Name: In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprende a medir la permeabilidad epitelial intestinal in vitro e in vivo mediante resistencia transepitelial y gavaje de FITC-dextran en ratones. Estas técnicas permiten estudiar enfermedades inflamatorias intestinales.

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Agradecemos al Dr. Jerrold R. Turner, del Hospital Brigham y de mujeres, escuela de medicina de Harvard, por su generosa ayuda en la realización de este estudio. Este trabajo es apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (número de licencia 81470804, 31401229 y 81200620), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (número BK20180838 y BK20140319), el programa de innovación de investigación para Graduados de Colegio de la provincia de Jiangsu (número de concesión KYLX16-0116), avanzado de investigación proyectos de Suchow Universidad (número SDY2015_06) y de Crohn & Colitis Fundación Premio de beca de investigación (concesión número 310801).

Este estudio fue aprobado por el cuidado Animal y uso protocolo de Cambridge-Suda genómica Resource Center (CAM-SU), Universidad de Suzhou.
1. revestimiento y mantenimiento de Caco-2bbe en las membranas de policarbonato porosas
<ol><li>Crecer las células en un frasco de T75 con medios de comunicación (DMEM con 10% FBS). Frascos deben ser alimentados con regularidad, dependiendo de la densidad celular. Nota: Para planchado óptimo, las células deben dividir rápidamente y tienen forma plana "frito-huevo", que indica que las células están en fase de crecimiento.</li>
	<li>Una vez las células confluentes de 80%, quitar la cubeta de la incubadora y sacar los medios de comunicación. Enjuague cualquier restos de medios con 1-2 mL de PBS estéril (sin Ca2 +). Pipetear 1,5 mL de tripsina-EDTA en el matraz y suavemente rock el matraz; Luego, coloque el matraz en la incubadora de 37 ° C por 20 min sin balancearse.</li>
	<li>Mientras que las células son trypsinizing, lugar inserta que contiene membranas de policarbonato porosas (tamaño del poro, μm 0.4; superficie, 0,33 cm2; véase Tabla de materiales) en placas de 24 pocillos. Añadir 1,0 mL de medios de cultivo en el compartimiento basal (el espacio inferior de la membrana).</li>
	<li>Pipeta 5 mL de medio en el matraz y vigorosamente pipetear las células contra el costado del frasco 5 - 10 veces lograr células sueltas, individuales o 2-3 células produce.</li>
	<li>
Placa de 0,166 mL de células (alcanzar una relación de dilución 1:8) en la cámara apical (el espacio superior de la membrana). Incubar a 37 ° C durante 3 semanas.
	<ol>
<li>Alimentar las células tres veces semanalmente aspirando cuidadosamente los medios de comunicación desde el compartimiento basal de cada bien utilizando una bomba de presión. Suavemente del goteo 1 mL de medios de comunicación en la cámara apical de cada inserto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. el uso de metro epitelial (voltios/ohmios) para la medición de TER
Nota: Después de 3 semanas de la cultura en las membranas de policarbonato, las células Caco-2BBe están listas para medición de TER.
<ol><li>Estudios del cytokine, un día antes de la medición, sustituir el medio basal con los medios de comunicación que contiene 10 ng/mL de IFNγ. En el día del experimento, sustituir los medios de comunicación con HBSS conteniendo 2,5 o 7,5 ng/mL de TNF. Nota: Tratamiento de IFNγ aumenta la expresión del receptor TNF 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>Para corregir el medidor, insertar el electrodo de corrección en el puerto de entrada y elija el modo de "Ohm". Ajuste el tornillo de ajuste de R con un destornillador hasta que el medidor muestra una lectura de 1.000 Ω.</li>
	<li>Esterilizar los electrodos colocándolos en etanol al 70% durante 15-30 min y luego déjelos al aire seco para 15 s. Enjuague el electrodo en los medios de cultivo experimental de la célula.</li>
	<li>Encienda y elegir el modo de "Ohm". Coloque con cuidado los extremos largos de los puentes del electrodo en el compartimiento basal y los extremos cortos hacia la cámara apical. Asegurar que los electrodos más toquen el fondo del plato, manteniendo los electrodos más cortos debajo de la superficie de los medios de comunicación, pero por encima de las inserciones de cultivo de tejidos. Mantenga los electrodos verticales.</li>
