Name: Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende fotoconversión de células individuales en pez cebra vivo usando la proteína Eos. Este método mínimamente invasivo permite visualizar la migración celular y estudiar procesos del desarrollo en tiempo real.

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Agradecemos a Bernard Kulemaka y miembros del laboratorio de Smith por sus comentarios útiles y orientación de reactivo, Sam Connell y Brent Redford de 3i para enviar imágenes preguntas y Deborah Bang, Karen Heed y Kay Stewart para el cuidado del pez cebra. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Notre Dame, la Elizabeth y Michael Gallagher Family, el Alfred P. Sloan Foundation, centro de investigación de pez cebra en la Universidad de Notre y centro de las células madre y medicina regenerativa en la Universidad de Notre Dame. Todos los estudios en animales se realizaron en cumplimiento de la Universidad de Notre Dame IACUC Dr. Cody Smith.

Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Notre Dame Animal cuidado institucional y Comité de uso.
1. preparación de la muestra de pez cebra
<ol><li>Coloque un macho adulto y una Tg femenino adulto (proteína convertible) en una cámara de acoplamiento por procedimientos estándar13. En este manuscrito, utilice Tg(sox10:eos) de pescado9 por acceso pero otras líneas transgénicas con proteínas de photoconvertible puede ser utilizado igualmente. Configurar más de una cámara en caso de que no ponga el pescado. Permita que el pescado permanezca en la cámara durante la noche.</li>
	<li>A la mañana siguiente, recoger los huevos en cajas Petri de 100 mm. Permiten huevos madurar a la fertilización después de 24 h (hpf) antes de la proyección.</li>
	<li>Si arriba los animales eran heterocigotos para el transgen, platos de pantalla 24 hpf embriones Tg(sox10:eos) + con una fuente de luz nm y GFP 488 filtran de conjuntos en un microscopio de disección. Aislar Tg(sox10:eos) + embriones y dejar para madurar hasta 48 hpf.</li>
	<li>Dechorionate embriones manualmente con una aguja o unas pinzas.</li>
	<li>Preparar y microondas 5 mL de solución de agarosa de punto de bajo punto de fusión de 0,8%.<ol>
<li>Una vez que la agarosa es fría al tacto, lugar Tg anestesiados de 3-4 (sox10:eos) + 48 peces hpf en el centro de un cubreobjetos de cristal 10 mm plato de Petri de fondo.</li>
		<li>Añadir suficiente agarosa para cubrir la superficie del cubreobjetos, aproximadamente 1 mL. Utilice una aguja de punta de prueba para arreglar pescado en sus lados. Permita que la agarosa se solidifique para asegurar el montaje de los animales. Puede ser necesario reorganizar continuamente el pez cebra hasta que el agar solidifica14. Solidificación tarda aproximadamente 2 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la agarosa ha solidificado por 2 min, lentamente agregar medio embrión que contiene 0.02% éster del ácido paraaminobenzoico (Metanosulfonato) a plato hasta que la superficie del fondo del agar y plato quede sumergida. Este debe ser aprox. 3mL.</li>
</ol>2. microscopio montaje y proyección de imagen de conversión previa
<ol><li>Confocal software abierto y seleccione las ventanas de captura y enfoque [figura 1]. Debajo de la ventana de captura, seleccione conversión específica de laboratorio de imagen bajo la captura ajuste desplegable pestaña [figura 1]. Aquí, el ajuste del laboratorio específico se llama "proyección de imagen de peces".</li>
	<li>Coloque el espécimen en ámbito confocal y enfocar con el curso y las perillas de ajuste fino.</li>
	<li>Abra la ventana de foco y localizar la región deseada de interés (es decir, los ganglios de raíz dorsal).</li>
	<li>Seleccione el láser c488 bajo el menú filtro. Ajustar la exposición a 300 m, laser de potencia a 5 e intensificar a 75 [figura 2].</li>
	<li>Marque la casilla 3D en la sección tipo de captura . En la sección 3D de captura , seleccione posición actual y Compruebe la gama alrededor de corriente. En la misma sección, establecer el rango a 35, el número de aviones a 36 y el tamaño de paso 1. La gama puede aumentarse o disminuirse para acomodar la profundidad de la zona de proyección de imagen. Para la médula espinal un valor entre 35-40 pilas normalmente es suficiente [figura 5].</li>
	<li>Seleccione la ubicación actual [figura 5].</li>
	<li>Haga clic en Inicio en la parte inferior de la ventana de captura para adquirir imagen.</li>
</ol>3. single-cell Photoconversion
