Name: Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprende a aislar células iniciadoras de tumores en sarcoma mediante FACS usando HLA-I como marcador negativo. Este método permite caracterizar células madre cancerosas con alta capacidad de formación de sarcospheras.

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Esta investigación fue apoyada por NCI-P01-CA087497 (a C.C.-C. y D.H.) y NIH-U 54-0OD020353 (a C.C.-C., D.H., y J.D.-D.), el Premio líder de pensamiento de Agilent (a C.C.-C.), y la Fundación Martel (a C.C.-C. y J.D.-D.).

Todos los protocolos para los experimentos con ratones discutidos aquí estaban de acuerdo con las directrices institucionales y aprobados por el Comité de ética de investigación humana institucional del Centro Médico Mount Sinai y el Comité de Cuidado y Uso de Animales.
1. Procesamiento de la muestra de tejido del sarcoma y la formación PDX
<ol><li>Bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional, pida al personal del servicio de patología que prepare muestras de sarcoma de muestras de cirugía e coloque inmediatamente cada muestra en hielo en un plato Petri de 100 mm.</li>
	<li>Coloque la muestra en un tubo cónico de poliestireno de 15 ml con 6 ml de medio de cultivo frío Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina. Procesar la muestra de tejido inmediatamente.</li>
	<li>
(Opcional) Solo para el osteosarcoma, siga los siguientes pasos, que se pueden omitir para el sarcoma de tejidoblando.
	<ol>
<li>Cortar el tejido en 20 mm3 piezas usando un bisturí. Transfiera las piezas de tejido a un tubo de 15 ml que contenga 3 ml de solución de colagenasa (RPMI 1640 con 1 mg/ml de colagenasa).</li>
		<li>Poner el tubo en un baño de agua a 37 oC durante 30 minutos.</li>
		<li>Vórtice a fondo el tubo y, a continuación, añadir 3 mL de RPMI 1640 complementado con 10% FBS para neutralizar la actividad de la colagenasa.</li>
		<li>Centrífuga durante 5 min a 350 x g a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trabajando en un gabinete de bioseguridad estéril, coloque la muestra de tejido en un plato Petri de 100 mm. Añadir 500 l de solución salina estéril 1x con fosfato (PBS) al tejido. Con un bisturí estéril, triturar mecánicamente el tejido en trozos pequeños hasta que ninguna pieza de tejido visible sea mayor de 0,1 mm.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular de 500 ml a un colador de células de 35 m y recoja la suspensión filtrada con un tubo de poliestireno de 50 ml. Ponga este tubo de poliestireno de 50 ml con la suspensión celular sobre hielo.</li>
	<li>Añadir otros 500 l de PBS al tejido. Triturar por segunda vez, transferir la suspensión a través del colador de la célula, y recogerla en el mismo tubo de 50 ml.</li>
	<li>Repita estos pasos (pasos 1.5–1.6) hasta que la sección del tejido esté completamente disociada, generalmente 6x - 8x.</li>
	<li>Pellet la suspensión celular por centrifugación a 350 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante, resuspender el pellet usando 5 ml de tampón de hemólisis (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3y 0,1 mM EDTA), e incubar la solución durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar los glóbulos rojos.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 350 x g a temperatura ambiente y eliminar el tampón de hemólisis. Lavar el pellet con 5 ml de PBS. Centrifugar de nuevo durante 5 min a 350 x g y quitar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda el pellet con 1 ml de PBS y cuente el número de celda viable usando un hemocitómetro o cualquier otro método alternativo. Diluir las células a una concentración final de 1 x 107 células en 200 l de PBS. Deje la suspensión de la celda sobre hielo.</li>
	<li>Deje la matriz de membrana del sótano sobre hielo para permitir que se derrita. Añadir 200 l de matriz de membrana de sótano a la suspensión celular de 200 l. Mezcle suavemente y mantenga en hielo.</li>
	<li>Inyección subcutánea de la suspensión celular: matriz de membrana de sótano (1:1) mezcla en dos ratones NOD scid gamma (NSG) en sus flancos. Utilice 200 l para cada inyección.</li>
	<li>Supervise la formación de PDX comprobando el lugar de inyección de los ratones 2 veces por semana. Retire el xenoinjerto tumoral cuando alcance 1 cm de diámetro.</li>