	<li>Mida la resistencia de la muestra inserciones inserciones en blanco (es decir, la cultura se inserta sin células con HBSS) en 0, 1, 2, 3, 4 h después del tratamiento del cytokine. Expediente de la resistencia.</li>
	<li>Para lograr consistencia en placa diferentes formatos, calcular el producto de la resistencia y el área efectiva de la membrana: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> Para insertos de 24 pocillos, el área efectiva de la membrana es de 0,33 cm2.</li>
</ol>3. ratón modelo de sodio sulfato de dextrano (DSS)-Colitis inducida
<ol><li>Añadir DSS para esterilizar agua a una concentración final de 3,5% (peso/vol).</li>
	<li>Administrar 3,5% DSS a ratones C57BL/6 machos de 8 semanas de edad para un total de 7 días. Dar agua potable regular sin DSS a los ratones de control.<ol>
<li>Cambiar el agua que contiene el DSS para regular agua potable después de día 7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pesar ratones y evaluar resultados clínicos de cada ratón cada día. Normalizar el peso de cada ratón a su peso corporal inicial. Puntuaciones se definen según la severidad de la enfermedad por cuatro parámetros: prolapso rectal (0-2), consistencia de las heces (0-2), sangrado (0-2) y actividad (0-2)5. Suma las puntuaciones de estos parámetros para un resultado clínico final.</li>
	<li>Para analizar la condición histopatológica del tejido del colon, eutanasia ratones por inyección intraperitoneal (i.p.) con 1.2% (vol/vol) Avertin (peso corporal de 0.6 mL/10 g) 7 días post-DSS tratamiento. Para preparar un stock de 100% avertin, mezcle 10 g de 2,2,2-tribromoethanol con 10 ml de alcohol tert-amílico.  Almacenar en la oscuridad a 4° C. Para usar, Diluya el stock de 100% a 2% en agua.</li>
	<li>Aislar el colon y el ciego y medir la longitud del colon5.</li>
	<li>Cortar segmentos de 0.5 cm de colon distal y el fix en un tubo falcon de 15 mL que contiene 10 mL de formalina al 10% durante la noche. Lavar los tejidos fijos con etanol graduado (75, 95 y 100%) y el xileno. Incrustar los tejidos en parafina y cortar secciones de 6 mm para la hematoxilina &amp; eosina, tinción de8.</li>
</ol>4. medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en ratones de la Colitis inducida por DSS
<ol><li>Medir la permeabilidad de la barrera 7 días después del comienzo de la administración de DSS.</li>
	<li>En el día del ensayo, rápido ratones durante 3 horas.</li>
	<li>Autoclave mediante una sonda aguja para garantizar la esterilidad, luego por sonda nasogástrica ratones con 150 μL 80 mg/mL 4 kDa FITC-los dextranos en agua estéril y mantener el FITC-dextrano no utilizado para medir la curva estándar después de la recolección de suero. Peso de los ratones para el cálculo de permeabilidad. Nota: La solución de FITC-los dextranos debe hacerse en agua.</li>
	<li>Con un par de tijeras, clip un trozo de 1 cm de la cola y recoger 100 μl de sangre de la cola en tubos de suero. Centrifugado de la sangre recogida a 10.000 x g por 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluir el suero 1:4 en agua. Para hacer un estándar de la curva, diluir FITC-dextrano no utilizado con agua en 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000, 1:10, 000, 1:30, 000, 1: 100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000 y 1:3, 000, 000. Añadir 100 μL/pocillo de suero y las muestras de la curva estándar en placas de 96 pocillos.</li>
	<li>Leer la fluorescencia en un lector de placas con 485 emisión excitación/528. Calcular los valores de permeabilidad basados en la curva estándar y multiplicar por 4 para corregir para la dilución.</li>
	<li>Dividir la concentración de FITC-los dextranos por el peso para normalizar los valores (esto ayuda a normalizar la diferencia en entrega de FITC-los dextranos si ratones están enfermos y han perdido peso).</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Hay varios pasos críticos en el protocolo. Las células Caco-2BBe (cepillo expresando de frontera) siempre se utilizan para la medición de la TER, seleccionado a partir de la línea celular Caco-2 expresión de proteínas del borde en cepillo. Las células Caco-2BBe tienen un fenotipo de la vellosidad absortiva cuando totalmente diferenciadas (aproximadamente 3 semanas después de la confluencia de cultura)17. Es necesario para evitar la contaminación durante la medición y para esterilizar el electrodo....