<ol><li>Confocal software abierto y seleccione las ventanas de captura y enfoque [figura 1]. Debajo de la ventana de captura, seleccione conversión específica de laboratorio de imagen bajo la captura ajuste desplegable pestaña [figura 1]. Aquí, el ajuste del laboratorio específico se llama "Pescado ablar chip completo".</li>
	<li>Seleccione el láser c488 y c541 bajo el menú filtro. Si no utiliza el mismo software del microscopio, encontrar el menú para seleccionar diferentes láseres y seleccione el 488 nm y láseres de 541 nm. Establecer las exposiciones a 300 m, laser de potencia a 5 e intensificar a 75 [figura 2]. Estos ajustes del láser son seleccionados basado en la producción de suficiente señal fluorescente sin causar fotoblanqueo o toxicidad. Si se visualiza la toxicidad o el fotoblanqueo, reducir la potencia del láser o la exposición.</li>
	<li>Abra la ventana de foco y haga clic en la ficha de Fotomanipulación en la ventana de foco. Ajustar los parámetros del láser en consecuencia. Cambiar la potencia de la pila de láser a 2 y a continuación, haga clic en ir. Cambiar el tamaño de bloque de trama 1 y haga clic en establecer. Cambiar el tamaño de doble clic 4. Cambia la línea láser a v405 [figura 3].</li>
	<li>Abra la configuración avanzada de la captura en la ventana de captura. Seleccione la ficha de Fotomanipulación y cambiar las repeticiones haga doble clic en 2. Haga clic en aceptar [figura 4].</li>
	<li>Seleccione la ficha XY en la ventana de foco. Verifique los parámetros del láser del paso 2 en la ficha de Fotomanipulación [figura 3, figura 4]. Configuración de láser para photoconvert la célula de interés sin photoconversion de las células circundantes.<ol>
<li>Si hay photoconversion de las células adyacentes, reducir la potencia del láser. Si no se produce photoconversion de las células, se pueden aumentar potencias láser. Ajuste óptimo, energía del laser a photoconvert sólo la región de interés y alrededores no.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Marque la casilla de timelapse con tipo de captura. A continuación, haga clic en Inicio [figura 6A].</li>
	<li>Una vez que el timelapse en la ventana, seleccione la herramienta de círculo en la barra de herramientas superior [figura 7]</li>
	<li>Dibuja un círculo en la región más central de la célula. Haga clic con el botón derecho del círculo dibujado, seleccione región FRAPy espere 3 segundos. El área seleccionada debe convertirse en regulador [figura 8]. Haga clic en Detener captura.</li>
	<li>Si la proyección de imagen más de un animal, volver a la ficha XY en el menú de enfoque y posición seleccione 2. A continuación, repita los pasos 4.1-4.6.</li>
	<li>Para convertir a una población de células, siga los parámetros de protocolo y láser para pasos 4.1-4.4 excepto en lugar de dibujar un círculo para FRAP la región de interés, utilice la herramienta de línea. Trace una línea en la región de interés y FRAP la región utilizando los mismos parámetros mencionados anteriormente.</li>
</ol>4. post-photoconversion la proyección de imagen
<ol><li>Una vez que todos los puntos son photoconverted. Seleccionar la pila de imagen estándar de laboratorio específica ajuste descrito en el paso 3 la proyección de imagen de precoversion. Esto se encuentra bajo la captura ajuste desplegable pestaña en la ventana de captura [figura 5].</li>
	<li>Seleccione el láser c488 y ajustar la exposición a 300ms, laser de potencia a 5 e intensificar a 75 [figura 2].</li>
	<li>Seleccione el c541 láser en el mismo menú que el láser c488. Ajustar la exposición a 500 ms, laser de potencia de 10 e intensificar a 75 [figura 9].</li>
	<li>Marque la casilla 3D en la sección tipo de captura . En la sección 3D de captura , seleccione posición actual y Compruebe la gama alrededor de corriente. En la misma sección, establecer el rango a 35, el número de aviones a 36 y el tamaño de paso 1. El número de rango puede aumentar o disminuir para acomodar la profundidad de imagen deseada [figura 5].</li>
	<li>Si hay múltiples puntos en la ficha de atención XY, seleccione la opción lista multipunto en la ventana de captura. Si no, seleccione la ubicación actual.</li>
	<li>Haga clic en Inicio en la parte inferior de la ventana de captura para adquirir imagen.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En tejidos complejos, distintos tipos de células se organizan en dominios específicos. Recientemente se han utilizado técnicas a las células individuales de la etiqueta dentro de estos tejido grandes estructuras1,2,3. Aquí muestran dos técnicas que pueden utilizarse igualmente para visualizar las interacciones de la célula y las interacciones de población de células dentro de tejidos complejos. La ventaja de la técnica de photoc...