</ol>2. Aislamiento de células que inician tumores por FACS del PDX
<ol><li>Retire quirúrgicamente el PDX de los ratones como se describió anteriormente12.</li>
	<li>Corta el tumor por la mitad. Fije la mitad del xenoinjerto con 4% de paraformaldehído durante la noche. Esto es para análisis histológico. Procesar la otra mitad del tejido como se describió anteriormente (pasos 1.3–1.8) para obtener una suspensión de la célula tumoral.</li>
	<li>Resuspenda el pellet con PBS y cuente el número de celda viable.</li>
	<li>Diluir la suspensión celular en PBS suplementada con 5% FBS a una concentración de 2 x 106 células/ml. Deje la suspensión celular sobre hielo durante 30 minutos. Marque los tubos con control de isótopos y anticuerpos, respectivamente. Observe el número de células en cada tubo.</li>
	<li>Preparar 2 x anticuerpo HLA-1-PE diluyendo el anticuerpo con PBS complementado con 5% DE FBS (1:250). Diluir el anticuerpo de control de isotipo negativo con la misma condición. Mezclar la suspensión celular del tubo "anticuerpo" con anticuerpos diluidos (1:1) para hacer la dilución final del anticuerpo 1:500. Mezclar la suspensión celular del tubo de "control de isótopos" con el control de isótopos (1:1). Ponga las suspensiones de celdas en hielo durante 90 min.</li>
	<li>Centrífuga durante 5 min a 350 x g a 4oC y retira el sobrenadante. Añadir 10 mL de PBS para lavar el pellet 2x.</li>
	<li>Añadir 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a PBS a una concentración final de 10 g/ml. Agregue esta solución DAPI al pellet celular para hacer una suspensión celular de 107 células/ml (usando los números de celda del paso 2.4).</li>
	<li>Filtrar la suspensión de la célula a través de tapas de colador de 35 mm en tubos de poliestireno de 12 mm x 75 mm.</li>
	<li>Utilice un citómetro de flujo para ordenar la subpoblación TIC HLA-1-negativa6. Las células viables de la puerta (DAPI-negativa) y recoger las subpoblaciones HLA-1-negativas y -positivas en dos tubos de recolección de 15 ml, cada uno con teniendo 4 ml de medio de cultivo RPMI 1640.</li>
</ol>3. Caracterización de las células que inician tumores
<ol><li>Formación de la sarcosfera
	<ol>
<li>Haga que la sarcosfera sea mediana de crecimiento, utilizando un medio de cultivo celular alfa-MEM. Añadir suplementos para hacer una concentración final de suplementos de B-27 (1x), Suplementos de N2 (1x), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (20 ng/ml), y factor de crecimiento epidérmico (EGF) (20 ng/ml) y penicilina/estreptomicina (100 UI/ml). Filtre el medio con un filtro de cultivo celular de 0,2 m antes de su uso.</li>
		<li>Pellet la subpoblación hLA-1-negativa y positiva ordenada del paso 2.9 y contar los números de célula de cada subpoblación.</li>
		<li>Diluir 1,5 x 106 células en 15 ml del medio de crecimiento de la sófera para hacer la dilución celular de 1 x 105 células/ml.</li>
		<li>Diluir en serie las células con medio de crecimiento de sórtica fresca para hacer 15 ml de dilución celular de 104, 103y 102 células/ml. Luego, prepare cuatro placas de cultivo de células de unión ultrabaja de 96 pocillos, cada una para una dilución celular.</li>
		<li>Transfiera 100 ml de suspensión celular de la dilución de 105 células/ml a cada pocal de la primera placa de cultivo de células de unión ultrabaja de 96 pocillos. Esta placa tiene 104 células en cada pozo.</li>
		<li>Utilice las otras tres placas de cultivo de células de unión ultrabaja de 96 pocillos para las otras tres diluciones celulares: 104, 103y 102 células/ml. Transfiera 100 l de suspensión celular a cada pocal de las placas de cultivo de células de fijación ultrabaja de 96 pocillos. Estas tres placas de cultivo tienen 1.000 células/pozo, 100 células/pozo, y 10 células/pozo, respectivamente.</li>
		<li>Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular de 37 oC y 5% de CO2.</li>
		<li>Añadir nuevos bFGF y EGF directamente al medio de cultivo celular (concentración final de 20 ng/ml) cada tres días sin cambiar el medio para evitar las células perdidas en el cultivo de suspensión.</li>
		<li>Usando un microscopio de luz, monitoree la formación de la sarcosfera todos los días durante tres semanas, como se muestra en la Figura 2A.</li>
