Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

El objetivo general de esta técnica de fotoconversión es distinguir las células individuales de un solo animal de otras poblaciones de células fluorescentes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el desarrollo en el campo y permitirnos visualizar la migración de una sola célula a lo largo del tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que es mínimamente invasiva y se puede utilizar para etiquetar células individuales o poblaciones más grandes.

Además, el usuario puede seleccionar la región específica de interés y convertir la foto en el objetivo deseado. Después de aparearse con peces cebra transgénicos macho y hembra que expresan una proteína fotoconvertible y recolectar los huevos de acuerdo con el protocolo de texto, use un microscopio de disección con una fuente de luz de 488 nanómetros y conjuntos de filtros GFP para examinar embriones de 24 hpf. Con una aguja o pinzas, descorionar manualmente los embriones.

Preparar en el microondas, cinco mililitros de solución de agarosa al 0,8% de bajo punto de fusión. Una vez que la agarosa se haya enfriado al tacto, coloque tres o cuatro peces transgénicos anestesiados sox10 eos positivos 48 hpf en el centro de una placa de Petri de fondo deslizante con cubierta de vidrio de diez milímetros. Agregue aproximadamente un milímetro o suficiente agarosa para cubrir la superficie del cubreobjetos.

Luego, use una aguja de sonda para colocar los peces de lado, ajustándolos según sea necesario, mientras la agarosa se solidifica, lo que tomará unos dos minutos. Después de que la agarosa se haya solidificado durante dos minutos, agregue lentamente el medio embrionario que contenga 0,02% de éster de ácido aminobenzoico tricaína a la placa, hasta que la superficie inferior del agar y la placa se sumerja. Para realizar microscopía confocal, abra el software confocal y seleccione las ventanas de captura y enfoque.

Para llevar a cabo imágenes previas a la conversión, en la ventana de captura y en la pestaña desplegable de configuración de captura, seleccione los parámetros de imagen. Aquí están los ajustes de pila específicos del laboratorio que se llaman, imágenes de peces. Coloque la muestra en el microscopio confocal y use las perillas de ajuste grueso y fino para enfocarla.

A continuación, abra la ventana de enfoque y localice la región de interés deseada, como el ganglio de la raíz dorsal. En el menú de configuración de filtros, seleccione el láser c488, configure la exposición en 300 milisegundos, la potencia del láser en cinco y la intensificación en 75. A continuación, en la sección Tipo de captura, marque la casilla 3D.

En la sección Captura 3D, seleccione usar la posición actual y compruebe el rango alrededor de la corriente. En la misma sección, establezca el rango en 35, el número de planos en 36 y el tamaño del paso en uno. Seleccione la ubicación actual y, a continuación, haga clic en Iniciar en la parte inferior de la ventana de captura para adquirir una imagen.

Antes del proceso de fotoconversión, asegúrese de verificar dos y tres veces los parámetros del láser. A veces es necesario reajustar la configuración de conversión cuando la ventana de conversión está abierta. En la ventana de captura, en la pestaña desplegable de configuración de la ventana de captura, seleccione la configuración de imágenes de conversión específica del laboratorio.

Aquí, la configuración específica del laboratorio se llama, fish abla, chip completo. En el menú de filtros establecido, seleccione los láseres c488 y c541. Establezca las exposiciones en 300 milisegundos, la potencia del láser en cinco y la intensificación en 75, lo que producirá suficiente señal fluorescente sin causar fotoblanqueo o toxicidad.

En la ventana de enfoque, haga clic en la pestaña de fotomanipulación y cambie la potencia de la pila láser a dos y luego haga clic en ir. Cambie el tamaño del bloque ráster a uno y haga clic en establecer. A continuación, cambie el tamaño del doble clic a cuatro y la línea láser a v405.

A continuación, en la ventana de captura, abra la configuración avanzada de captura. Seleccione la pestaña de fotomanipulación y cambie las repeticiones de doble clic a dos, luego haga clic en Aceptar. Seleccione la pestaña xy en la ventana de enfoque.

En la pestaña de fotomanipulación, vuelva a comprobar los parámetros del láser. A continuación, establezca la configuración del láser para fotoconvertir la celda de interés, sin fotoconversión de las células circundantes. En Tipo de captura, marca la casilla de lapso de tiempo y, a continuación, haz clic en Iniciar.

Una vez que se abra la ventana de lapso de tiempo en vivo, seleccione la herramienta de círculo en la barra de herramientas superior. Dibuje un círculo en la región más central de la celda y, a continuación, haga clic con el botón derecho en el círculo dibujado, seleccione Región FRAP y espere tres segundos. El área seleccionada debería volverse más tenue, cuando haga clic en detener la captura.

Si toma imágenes de más de un animal, regrese a la pestaña xy en el menú de enfoque y seleccione la posición dos. A continuación, repite la fotoconversión. Para convertir una población de células, siga el protocolo y los perímetros láser abriendo la ventana de lapso de tiempo.

Ahora, en lugar de dibujar un círculo para FRAP la región de interés, use la herramienta de línea para dibujar una línea en la región de interés. A continuación, FRAP la región utilizando los mismos parámetros que se acaban de demostrar. Una vez que todos los puntos se hayan fotoconvertido, en la pestaña desplegable de configuración de captura en la ventana de captura, seleccione la configuración de pila estándar específica del laboratorio descrita anteriormente en este video.

Seleccione el láser c488 y establezca la exposición en 300 milisegundos, la potencia del láser en cinco y la intensificación en 75. Seleccione el láser c541 y ajuste la exposición a 500 milisegundos, la potencia del láser a diez y la intensificación a 75. En la sección de tipo de captura, marque la casilla 3D.

En la sección Captura 3D, seleccione usar la posición actual y compruebe el rango alrededor de la corriente. En la misma sección, establezca el rango en 35, el número de planos en 36 y el tamaño del paso en uno. El número de rango puede aumentar o disminuir, para adaptarse a la profundidad de imagen deseada.

Si hay puntos multiplicados en la pestaña de enfoque xy, en la ventana de captura, seleccione la opción de lista de varios puntos. Si no es así, seleccione la ubicación actual. Finalmente, en la parte inferior de la ventana de captura, haga clic en iniciar para adquirir una imagen.

Estos paneles muestran una sola célula de conversión prefotogénica, dentro de un ganglio de un pez cebra transgénico, expresando la proteína eos fotoconvertible, bajo el control de la secuencia reguladora sox10. Después de la fotoconversión, eos estaba claramente presente dentro de la región de interés, mientras que no se marcaron células vecinas. Para demostrar la utilidad de esta técnica de fotoconversión, una población de células en el lado ventral de la médula espinal se expuso a la luz ultravioleta, utilizando una línea.

Posteriormente, se tomaron imágenes que mostraban la proteína eos fotoconvertida en la región de la línea. La proteína eos no fotoconvertida fue visible en todas las demás áreas. Varias horas después de la fotoconversión, se tomaron imágenes idénticas que mostraban células eos positivas fotoconvertidas dispersas por toda la región de la médula espinal, tanto en la ubicación dorsal como en la ventral.

Este hallazgo es consistente con la hipótesis de que las células espinales ventrales se reubicaron en ubicaciones dorsales. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en 30 a 45 minutos, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tomar una imagen posterior a la conversión para confirmar que su región de interés experimentó la fotoconversión.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las imágenes de lapso de tiempo, para observar la migración celular y la dinámica a lo largo del tiempo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo distinguir células individuales dentro de una población de células fluorescentes. No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar las precauciones necesarias al realizar este procedimiento.

Por ejemplo, nunca mires directamente a la luz.