Varias celdas distintas interactúan para construir y mantener los tejidos animales y vegetales complejos. Estas células son a menudo intercalados y difíciles de distinguir de los vecinos a un nivel unicelular sin microscopía de alta resolución que requieren fijación del tejido. Sin embargo, para entender cómo estas forman los tejidos, se mantiene y se convierten en enfermos, ha sido esencial para investigar cómo solo las células dentro del tejido están interactuando con el tiempo. Idealmente, estos experimentos requieren el etiquetado de células individuales dentro de un tejido de una manera no invasiva sin necesidad de fijación. Los científicos ahora han desarrollado numerosas técnicas para lograr esta tarea1,2,3,4.
El descubrimiento y la aplicación de la proteína fluorescente de Medusa verde (GFP) es un enfoque interesante que permitió para el etiquetado de distintas células en un tejido medio ambiente1. Utilizando promotores específicos de la célula, es posible seleccionar genéticamente un subconjunto de las células que llevan la etiqueta1. Alternativamente, viral inducido expresión de GFP puede ser utilizado para la expresión seleccionada por el usuario de GFP3,4. Aunque muy útil, expresión génica mediada de GFP no permite expresión seleccionada por el usuario dentro de un subconjunto de las células en el tejido; y viral expresión de GFP, aunque ventajosa, puede ser invasivo. Con la llegada de los derivados GFP y técnicas inteligentes como Brainbow para expresar distintas proteínas fluorescentes más escasamente en los tejidos, es posible visualizar las células y las interacciones entre ellos en el complejo tejido2, 5. sin embargo, estos enfoques etiqueta de células al azar. Si el experimento deseado requiere la visualización de una sola célula o población de células que se define por el experimentador, por lo tanto son limitados. Con tales experimentos, sería ventajoso tener una proteína fluorescente genéticamente expresa que puede ser manipulada para distinguir, en forma unicelular, de otras células fluorescentes y no fluorescentes.
Para alcanzar esta meta y visualizar la biología celular de las células en un tejido complejo de la vida, la comunidad científica utiliza photoconversion unicelular de diferentes proteínas fluorescentes6,7,8. Utilizando genéticamente controlada expresión de una proteína photoconvertible (es decir, eos, kaede, etc.) que las transiciones de un verde a rojo estado fluorescente cuando se exponen a los rayos UV (488 nm) luz, podemos distinguir una sola célula de su fluorescencia marcada vecinos6,7,8. Este enfoque utiliza un aparato conectado a nuestro microscopio confocal que puede dirigir la luz de una pila de láser a una región limitada de la difracción de interés. Con esta técnica, o bien podemos etiquetar las células o poblaciones más grandes en una manera definida por el usuario9,10,11. La técnica es mínimamente invasiva en comparación con las inyecciones de célula de GFP viral. Como una prueba de concepto, demostramos que podemos photoconvert las células dentro de un ganglio en el sistema nervioso periférico y photoconvert poblaciones más grandes como células situadas en el lado ventral de la médula espinal9,10, 11,12. Entonces podemos visualizar estas poblaciones de células de la photoconverted 24 h más tarde para ganar la penetración en su movimiento y diferenciación durante el desarrollo.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos) animales de pez cebra</td><td></td><td></td><td>Los peces se obtuvieron y cruzaron de las instalaciones de peces de la Universidad de Notre Dame Placa de</td></tr><tr><td>Petri de 100 X 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Medio embrionario</td><td></td><td></td><td>El medio embrionario se elabora semanalmente y es proporcionado por las instalaciones de peces de la Universidad de Notre Dame que contienen 5 litros de agua de ósmosis inversa, 30 litros de azul de metileno y 200 ml de sal.</td></tr><tr><td>0.8% Bajo punto de fusión Agarosa</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm placa de Petri con fondo deslizante de vidrio</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>Sonda</td><td></td><td></td><td></td>de disección con aguja</tr><tr><td>0,002% Éster de ácido 3-aminobenzoico (Tricaína)</td>Microscopio de disección fluorescente <td>A5040-250G</td><td></td> <td>analítico</td></tr><tr><td>de Fluka con filtros GFP</td><td>Microscopio confocal Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con láseres para excitar los juegos de filtros GFP y RFP</td><td>Disco giratorio 3i confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz UV (láser) para fotoconversión</td> láser <td></td><td></td><td>de 405 nm</td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sola célula photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Tejido animal y vegetal se compone de distintas poblaciones de células. Estas células interactúan en el tiempo para construir y mantener los tejidos y pueden causar enfermedad cuando interrumpió. Los científicos han desarrollado técnicas inteligentes para investigar las características y dinámica natural de estas células dentro del tejido intacto por expresión de proteínas fluorescentes en subconjuntos de células. Sin embargo, a veces, los experimentos requieren más seleccionado visualización de células dentro del tejido, a veces en la forma unicelular o población de células. Para lograr esto y visualizar las células dentro de una población de células, los científicos han utilizado sola célula photoconversion de proteínas fluorescentes. Para demostrar esta técnica, aquí mostramos cómo a la luz UV a una celda de Eos-expresión de interés en un intacto, vive de zebrafish. Entonces a la imagen de esas células de Eos+ photoconverted 24 h más tarde para determinar cómo ha cambiado en el tejido. Se describen dos técnicas: solo celular photoconversion y photoconversions de las poblaciones de la célula. Estas técnicas pueden utilizarse para visualizar las interacciones célula-célula, destino celular y diferenciación y migraciones celulares, lo que es una técnica que es aplicable en muchas de las preguntas biológicas.

