Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

Descubrimos que el HLA-I está epigenéticamente regulado en una subpoblación de células cancerosas que exhiben propiedades de células madre y capacidad de iniciación de tumores. La regulación de la baja de HLA-I está directamente relacionada con la fuga inmune, proporcionando ventajas de supervivencia para las células madre cancerosas, por lo que la negatividad HLA-I es un marcador funcional preciso para estas células. Demostrando el procedimiento estará Sudeh Izadmehr, un postdoctorado de nuestro laboratorio.

Tras la adquisición de la muestra, coloque el tejido en un plato Petri de 100 milímetros en un gabinete de seguridad bio esterilizado, y agregue 500 microlitros de PBS estéril al plato. Utilice un bisturí estéril para triturar mecánicamente el tejido en trozos pequeños hasta que ningún fragmento sea mayor de 0,1 milímetros. Transfiera todo el volumen de 500 microlitros de PBS a través de un colador de células de poro de 35 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros.

Añadir otros 500 microlitros de PBS a los fragmentos de tejido, y picar los tejidos de nuevo. A continuación, filtre el sobrenadante a través del colador celular en el mismo tubo de recolección, y continúe picando las piezas de tejido hasta que la muestra esté completamente disociada. Cuando se haya recogido el último volumen de células, gire hacia abajo las células tumorales por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón de hemólisis.

Después de cinco minutos a temperatura ambiente, recoger las células con otra centrifugación, y lavar el pellet con otros cinco mililitros de PBS. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS y cuente las células viables. Diluir las células a una vez 10 a las séptimas células por 200 microlitros de concentración de PBS en hielo, y añadir 200 microlitros de matriz de membrana sótano a las células con mezcla suave.

A continuación, inyecte la matriz de membrana del sótano de suspensión celular por vía subcutánea en el flanco de un ratón gamma SCID scid, y compruebe el crecimiento del tumor en el lugar de inyección dos veces a la semana. Cuando el tumor alcance un centímetro de diámetro, corte el tumor por la mitad y fije la mitad del xenoinjerto con 4%paraformaldehído durante la noche para el análisis histológico. Procesar la segunda mitad del tumor como se acaba de demostrar para lograr una suspensión de una sola célula, y diluir las células a un dos veces 10 a las seis células por mililitro de PBS complementado con 5%fbS concentración.

Mantener las células sobre hielo durante 30 minutos antes de dividir la suspensión celular entre un control de isotipo y un tubo de anticuerpos. Observe el número de células en cada tubo y mezcle las células del tubo de anticuerpos con anticuerpos anti-HLA y las células del tubo de control del isotipo con un anticuerpo de control anti-isotipo adecuado para una incubación de 90 minutos sobre hielo. Al final de la incubación, recoger ambas poblaciones celulares por centrifugación, seguido de dos lavados de PBS de 10 mililitros por centrifugación.

Después del segundo lavado, vuelva a suspender los pellets en 10 microgramos por mililitro de DAPI a una concentración de una vez 10 a las siete células por mililitro. Luego filtre cada suspensión celular a través de un colador de poro de 35 micrómetros en tubos individuales de poliestireno de 12 por 75 milímetros. Después de la clasificación celular activada por fluorescencia, diluir las poblaciones de células HLA-I negativas y positivas a individuales una vez 10 a las concentraciones de células quintas en 15 mililitros del medio de crecimiento de la sarcosfera por subconjunto.

Diluir en serie las células a una por 10 a la cuarta, 10 a la tercera, y 10 a la segunda concentración en 15 mililitros de medio de crecimiento de sarcosfera fresca por dilución, y añadir 100 microlitros de células de cada dilución a cada pozo de una placa de cultivo de 96 pozos de unión ultrabaja por dilución. Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono de 37 grados, monitoreando la formación de sarcosfera diariamente mediante microscopía de luz y agregando un factor de crecimiento fresco de fibroblastos básico y un factor de crecimiento epidérmico a cada pozo sin cambiar el medio cada tres días. Después de tres semanas, cuente el número de pozos sarcósfera-positivos y sarcósfera-negativos para cada dilución celular de células HLA-I-negativas y HLA-I-positivas para permitir el cálculo de la frecuencia celular formadora de esferas basada en una distribución de probabilidad de Poisson.

Típicamente, los xenoinjertos de sarcoma derivados del paciente humano consisten en dos poblaciones distintas HLA-I-positivas y negativas, con una histología similar a la demostrada por el tumor primario parental. La clasificación celular activada por fluorescencia de células de iniciación tumoral de xenoinjerto derivadas del sarcoma, como se ha demostrado, facilita el enriquecimiento de un alto número de células HLA-I negativas de la población de células parentales. Las células HLA-I negativas son capaces de formar esferas con una entrada inicial de tan solo 10 células y presentan una mayor capacidad de formación de tumores que el paciente de sarcoma positivo HLA-I llegó a las células que inician tumores de xenoinjerto.

La inyección del mismo número de células negativas y positivas HLA-I por vía subcutánea en los flancos opuestos del mismo ratón demuestra que las células HLA-I negativas poseen una capacidad de formación tumoral significativamente mayor. Mientras que los xenoinjertos formados por subpoblaciones negativas y positivas de HLA-I son tumores heterogéneos celularmente. Además, el análisis de expresión génica de las células que inician tumores revela que las células HLA-I-negativas expresan marcadores de diferenciación de células madre y pueden ser inducidas a diferenciar a lo largo de vías lipogénicas y osteogénicas, demostrando una fuerte tinción y cultivo de aceite-rojo-O y Alizarin-Rojo-S.

Este método se puede utilizar para aislar las células madre cancerosas en varios tipos de cáncer humano. La carbonización molecular, por ejemplo, mediante la secuenciación de próxima generación puede revelar marcadores comunes para apuntar a las células terapéuticamente. Nuestro descubrimiento demuestra que la restauración del HLA-I es un paso crítico para el éxito de las estrategias de aumento de células inmunitarias de la unidad funcional.