Células epiteliales intestinales no sólo son responsables de la absorción de nutrientes, pero también forman una barrera importante para defenderse de los microorganismos patógenos y toxinas microbianas. Esta función de barrera intestinal está regulada por la permeabilidad de la ensambladura apretada y célula epitelial integridad1,2,3, y la disfunción de la función de barrera epitelial se asocia con inflamatoria intestinal enfermedad (EII). El anillo de actomyosin de perijunctional (PAMR) se encuentra dentro de la célula que es estrechamente contigua a las ensambladuras apretadas. La contracción de PAMR, regulado por la cadena ligera de miosina (MLC), es crucial para la regulación de la ensambladura apretada permeabilidad4,5,6,7,8, 9,10. Factor de necrosis tumoral (TNF) es central a la pérdida de la barrera intestinal por regular expresión de cinasa (MLCK) MLC epitelial intestinal e inducir occludin internalización11,12,13.
Iones tales como Na+ y Cl– puede cruzar el espacio paracelular por el poro o fuga vía14. En un epitelio "agujereado", cambios en TER reflejan principalmente la permeabilidad alterada ensambladura apretada. Medición de TER es un enfoque electrofisiológico utilizado para cuantificar la permeabilidad de la ensambladura apretada, sobre todo a Na+ y Cl-, basada en la impedancia de monocapas de células. Tipos de diversas células, incluyendo células epiteliales intestinales, las células epiteliales pulmonares y las células endoteliales vasculares, se han divulgado para mediciones de TER. Ventajas de este método son que las mediciones de TER son no invasivos y pueden utilizarse para supervisar células vivas en tiempo real. Además, la técnica de medición de TER es útil para drogas toxicidad estudios15.
Las células Caco-2BBe son células de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano con una estructura y función similar a las células epiteliales intestinales pequeñas diferenciadas: por ejemplo, estas células tienen microvellosidades y enzimas asociadas con pequeño cepillo intestinal frontera. Por lo tanto, monocapas de Caco-2BBe cultivadas se utilizan como modelo para las pruebas de función de la barrera en vitro .
En ratones, una forma de estudio de permeabilidad intestinal paracelular es mediante la medición de la capacidad de FITC-los dextranos para cruzar desde el lumen a la sangre. Por lo tanto, la permeabilidad intestinal puede ser evaluada por gavaging FITC-los dextranos directamente en ratones y medir la fluorescencia dentro de la sangre. El siguiente protocolo describe dos métodos simples para evaluar la permeabilidad del epitelio intestinal in vitro e in vivo.

<table><tbody><tr><td>Aguja de sonda nasogástrica de 22 G</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dextrano</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Negro Placas de 96 pocillos para fluorescencia</td><td>Ratones Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6</td><td>Instituto de Investigación Biomédica de Nanjing de la Universidad</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>Células Caco-2BBe</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano sódico</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>DMED con alto contenido de glucosa y piruvato de sodio</td><td>Hipón</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>Medidor epitelial (voltios/ohmios)</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm QuímicoReactivo</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de halcón (15 mL)</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorómetro</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM de glucosa&nbsp;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Centro Modular de Inclusión de Tejidos</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de recolección de suero</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75 matraz</td><td>corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de policarbonato (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de presión</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Microtomía rotativa</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sinopharm QuímicoReactivo</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial intestinal