Photoconversion de proteínas fluorescentes puede utilizarse para etiquetar las distintas células dentro de un tejido6. Para demostrar esto, Tg(sox10:eos) pescado9 fueron utilizados para expresar la proteína photoconvertible Eos en las secuencias reguladoras de sox10. Los animales Tg(sox10:eos) en 48 hpf fueron montados primero y luego reflejada para detectar cualquier photoconversion no específicos que puede haber ...

Aquí, presentamos un protocolo para mostrar cómo photoconversion celular se logra a través de la exposición Ultravioleta a áreas específicas que expresan la proteína fluorescente, Eos, en animales vivos.

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

El objetivo general de esta técnica de fotoconversión es distinguir las células individuales de un solo animal de otras poblaciones de células fluorescentes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el desarrollo en el campo y permitirnos visualizar la migración de una sola célula a lo largo del tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que es mínimamente invasiva y se puede utilizar para etiquetar células individuales o poblaciones más grandes.Además, el usuario puede seleccionar la región específica de interés y convertir la foto en el objetivo deseado. Después de aparearse con peces cebra transgénicos macho y hembra que expresan una proteína fotoconvertible y recolectar los huevos de acuerdo con el protocolo de texto, use un microscopio de disección con una fuente de luz de 488 nanómetros y conjuntos de filtros GFP para examinar embriones de 24 hpf. Con una aguja o pinzas, descorionar manualmente los embriones.Preparar en el microondas, cinco mililitros de solución de agarosa al 0,8% de bajo punto de fusión. Una vez que la agarosa se haya enfriado al tacto, coloque tres o cuatro peces transgénicos anestesiados sox10 eos positivos 48 hpf en el centro de una placa de Petri de fondo deslizante con cubierta de vidrio de diez milímetros. Agregue aproximadamente un milímetro o suficiente agarosa para cubrir la superficie del cubreobjetos.Luego, use una aguja de sonda para colocar los peces de lado, ajustándolos según sea necesario, mientras la agarosa se solidifica, lo que tomará unos dos minutos. Después de que la agarosa se haya solidificado durante dos minutos, agregue lentamente el medio embrionario que contenga 0,02% de éster de ácido aminobenzoico tricaína a la placa, hasta que la superficie inferior del agar y la placa se sumerja. Para realizar microscopía confocal, abra el software confocal y seleccione las ventanas de captura y enfoque.Para llevar a cabo imágenes previas a la conversión, en la ventana de captura y en la pestaña desplegable de configuración de captura, seleccione los parámetros de imagen. Aquí están los ajustes de pila específicos del laboratorio que se llaman, imágenes de peces. Coloque la muestra en el microscopio confocal y use las perillas de ajuste grueso y fino para enfocarla.A continuación, abra la ventana de enfoque y localice la región de interés deseada, como el ganglio de la raíz dorsal. En el menú de configuración de filtros, seleccione el láser c488, configure la exposición en 300 milisegundos, la potencia del láser en cinco y la intensificación en 75. A continuación, en la sección Tipo de captura, marque la casilla 3D.En la sección Captura 3D, seleccione usar la posición actual y compruebe el rango alrededor de la corriente. En la misma sección, establezca el rango en 35, el número de planos en 36 y el tamaño del paso en uno. Seleccione la ubicación actual y, a continuación, haga clic en Iniciar en la parte inferior de la ventana de captura para adquirir una imagen.Antes del proceso de fotoconversión, asegúrese de verificar dos y tres veces los parámetros del láser. A veces es necesario reajustar la configuración de conversión cuando la ventana de conversión está abierta. En la ventana de captura, en la pestaña desplegable de configuración de la ventana de captura, seleccione la configuración de imágenes de conversión específica del laboratorio.Aquí, la configuración específica del laboratorio se llama, fish abla, chip completo. En el menú de filtros establecido, seleccione los láseres c488 y c541. Establezca las exposiciones en 300 milisegundos, la potencia del láser en cinco y la intensificación en 75, lo que producirá suficiente señal fluorescente sin causar fotoblanqueo o toxicidad.En la ventana de enfoque, haga clic en la pestaña de fotomanipulación y cambie la potencia de la pila láser a dos y luego haga clic en ir. Cambie el tamaño del bloque ráster a uno y haga clic en establecer. A continuación, cambie el tamaño del doble clic a cuatro y la línea láser a v405.A continuación, en la ventana de captura, abra la configuración avanzada de