		<li>Después de tres semanas, cuente el número de pozos positivos de la sarcásfera y los pozos negativos de la sarcásfera de cada dilución celular para células HLA-1-negativas y HLA-1-positivas.</li>
		<li>Calcular la frecuencia de celda de formación de esferas basada en una distribución de probabilidad de Poisson13. Compare los TIC HLA-1 negativos con las células a granel positivas de HLA-1.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de formación de tumores de dilución en serie
	<ol>
<li>Cuente las subpoblaciones HLA-1-negativas y -positivas del paso 2.9.</li>
		<li>Hacer diluciones en serie de las células con PBS a concentraciones de 106, 105, 104y 103 células/ml. Utilice 1 ml de cada dilución para la formación de tumores en 10 ratones.</li>
		<li>Añadir 1 ml de matriz de membrana del sótano a la suspensión celular de 1 ml de cada dilución (1:1). Conservar los 2 ml de cada mezcla sobre hielo.</li>
		<li>Inyección subcutánea de 200 l de la célula:mezcla de matriz de membrana de sótano en los flancos de ratones NGS, utilizando células HLA-1-negativas para un flanco y células HLA-1-positivas para el otro flanco del mismo ratón. Para cada dilución, utilice 10 ratones. Utilice jeringas 25G con una aguja para las inyecciones.</li>
		<li>Controlar la formación de tumores en ratones durante cuatro a ocho semanas, dependiendo de la tasa de crecimiento del tumor.</li>
		<li>Calcular la frecuencia celular que inicia el tumor por el porcentaje de formación de tumores en diferentes números de células de entrada. Compare los TIC HLA-1 negativos con las células a granel positivas de HLA-1.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación inducida a lo largo de las vías mesenquimales
	<ol>
<li>Utilice las sarcáselas formadas durante los pasos anteriores (paso 3.1.9). Transfiera las sarcáselas a una nueva placa de 6 pocillos. Cultivo de la sórsfera con 2,5 ml de alfa-MEM complementado con 10% FBS para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa de cultivo.</li>
		<li>Después de un accesorio durante dos días, cambie el medio de cultivo de alfa-MEM complementado con 10% FBS a la mezcla 1:1 de alfa-MEM complementado con 10% FBS y medio de crecimiento de células madre mesenquimales humanas (hMSC).</li>
		<li>Después de dos días, cambie a medio de crecimiento hMSC completo.</li>
		<li>Cuando las células alcancen una confluencia del 90%, aspire el medio hMSC y agregue un medio de diferenciación. Para la diferenciación osteogénica, añadir medio de diferenciación osteogénica (medio de crecimiento hMSC complementado con 10 nM dexametasona, 5 mM de glicerofosfato, ácido L-ascórbico de 50 g/ml y cloruro de litio de 10 mM). Para la diferenciación lipogénica, añada el medio de diferenciación de adipocitos (medio de crecimiento hMSC complementado con dexametasona de 0,5 m, isobutilometilxantina de 0,5 m y 50 m de indometacina).</li>
		<li>Cambie el medio de diferenciación cada tres días.</li>
		<li>Después de tres a cuatro semanas, deje de diferenciar y lave las células con PBS. Luego, aspirar el PBS y agregar 2 mL de 10% de formalina a las células para la fijación. Deje que las células se sentén durante 45 minutos a temperatura ambiente. Lávelos con agua desionizada. Las células ya están listas para la tinción de Alizarin Red S (paso 3.3.6.1) o la tinción de Aceite Rojo O (paso 3.3.6.2).<ol>
<li>Para detectar la diferenciación osteogénica, realice la tinción de Alizarin Red S. Aspirar agua y añadir 2 mL de solución de trabajo Alizarin Red S (2% Alizarin Red S, pH 6.0) a las células, y dejarlas sentar durante 5 minutos para la tinción. Lavar las células con agua desionizada y observar la reacción microscópicamente.</li>
			<li>Para detectar la diferenciación adipogénica, realice la tinción de aceite rojo O.<ol>
<li>Haga una solución de Aceite Rojo O. Preparar una solución en stock añadiendo 300 mg de aceite rojo O en polvo a 100 ml de isopropanol.</li>
				<li>Dentro de 2 h antes de usar, mezcle tres partes (30 ml) de la solución de stock de aceite rojo O con dos partes (20 ml) de agua desionizada. Deje que la mezcla se situya durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
				<li>Filtre la solución de trabajo antes de su uso.</li>
				<li>Retire el agua de las células preparadas según el paso 3.3.6. Añadir 2 mL de 60% isopropanol para cubrir la monocapa celular y las células se sentan durante 2 min.</li>
