Inmunoprecipitación de cromatina nativa usando neuroesferas del Tumor de cerebro murino

El objetivo general de este procedimiento es identificar el enriquecimiento de las marcas de histonas en una ubicación genómica específica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como cómo las mutaciones en los reguladores epigenéticos que alteran las modificaciones de las histonas afectan al transcriptoma de las células tumorales. La principal ventaja de esta técnica es que las células no están reticuladas, por lo que se encuentran en un estado más natural, lo que puede ayudar a la especificidad de los anticuerpos.

Comience por diseccionar el tumor inducido experimentalmente del cerebro de un ratón en una placa de Petri de 10 centímetros. Si el tumor expresa una proteína fluorescente, visualice el tumor a través de un microscopio de disección fluorescente ajustado al canal fluorescente apropiado con un aumento de 0,3 veces. Use un bisturí y fórceps para separar el tejido tumoral del cerebro normal y pique el tumor en pedazos pequeños en la placa de Petri.

Transfiera el tumor disecado a un tubo de 1,5 mililitros con 300 microlitros de medio NSC y use una jeringa desechable para homogeneizar suavemente el tumor. A continuación, se añade un mililitro de medio de desprendimiento de células, y se incuba la muestra durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micras a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

A continuación, lavar el colador con 25 mililitros de medio NSC y centrifugar la suspensión a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de decantar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en seis mililitros de medio NSC y transfiera la suspensión de células tumorales a un matraz de cultivo T25. Cultive las células a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos con una atmósfera de 95% de aire y 5% de dióxido de carbono hasta que se formen las neurosferas.

Una vez recolectadas las neurosferas, centrifugar una vez 10 a las seis células de la neurosfera por precipitación de aminoácidos a 300 veces G durante cinco minutos. Después de centrifugar, decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la neurosfera en un mililitro de solución salina equilibrada. Transfiera la suspensión a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros de baja unión a proteínas y luego centrifugue como antes.

A continuación, decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 95 microlitros de tampón de digestión, suplementado de uno a 100 con cóctel de inhibidores de proteasa por uno por 10 las seis células. Pipetea inmediatamente las células hacia arriba y hacia abajo para evitar que se aglomeren y evitar la creación de burbujas. A continuación, mezcle cinco microlitros de nucleasa microcócica 0,1X en 145 microlitros de tampón de digestión y añada cinco microlitros de nucleasa microcócica diluida por uno por 10 a las seis células.

Agite el tubo para mezclar y colóquelo en un bloque de calor de 37 grados centígrados durante exactamente 12 minutos. La digestión de la nucleasa microcócica para fragmentar la cromatina es el paso más crítico. La fragmentación adecuada de la cromatina es importante para lograr una alta resolución para ChIP.

Para asegurarse de que el paso sea exitoso, incube varias muestras una a la vez para asegurarse de que no se produzca una digestión excesiva. Después de 12 minutos, agregue 10 microlitros de tampón de parada de nucleasa microcócica 10X por uno por 10 a las seis celdas. A partir de este momento, las muestras deben mantenerse en hielo.

El análisis del bioanalizador de la muestra digerida de nucleasa microcócica demuestra que la mayor parte del ADN se ha fragmentado en mononucleosomas, di y trinucleosomas. A continuación, agregue 110 microlitros de tampón ripa 2X suplementado de uno a 100 con cóctel de inhibidores de proteasa por uno por 10 a las seis celdas. Agite el tubo para mezclar, luego centrifugue durante 15 minutos a cuatro grados Celsius en 1700 veces G. Transfiera el sobrenadante que contiene la cromatina a un tubo de microcentrífuga regular de 1,5 mililitros y colóquelo en hielo.

Utilice tampón ripa suplementado con inhibidores de la proteasa a uno por 1000 para diluir la cromatina, de modo que cada IP tenga un volumen de 100 a 200 microlitros. A continuación, elimine una alícuota equivalente al 10% del volumen ChIP como muestra de entrada. Prepare la entrada agregando 100 microlitros de tampón TE suplementado con proteinasa K, e incube a 55 grados centígrados durante una hora.

Después de purificar la entrada con un kit de purificación de PCR, mida la concentración de la entrada con un espectrofotómetro de microvolúmenes. Registre los resultados en un cuaderno. Añadir 10 microlitros de perlas magnéticas de proteína A y G lavadas por IP que se realizará en cada muestra, e incubar durante una hora a 4 grados centígrados con rotación a 20 RPM.

Coloque la muestra en un soporte magnético y deje que las perlas se separen, luego transfiera el volumen requerido a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Agregue el anticuerpo deseado a cada tubo y luego envuelva las tapas con una película plástica de parafina para evitar la evaporación. Incubar las muestras durante la noche a 4 grados centígrados con rotación como antes.

Al día siguiente, gire los tubos a 2000 veces G durante 10 segundos, luego agregue 10 microlitros de perlas a cada IP e incube durante 3 horas a 4 grados centígrados con rotación a 20 RPM. Luego, coloque las muestras en un soporte magnético y permita que las perlas magnéticas se separen. Use una pipeta para eliminar el sobrenadante, luego agregue 150 microlitros de tampón ripa con inhibidores de proteasa a cada IP e incube a 4 grados Celsius a 20 RPM durante cinco minutos.

Después del período de incubación, coloque las muestras en un soporte magnético y permita que las perlas magnéticas se separen. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante, luego agregue 150 microlitros de tampón de cloruro de litio suplementado con inhibidores de la proteasa a baja concentración a cada IP, e incube a 4 grados Celsius con rotación a 20 RPM durante cinco minutos. Después del período de incubación, coloque las muestras en un soporte magnético y deje que las perlas magnéticas se separen, luego use una pipeta para eliminar el sobrenadante.

Luego, agregue 150 microlitros de TE frío sin inhibidores de proteasa a las perlas e incube a 4 grados centígrados con rotación a 20 RPM durante cinco minutos. Después del paso de lavado final, vuelva a suspender la muestra en 100 microlitros de tampón TE suplementado con la concentración final de 0,5 miligramos por mililitro de proteinasa K, e incube a 55 grados centígrados durante una hora. Por último, purifique el ADN precipitado amino utilizando un kit de purificación por PCR.

A continuación, para comprobar si el IP es exitoso, se realizó una qPCR con cebadores dirigidos a las regiones de control positivas y negativas. La qPCR se realizó con ADN ChIP IGG, ADN ChIP trimetilado histona-3-liceno-4-trimetilado y ADN ChIP trimetilado con histona-3-liceno-27-trimetetilado, utilizando cebadores para gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa. Los resultados representativos demuestran que Gapdh, un gen de limpieza, solo se enriquece con la modificación H3K4me3 asociada con la transcripción activa, y no con la modificación H3K27me3 asociada con la cromatina reprimida.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ChIP-C para identificar cambios en las marcas de histonas en todo el genoma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar ChIP nativo en neuroesferas para identificar la marca de histonas en sitios genéticos específicos.