captura. Seleccione la pestaña de fotomanipulación y cambie las repeticiones de doble clic a dos, luego haga clic en Aceptar. Seleccione la pestaña xy en la ventana de enfoque.En la pestaña de fotomanipulación, vuelva a comprobar los parámetros del láser. A continuación, establezca la configuración del láser para fotoconvertir la celda de interés, sin fotoconversión de las células circundantes. En Tipo de captura, marca la casilla de lapso de tiempo y, a continuación, haz clic en Iniciar.Una vez que se abra la ventana de lapso de tiempo en vivo, seleccione la herramienta de círculo en la barra de herramientas superior. Dibuje un círculo en la región más central de la celda y, a continuación, haga clic con el botón derecho en el círculo dibujado, seleccione Región FRAP y espere tres segundos. El área seleccionada debería volverse más tenue, cuando haga clic en detener la captura.Si toma imágenes de más de un animal, regrese a la pestaña xy en el menú de enfoque y seleccione la posición dos. A continuación, repite la fotoconversión. Para convertir una población de células, siga el protocolo y los perímetros láser abriendo la ventana de lapso de tiempo.Ahora, en lugar de dibujar un círculo para FRAP la región de interés, use la herramienta de línea para dibujar una línea en la región de interés. A continuación, FRAP la región utilizando los mismos parámetros que se acaban de demostrar. Una vez que todos los puntos se hayan fotoconvertido, en la pestaña desplegable de configuración de captura en la ventana de captura, seleccione la configuración de pila estándar específica del laboratorio descrita anteriormente en este video.Seleccione el láser c488 y establezca la exposición en 300 milisegundos, la potencia del láser en cinco y la intensificación en 75. Seleccione el láser c541 y ajuste la exposición a 500 milisegundos, la potencia del láser a diez y la intensificación a 75. En la sección de tipo de captura, marque la casilla 3D.En la sección Captura 3D, seleccione usar la posición actual y compruebe el rango alrededor de la corriente. En la misma sección, establezca el rango en 35, el número de planos en 36 y el tamaño del paso en uno. El número de rango puede aumentar o disminuir, para adaptarse a la profundidad de imagen deseada.Si hay puntos multiplicados en la pestaña de enfoque xy, en la ventana de captura, seleccione la opción de lista de varios puntos. Si no es así, seleccione la ubicación actual. Finalmente, en la parte inferior de la ventana de captura, haga clic en iniciar para adquirir una imagen.Estos paneles muestran una sola célula de conversión prefotogénica, dentro de un ganglio de un pez cebra transgénico, expresando la proteína eos fotoconvertible, bajo el control de la secuencia reguladora sox10. Después de la fotoconversión, eos estaba claramente presente dentro de la región de interés, mientras que no se marcaron células vecinas. Para demostrar la utilidad de esta técnica de fotoconversión, una población de células en el lado ventral de la médula espinal se expuso a la luz ultravioleta, utilizando una línea.Posteriormente, se tomaron imágenes que mostraban la proteína eos fotoconvertida en la región de la línea. La proteína eos no fotoconvertida fue visible en todas las demás áreas. Varias horas después de la fotoconversión, se tomaron imágenes idénticas que mostraban células eos positivas fotoconvertidas dispersas por toda la región de la médula espinal, tanto en la ubicación dorsal como en la ventral.Este hallazgo es consistente con la hipótesis de que las células espinales ventrales se reubicaron en ubicaciones dorsales. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en 30 a 45 minutos, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tomar una imagen posterior a la conversión para confirmar que su región de interés experimentó la fotoconversión.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las imágenes de lapso de tiempo, para observar la migración celular y la dinámica a lo largo del tiempo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo distinguir células individuales dentro de una población de células fluorescentes. No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar las precauciones necesarias al realizar este procedimiento.Por ejemplo, nunca mires directamente a la luz.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Microscopía multifotónica permite el control de fotones de baja energía con una penetración profunda óptica y fototoxicidad reducido. Se describe el uso de esta tecnología para el etiquetado de células vivas en embriones de pez cebra. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la foto-inducción de varias moléculas que responden a la luz.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

