajo flujo in vitro por el uso de marcadores de superficie específicos y microscopía de fluorescencia confocal. Este protocolo puede utilizarse para explorar medidas de reclutamiento secuencial así como a otros subtipos de leucocitos usando otros marcadores de superficie específicos del perfil.

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

Este protocolo paso a paso proporciona una descripción detallada de la disposición experimental y análisis de datos para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs y el análisis de la adherencia del leucocito bajo flujo fisiológico.

Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs)

Aprende ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y plaquetas adherentes. Este método económico y versátil permite estudiar mecanismos de adhesión celular en condiciones de flujo.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes (Video) | JoVE Journal

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Explorar más videos