				<li>Retire el isopropanol y agregue 2 ml de solución de trabajo Oil Red O. Deje que las células se sit durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
				<li>Enjuague las células con agua desionizada y observe la reacción bajo un microscopio de luz.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Medema, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+the+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: the challenges ahead.</a> Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).</li>
<li>Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).</li>
<li>Jordan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+controversial+or+just+misunderstood%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).</li>
<li>Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+DNA+methylation+of+CD133+in+colorectal+and+glioblastoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors.</a> Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Garrido, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+HLA+expression+during+tumour+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Natural history of HLA expression during tumour development.</a> Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).</li>
<li>Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+nonclassical+HLA+class+I+antigen+and+NK+cell-activating+ligand+changes+in+malignant+cells%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions.</a> Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sarcoma+tumor-initiating+cells+through+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy.</a> Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios pasos críticos que limitan el éxito de este protocolo para aislar y caracterizar las células que inician tumores de las PDX del sarcoma humano. Observamos que la formación de PDX depende en gran medida de los subtipos de sarcoma. Sarcomas clínicos agresivos con fenotipo histológicamente indiferenciado (p. ej., sarcomas plémficos indiferenciados [tasa de éxito 100%, n a 2], liposarcomas desdiferenciados [tasa de éxito 100%, n a 2] y sarcomas sinoviales [ tasa de éxito 100%, n . 3]) tienen una alta tasa de éxito de la formación de PDX. Mientras tanto, los sarcomas con fenotipos diferenciados (por ejemplo, liposarcomas bien diferenciados [tasa de éxito 0%, n a 3]) muestran tasas de formación pdX más bajas. Es posible que las células que inician tumores estén presentes en subtipos más malignos en un porcentaje mayor que en subtipos menos malignos y diferenciados. Además, recomendamos terminar el procedimiento de aislamiento celular que inicia el tumor en un día sin ningún tipo de parada para minimizar cualquier pérdida de viabilidad celular.
Hemos identificado que las células HLA-1-negativas existen ampliamente en los sarcomas humanos. Pero el porcentaje de células HLA-1-negativas puede variar entre muestras de diferentes pacientes. Por este método, hemos aislado con éxito las células que inician tumores de muestras que tienen células HLA-1-negativas que van desde menos de 0.5% a más de 30%12. Es importante caracterizar las células HLA-1-negativas funcionalmente por la formación de esferas y ensayos de formación de tumores para confirmar la identidad celular que inicia el tumor de células aisladas HLA-1-negativas.
Sin embargo, el protocolo presentado aquí también tiene limitaciones. Los datos anteriores mostraron que la expresión HLA-1 está regulada epigenéticamente, lo que es consistente con la observación de la heterogeneidad celular de la expresión HLA-1 dentro del mismo tumor12. Se detectaron mutaciones genómicas de HLA-1 en sarcomas y otros tipos de cáncer. Las mutaciones en los genes HLA-1 pueden conducir a la pérdida completa de HLA-1 en la superficie celular de todo el tumor o a expresar HLA-1 mutado no funcional. En cualquier caso, la negatividad HLA-1 no se puede utilizar para identificar los TIC dentro del tumor.
Utilizando HLA-1 como marcador negativo, hemos aislado con éxito LOS TIC de una variedad de subtipos de sarcoma humano y validado nuestros resultados mediante análisis funcionales. Así, pudimos realizar estudios moleculares, incluido el análisis de la expresión génica en los TIC, con el fin de desarrollar un tratamiento específico dirigido a estos TIC.