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

La barrera intestinal defiende contra microorganismos patógenos y toxinas microbianas. Su función está regulada por permeabilidad ensambladura apretada y la integridad de la célula epitelial, y alteración de la función de barrera intestinal contribuye a la progresión de la enfermedad gastrointestinal y sistémica. Aquí se describen dos métodos simples para medir la permeabilidad del epitelio intestinal. In vitro, las células Caco-2BBe se platean en los pocillos de cultivo de tejidos como una monocapa y resistencia eléctrica transepitelial (TER) puede ser medida por un medidor de epitelial (voltios/ohmios). Este método es convincente debido a su utilización y capacidad de repetición. En vivo, los ratones son gavaged con 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano y las concentraciones de FITC-los dextranos se miden en las muestras de suero recogidas en ratones para determinar la permeabilidad epitelial. Sonda oral proporciona una dosis precisa y por lo tanto es el método preferido para medir la permeabilidad intestinal en vivo. Tomados juntos, estos dos métodos pueden medir la permeabilidad del epitelio intestinal in vitro e in vivoy por lo tanto ser utilizados para estudiar la conexión entre enfermedades y función de la barrera.

En la cultura, las células Caco-2BBe crecen como una monocapa y lentamente se diferencian en enterocitos absorbentes maduras cepillo bordes. En este protocolo, las células Caco-2BBe fueron plateadas con una alta densidad en las membranas de policarbonato, y las células alcanzaron confluencia 100% un día después de la siembra. Sin embargo, las células son indiferenciadas en esta etapa: distinguir completamente las células, los medios de comunicación se cambiaron cada 2-3 días durante 3 sem...

Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

El objetivo general de este experimento es estudiar las enfermedades causadas por la disfunción de la barrera epitelial midiendo la permeabilidad de las células epiteliales intestinales in vitro e in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la función de barrera intestinal, como las relacionadas con la enfermedad inflamatoria intestinal. La principal ventaja de esta técnica es que la permeabilidad de las células epiteliales intestinales se puede evaluar tanto in vitro como in vivo.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de enfermedades gastrointestinales, porque la disfunción de la barrera epitelial intestinal contribuye a esas enfermedades. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de barrera intestinal, también se puede aplicar a otros sistemas, tales como estudios de toxicidad de fármacos y la integridad de la barrera de otros tipos de células. La demostración visual de este método es crítica, ya que algunos pasos son difíciles de aprender.Una operación precisa de este método ahora se puede entender por descripción textual. Para empezar, haga crecer células caco-2bbe en un matraz T75 con medio. Alimentar los matraces regularmente, dependiendo de la densidad celular.Cuando las células sean 80%confluentes, retire el medio y utilice 1-2 mililitros de PBS estéril sin calcio para enjuagarlas. Añadir 1,5 mililitros de Trypsin-EDTA, y balancear suavemente el matraz. A continuación, colóquelo en la incubadora de 37 grados Celsius durante 20 minutos, sin balancearse.Mientras que las células son tripsinas, coloque inserciones que contengan membranas de policarbonato porosa en 24 placas de pozo. A continuación, añadir 1 mililitro de medio de cultivo en la cámara basal que es el espacio inferior de la membrana. Añadir 5 mililitros de medio al matraz, y pipetear vigorosamente las células contra el interior del matraz de 5 a 10 veces, para separar el cultivo en células individuales sueltas, o dos o tres grumos celulares.Placa 0.166 mililitros de las células en la cámara apical que es el espacio superior de la membrana. Luego incubar las placas a 37 grados centígrados durante un máximo de tres semanas. Alimentar las células tres veces por semana, mediante el uso de una bomba de presión para aspirar cuidadosamente el medio desde el compartimiento basal de cada pozo.A continuación, gotee suavemente un mililitro de medio en la cámara apical de cada plaquita. Para estudios de citoquinas, un día antes de la resistencia eléctrica transepitelial o mediciones TER, reemplace el medio basal por medio, que contiene 10 nanogramos por mililitro de interferón gamma. El día del experimento, sustituya el medio por HBSS que contenga 2,5 o 7,5 nanogramos por mililitro de TNF.Para corregir el medidor, inserte el electrodo de corrección en el puerto de entrada y elija el modo Ohm. A continuación, utilice un destornillador para ajustar el tornillo de ajuste R hasta que el medidor muestre una lectura de 1.000 ohmios. Esterilice los electrodos en 70%etanol durante 15 a 30 minutos y démútelos secar al aire durante 15 segundos.A continuación, enjuague los electrodos en un medio de cultivo celular experimental. A continuación, encienda la alimentación y elija el modo Ohm. Mientras mantiene los electrodos verticales, coloque cuidadosamente los extremos largos de los puentes de electrodos en la cámara basal, asegurándose de que toquen el plato.A continuación, coloque los extremos cortos en la cámara apical, asegurándose de que permanezcan por debajo de la superficie del medio, pero por encima de los insertos de cultivo de tejido. Mida la resistencia de la muestra y las plaquitas en blanco a las 0, 1, 2, 3 y 4 horas después del tratamiento con citoquinas. Entonces registra la resistencia.Para lograr la consistencia en diferentes formatos de placa, calcule el producto de la resistencia y el área de membrana efectiva como se muestra aquí. Para 24 inserciones de pozos, el área efectiva de la membrana es de 0,33 centímetros cuadrados. Para inducir la colitis, agregue DSS al agua autoclavada a una concentración final de 3,5% de peso por volumen.A continuación, utilice la solución DSS para reemplazar el agua potable en las jaulas de seis ratones C57 negros C57 negros de 8 semanas de edad durante un total de siete días. Dar agua potable regular sin DSS para controlar ratones. Después del día siete, cambie el agua del DSS por agua potable regular.Cada día, sopesar a los ratones y evaluar las puntuaciones clínicas según se define de acuerdo con la gravedad de la enfermedad por cuatro parámetros: prolapso rectal, consistencia de las heces, sangrado y actividad. Sume las puntuaciones de estos parámetros para una puntuación clínica final. Analizar la condición histopatológica de los tejidos del colon siete días después del tratamiento con DSS, después de eutanasiar ratones de acuerdo con el protocolo de texto, aislar el colon y el cecum, y medir la longitud del colon.Corte segmentos de 0,5 centímetros del colon distal y fije el tejido en un tubo de halcón de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 10% de formalina durante la noche. Lave los tejidos fijos con etanol y xileno clasificados. A continuación, incruste los tejidos en la parafina y corte seis secciones milimétricas para la tinción de hematoxilina y eosina.Para medir la permeabilidad de la barrera epitelial en ratones inducidos por DSS, siete días después del inicio de la administración de DSS, ayúdenlos durante tres horas. Autoclave una aguja de gavage para asegurar la esterilidad, luego utilice 150 microlitros de 80 miligramos por mililitro de cuatro kilodatones FITC dextran en agua estéril para gavage los ratones, y mantenga el dextran FITC no utilizado para medir la curva estándar después de la recolección de suero. A continuación, ponderar a los ratones para el cálculo de la permeabilidad.Cuatro horas más tarde, después de anestesiar los ratones por inyección IP, confirme la anestesia adecuada por la falta de reflejos y movimiento del bigote. A continuación, coloque los ratones en un bloque de calor durante cinco minutos. Usando un par de tijeras, sujeta una pieza de un centímetro de la cola y recoge 100 microlitros de sangre de la cola en un tubo de recolección de suero.Gire la sangre recogida a 10.000 veces g y a temperatura ambiente durante diez minutos. Con agua, diluya el suero de uno a cuatro. A continuación, para hacer una curva estándar, utilice agua para preparar las diluciones del dextrán FITC no utilizado.Agregue 100 microlitros por pozo del suero y las muestras de curva estándar en 96 placas de pozo. Usando un lector de placas, lea la fluorescencia con una excitación de 485 y una emisión de 528. Calcule los valores de permeabilidad en función de la curva estándar y multiplique por cuatro para corregir la dilución.Divida la concentración de FITC dextran por el peso para normalizar los valores. Esto ayuda a normalizar la diferencia en el parto de dextran FITC si los ratones están enfermos y han perdido peso. Las células caco-2bbe que se muestran aquí fueron etiquetadas con núcleos y manchas de F-actina para mostrar la diferencia entre las células indiferenciadas y diferenciadas.Las fibras de estrés se ven claramente en las células indiferenciadas. Las células diferenciadas tienen un volumen más pequeño, núcleos más grandes y menos fibras de tensión que las células indiferenciadas. El TNF es fundamental para la pérdida de barrera intestinal a través de la regulación de unión estrecha dependiente de MLCK.Como se ve en esta cifra, TNF disminuye significativamente el TER de la monocapa Caco-2bbe de una manera dependiente de la dosis, lo que sugiere que TNF aumenta la permeabilidad epitelial. En comparación con su peso corporal inicial, los ratones tratados con DSS pierden una cantidad significativa de peso. La gravedad de la colitis se obtiene por prolapso rectal, consistencia de las heces, sangrado y actividad.Las secciones transversales de los tejidos colónicos manchados con hematoxilina y eosina muestran daño de la mucosa colónica en ratones tratados con DSS. Además, la longitud de la cripta de colon, así como el colon en sí, se reduce en ratones tratados con DSS. Por último, hay un aumento de aproximadamente el doble en los niveles de tinción de dextrano FITC en ratones tratados con DSS, en comparación con los ratones de control.Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar el error, estandarizando los procedimientos operativos y utilizando métodos estadísticos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino a los investigadores en el campo de la función de barrera intestinal para explorar enfermedades gastrointestinales tanto en organismos modelo como en líneas celulares. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo determinar la permeabilidad epitelial intestinal midiendo el TER, gavaging FITC dextran, y la observación de cambios morfológicos e histoquímicos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe el uso de preparaciones de tejido intestinal extirpado o "sacos intestinales" como modelo ex vivo de la función de barrera intestinal. Este modelo se puede utilizar para evaluar la integridad tanto de la barrera epitelial como de la capa de gel mucoso en sitios intestinales específicos en modelos animales de enfermedad digestiva.