En este video, las técnicas para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporcionan. Time-lapse de imágenes se utiliza para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de...

Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

Aquí presentamos un método para el cambio fotoactivado de proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFPs) en embriones vivos de pez cebra y el seguimiento posterior de la proteína fotoconvertida en puntos temporales específicos durante el desarrollo. Esta metodología permite el monitoreo de eventos de biología celular subyacentes a diferentes procesos de desarrollo en un organismo vertebrado vivo.

Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra

Este video muestra el seguimiento del reclutamiento de leucocitos utilizando larvas de pez cebra transgénicas que expresan proteína fluorescente verde fotoconvertible. La preinyección de bacterias marcadas con colorante fluorescente rojo en la vesícula ótica e inducción de la fotoconversión permite observar la migración, fagocitosis y dispersión de los leucocitos en todo el cuerpo, lo que proporciona información valiosa sobre la dinámica de la respuesta inmunitaria.

Seguimiento de leucocitos basado en fotoconversión en pez cebra transgénico infectado por bacterias

El estudio de los primeros eventos de la progresión de células preneoplásicas y la interacción célula inmune innata es fundamental para entender y tratar el cáncer. Aquí se describe un método para inducir condicionalmente transformaciones de células epiteliales y la formación de imágenes en directo posterior de la interacción de células inmune innato con HRAS G12V expresando células de la piel en las larvas de pez cebra.

Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Establecimos el sistema fotoconvertible PSmOrange como una herramienta potente, sencilla y económica para el seguimiento de células in vivo en fondos transgénicos GFP. Este protocolo describe su aplicación en el sistema modelo de pez cebra.

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

Este protocolo describe un método para la photoconversion de Kaede proteína fluorescente en células endocárdicos de la vida del embrión de pez cebra que permite el seguimiento de células del Canal auriculoventricular durante canal atrio-ventricular y el desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón .

Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

Presentamos un protocolo eficiente y fácil de usar para la preparación de cultivos celulares primarios de células de embriones de pez cebra para transfección celular directo imágenes así como un protocolo para preparar células primarias del cerebro del pez cebra adulto.

Cultura y transfección de células primarias de pez cebra

Aprende fotoconversión de células individuales en pez cebra vivo usando la proteína Eos. Este método mínimamente invasivo permite visualizar la migración celular y estudiar procesos del desarrollo en tiempo real.

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

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