La heterogeneidad celular intratumoral de los cánceres humanos ha sido apoyada por el aumento de la evidencia durante la última década1. Similar al tejido normal, el tejido canceroso consiste en una pequeña subpoblación de TIC (también llamadas células madre cancerosas), que exhiben capacidad de formación de tumores; mientras tanto, la mayor parte de las células cancerosas exhiben fenotipos diferenciados2. Estos TIC muestran propiedades similares a las células madre, incluyendo la expresión de un marcador de células madre y la capacidad de la auto-renovación y la división celular asimétrica, y por lo tanto, pueden iniciar la formación de un tumor heterogéneo celular3. Estudios recientes han revelado que los TIC no sólo son responsables dela iniciación del tumor, sino que también están asociados con la agresividad tumoral 4, la metástasis5y la resistencia a los medicamentos6. Por lo tanto, es importante entender la biología de los TIC y, por lo tanto, desarrollar una estrategia de tratamiento específica dirigida a estos TIC.
Se han utilizado métodos basados en FACS para identificar LOS TIC mediante marcadores TIC,incluidos CD133, CD24 y CD44 1. La mayoría de estos marcadores también se expresan en células madre normales7. Sin embargo, ninguno de estos marcadores marca únicamente los TIC. Los papeles que desempeñan estas moléculas en la neoplasia maligna de los TIC aún no están claros. Por ejemplo, CD133 puede ser frecuentemente inactivado por la metilación del ADN, y por lo tanto, esta heterogeneidad intertumoral puede hacer que la precisión de estos marcadores8. ALDH1 es un marcador que también funciona para mantener la talla de TICs9. Parece ser más eficaz en la identificación de tiCs de cáncer de mama, pero sigue siendo cuestionable en otros tipos de tumores9. Algunas vías de señalización desempeñan un papel importante en la biología de células madre, como Wnt(sitio de integración relacionada con las alas), TGF-o (factor de crecimiento beta transformador) y Erizo 1. Pero es difícil demostrar que estas vías son específicas de TIC y utilizar la actividad de estas vías para aislar los TIC de los tumores primarios. Por lo tanto, se necesita urgentemente un nuevo marcador TIC fiable.
MHC humano clase I, también llamado HLA-1, es una proteína de superficie celular expresada en casi todas las células nucleadas10. HLA-1 funciona como un antígeno que presenta una molécula que es específicamente reconocida por las células T CD810. El efecto citotóxico de las células T CD8 se puede activar cuando las células cancerosas presentan un antígeno tumoral por HLA-1. Por lo tanto, la falta de HLA-1 en la superficie celular de las células cancerosas puede conducir a una fuga inmune de las células T CD8 citotóxicas. La regulación de HLA-1 se ha descrito en diferentes tipos de cáncer humano y se correlaciona con mal pronóstico, metástasis y resistencia a los medicamentos11. Hemos demostrado que la pérdida de expresión HLA-1 en la superficie celular se puede utilizar para identificar TIC en sarcomas, así como en el cáncer de próstata6,12.
Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar los TIC de los PDX de sarcoma humano por FACS, utilizando HLA-1 como marcador negativo, y para validar y caracterizar aún más estos TIC HLA-1 negativos.

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu; m filtro para cultivo celular</td><td>ThermoFisher</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>100 mm placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubo cónico</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; filtro de células</td><td>m Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>tubo de poliestireno de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de fijación ultrabaja de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo HLA-1-PE</td><td>Abcam</td><td>ab43545</td><td></td></tr><tr><td>hMSC medio de crecimiento</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-030</td><td></td></tr><tr><td>indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>isobutilmetilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo de control de isotipo</td><td>Abcam</td><td>ab103534</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matriz de membrana basal</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Ratones NSG</td><td>The Jackson Lab</td><td>005557</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Rojo O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa con aguja</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

La existencia y la importancia de las células que inician tumores (TIC) han sido apoyadas por el aumento de la evidencia durante la última década. Se ha demostrado que estos TIC son responsables de la iniciación del tumor, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, es importante desarrollar una terapia específica de focalización de TIC además de las estrategias de quimioterapia actuales, que se centran principalmente en la mayor parte de los no TIC. Con el fin de comprender mejor el mecanismo detrás de la neoplasia maligna de los TIC, describimos un método para aislar y caracterizar los TIC en los sarcomas humanos. En este documento, mostramos un protocolo detallado para generar xenoinjertos derivados del paciente (PDX) de sarcomas humanos y para aislar los TIC mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando antígeno leucocito humano clase I (HLA-1) como marcador negativo. Además, describimos cómo caracterizar funcionalmente estos TIC, incluyendo un ensayo de formación de esfera y un ensayo de formación tumoral, e inducir la diferenciación a lo largo de las vías mesenquimales. El aislamiento y la caracterización de los TIC PDX proporcionan pistas para el descubrimiento de posibles reactivos de terapia de orientación. Además, la creciente evidencia sugiere que este protocolo puede ampliarse aún más para aislar y caracterizar los TIC de otros tipos de cánceres humanos.

Se generó y teñida un PDX de sarcoma humano. La inmunohistoquímica mostró una heterohistoquímica intratumoral utilizando el anticuerpo HLA-1. El xenoinjerto consistió en dos subpoblaciones distintas, a saber, HLA-1 positiva y negativa (Figura1A)12. El sarcoma PDX mostró similitudes histológicas con el tumor primario parental (Figura1A). Sarcoma PDX TICs fueron aislados por FACS. Utilizando un método de clasificación doble, las células HLA-1-negativas se enriquecieron altamente a partir de la población de células parentales (Figura1B)12.
Se encontró que los genes expresados en células madre (por ejemplo, Oct4, Nanog y Myc) se expresaban altamente en células aisladas de HLA-1-negativas en comparación con su contraparte Positiva de HLA-1 (Figura1C). Sox-9, un gen del desarrollo reportado para desempeñar un papel importante en otras células madre cancerosas, como en el carcinoma de mama, se expresaron específicamente en células HLA-1-negativas (Figura1D).
Para validar la subpoblación aislada HLA-1-negativa, se realizó un ensayo de formación de sarcósfera para examinar la capacidad de auto-renovación de las células. Las células HLA-1-negativas fueron capaces de formar esferas con una entrada inicial de tan solo 10 celdas (Figura 1E)12. Con el fin de examinar la capacidad de formación de tumores, se realizó un ensayo de formación de tumores de dilución en serie. Los mismos números de células HLA-1-negativas y -positivas se inyectaron por vía subcutánea en cada flanco del mismo ratón. Las células HLA-1-negativas mostraron una capacidad de formación tumoral significativamente mayor (Figura1F)12, mientras que los xenoinjertos formados por subpoblaciones HLA-1-negativas y -positivas eran tumores heterogéneos celulares (Figura1H).
Realizamos un análisis de expresión génica de los TIC aislados HLA-1-negativos12. Los genes asociados con la diferenciación normal de células mesenquimales fueron elevados en LOS TIC12. Por lo tanto, también probamos si los TIC HLA-1 pueden inducirse a la diferenciación terminal y dar lugar a una disminución de la capacidad de formación de tumores. Los resultados mostraron que las células HLA-1-negativas pueden ser inducidas para diferenciara a lo largo de las vías lipogénicas y osteogénicas y muestran fuerte aceite rojo O y alizarin a la mancha roja (Figura1G). Por el contrario, las células Positivas HLA-1 no se diferencian en las mismas condiciones. Por lo tanto, estos resultados indican una prometedora estrategia de terapia diferenciada que se puede utilizar para atacar los TIC de sarcoma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg"> Figura 1: Aislamiento de células HLA-1-negativas de PDX de sarcoma heterotúmicos intratumorales. (A) Células HLA-1-negativas (flechas) se encontraron en diferentes subtipos de sarcomas humanos por inmunohistoquímica (IHC). (a y b) Sarcoma de células claras. (c y d) Liposarcoma pleomórfico. (e y f) Leiomyosarcoma. (g y h) Tumor maligno de la vaina del nervio periférico. (i y j) Liposarcoma, no especificado de otro modo. (k y l) Liposarcoma desdiferenciado. La barra de escala de 100 m. (B) los PDX de sarcoma eran histológicamente similares al tumor parental (mancha de hematoxilina y eosina [H&amp;E]) y mostraban heterogeneidad celular en la expresión HLA-1 de IHC. Aquí se muestran imágenes representativas de los PDX del sarcoma, incluyendo un sarcoma de células claras (CCS), un condrosarcoma desdiferenciado (DCS) y un liposarcoma desdiferenciado (DDL). Barra de escala a 100 m. (C) La subpoblación de células HLA-1-negativas se aisló mediante citometría de flujo con un método de doble ordenación. De arriba abajo: primera clasificación, segunda clasificación y comprobación de pureza. Las células aisladas HLA-1-negativas y HLA-1-positivas fueron sometidas a un análisis funcional posterior, incluyendo un ensayo de formación tumoral. Los resultados de esta cifra son de una publicación anterior12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg"> Figura 2: Caracterización de LOS TIC HLA-1-negativos mediante ensayos funcionales. (A) Un ensayo de formación de esferas mostró que tan solo 10 células HLA-1-negativas eran capaces de formar esferas de sarcoma. Izquierda: imágenes representativas de esferas de sarcoma. Derecha: frecuencia de formación de esferas; Media : SD. Barra de escala de100 m. (B ) Las células HLA-1-negativas aisladas del sarcoma PDX eran altamente tumorigénicas. Aquí se muestran imágenes representativas del tumor formado por células HLA-1-negativas y -positivas de DDL. Se inyectaron mil células de células DDL HLA-1-negativas y HLA-1-positivas en flancos separados del mismo ratón. (C) Los niveles de ARNm de los genes de células madre Oct4, Nanogy Myc se expresaron en niveles más altos en células HLA-1-negativas en comparación con las células positivas de HLA-1. Los datos representan la media de SD (n s 5). (D) La fuerte tinción positiva de Aceite Rojo O y Alizarin Red S muestra una diferenciación terminal a lo largo de las vías lipogénicas y osteogénicas que se inducen a partir de TIC de sarcoma. (E) Inmunomanchación HLA-1 de PDX formadapor por subpoblaciones HLA-1-positivas (izquierda) y -negativas (derecha). Barra de escala a 100 m. Los resultados de esta cifra son de una publicación anterior12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos un protocolo detallado para el aislamiento de células que inician tumores de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma humano mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, utilizando el antígeno leucocito humano-1 (HLA-1) como marcador negativo, y para la validación y caracterización de estas células que inician tumores HLA-1 negativos.

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Descubrimos que el HLA-I está epigenéticamente regulado en una subpoblación de células cancerosas que exhiben propiedades de células madre y capacidad de iniciación de tumores. La regulación de la baja de HLA-I está directamente relacionada con la fuga inmune, proporcionando ventajas de supervivencia para las células madre cancerosas, por lo que la negatividad HLA-I es un marcador funcional preciso para estas células. Demostrando el procedimiento estará Sudeh Izadmehr, un postdoctorado de nuestro laboratorio.Tras la adquisición de la muestra, coloque el tejido en un plato Petri de 100 milímetros en un gabinete de seguridad bio esterilizado, y agregue 500 microlitros de PBS estéril al plato. Utilice un bisturí estéril para triturar mecánicamente el tejido en trozos pequeños hasta que ningún fragmento sea mayor de 0,1 milímetros. Transfiera todo el volumen de 500 microlitros de PBS a través de un colador de células de poro de 35 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros.Añadir otros 500 microlitros de PBS a los fragmentos de tejido, y picar los tejidos de nuevo. A continuación, filtre el sobrenadante a través del colador celular en el mismo tubo de recolección, y continúe picando las piezas de tejido hasta que la muestra esté completamente disociada. Cuando se haya recogido el último volumen de células, gire hacia abajo las células tumorales por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón de hemólisis.Después de cinco minutos a temperatura ambiente, recoger las células con otra centrifugación, y lavar el pellet con otros cinco mililitros de PBS. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS y cuente las células viables. Diluir las células a una vez 10 a las séptimas células por 200 microlitros de concentración de PBS en hielo, y añadir 200 microlitros de matriz de membrana sótano a las células con mezcla suave.A continuación, inyecte la matriz de membrana del sótano de suspensión celular por vía subcutánea en el flanco de un ratón gamma SCID scid, y compruebe el crecimiento del tumor en el lugar de inyección dos veces a la semana. Cuando el tumor alcance un centímetro de diámetro, corte el tumor por la mitad y fije la mitad del xenoinjerto con 4%paraformaldehído durante la noche para el análisis histológico. Procesar la segunda mitad del tumor como se acaba de demostrar para lograr una suspensión de una sola célula, y diluir las células a un dos veces 10 a las seis células por mililitro de PBS complementado con 5%fbS concentración.Mantener las células sobre hielo durante 30 minutos antes de dividir la suspensión celular entre un control de isotipo y un tubo de anticuerpos. Observe el número de células en cada tubo y mezcle las células del tubo de anticuerpos con anticuerpos anti-HLA y las células del tubo de control del isotipo con un anticuerpo de control anti-isotipo adecuado para una incubación de 90 minutos sobre hielo. Al final de la incubación, recoger ambas poblaciones celulares por centrifugación, seguido de dos lavados de PBS de 10 mililitros por centrifugación.Después del segundo lavado, vuelva a suspender los pellets en 10 microgramos por mililitro de DAPI a una concentración de una vez 10 a las siete células por mililitro. Luego filtre cada suspensión celular a través de un colador de poro de 35 micrómetros en tubos individuales de poliestireno de 12 por 75 milímetros. Después de la clasificación celular activada por fluorescencia, diluir las poblaciones de células HLA-I negativas y positivas a individuales una vez 10 a las concentraciones de células quintas en 15 mililitros del medio de crecimiento de la sarcosfera por subconjunto.Diluir en serie las células a una por 10 a la cuarta, 10 a la tercera, y 10 a la segunda concentración en 15 mililitros de medio de crecimiento de sarcosfera fresca por dilución, y añadir 100 microlitros de células de cada dilución a cada pozo de una placa de cultivo de 96 pozos de unión ultrabaja por dilución. Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono de 37 grados, monitoreando la formación de sarcosfera diariamente mediante microscopía de luz y agregando un factor de crecimiento fresco de fibroblastos básico y un factor de crecimiento epidérmico a cada pozo sin cambiar el medio cada tres días. Después de tres semanas, cuente el número de pozos sarcósfera-positivos y sarcósfera-negativos para cada dilución celular de células HLA-I-negativas y HLA-I-positivas para permitir el cálculo de la frecuencia celular formadora de esferas basada en una distribución de probabilidad de Poisson.Típicamente, los xenoinjertos de sarcoma derivados del paciente humano consisten en dos poblaciones distintas HLA-I-positivas y negativas, con una histología similar a la demostrada por el tumor primario parental. La clasificación celular activada por fluorescencia de células de iniciación tumoral de xenoinjerto derivadas del sarcoma, como se ha demostrado, facilita el enriquecimiento de un alto número de células HLA-I negativas de la población de células parentales. Las células HLA-I negativas son capaces de formar esferas con una entrada inicial de tan solo 10 células y presentan una mayor capacidad de formación de tumores que el paciente de sarcoma positivo HLA-I llegó a las células que inician tumores de xenoinjerto.La inyección del mismo número de células negativas y positivas HLA-I por vía subcutánea en los flancos opuestos del mismo ratón demuestra que las células HLA-I negativas poseen una capacidad de formación tumoral significativamente mayor. Mientras que los xenoinjertos formados por subpoblaciones negativas y positivas de HLA-I son tumores heterogéneos celularmente. Además, el análisis de expresión génica de las células que inician tumores revela que las células HLA-I-negativas expresan marcadores de diferenciación de células madre y pueden ser inducidas a diferenciar a lo largo de vías lipogénicas y osteogénicas, demostrando una fuerte tinción y cultivo de aceite-rojo-O y Alizarin-Rojo-S.Este método se puede utilizar para aislar las células madre cancerosas en varios tipos de cáncer humano. La carbonización molecular, por ejemplo, mediante la secuenciación de próxima generación puede revelar marcadores comunes para apuntar a las células terapéuticamente. Nuestro descubrimiento demuestra que la restauración del HLA-I es un paso crítico para el éxito de las estrategias de aumento de células inmunitarias de la unidad funcional.

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