Ex Vivo intestinal Sacs para evaluar la permeabilidad de la mucosa en modelos de enfermedad gastrointestinal

Los tratamientos actuales de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) tienen como objetivo aliviar los síntomas de la enfermedad, pero pueden causar efectos secundarios graves. Por lo tanto, las estrategias alternativas están siendo investigados en modelos animales con colitis. A continuación, explicamos cómo se analizan los efectos beneficiosos de los suplementos de la dieta en los signos clínicos de la EII en un modelo de este tipo colitis.

Analizar los efectos beneficiosos de los suplementos nutricionales sobre las funciones epitelial intestinal de barrera durante Experimental Colitis

Este protocolo describe la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en el tratamiento farmacológico siguiente en tiempo real en humanos organitas intestinal mediante microscopía fluorescente y vivo microscopia celular.

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

El acceso de nutrientes, metabolitos de la microbiota y medicamentos para la circulación es controlado por la barrera intestinal-sangre (GBB). Se describe un método directo para medir la GBB permeabilidad en vivo, que, en contraste con métodos indirectos utilizados, prácticamente no es afectado por las funciones de hígado y riñón.

Un método In Vivo para evaluar la barrera intestinal-sangre y hígado metabolismo de la Microbiota de productos

Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.

Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

La función epitelial intestinal desregulada de la barrera y las inmunorespuestas son sellos de la enfermedad de intestino inflamatoria que siguen siendo investigados mal debido a una carencia de modelos fisiológicos. Aquí, se describe un modelo de asa intestinal de ratón que emplea un segmento intestinal bien vascularizado y exteriorizado para estudiar la permeabilidad de la mucosa y el reclutamiento de leucocitos in vivo.

Evaluación Funcional De La Permeabilidad Intestinal Y La Migración Transepitelial Neutrófilo En Ratones Usando Un Modelo De Bucle Intestinal Estandarizado

Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides, un modelo intestinal tridimensional, a partir del tejido intestinal fetal. Se utilizaron imágenes inmunofluorescentes de biomarcadores epiteliales para la caracterización del modelo. La exposición apical de lipopolisacáridos, una endotoxina bacteriana, mediante la técnica de microinyección indujo la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la dosis medida por la fuga de dextrano fluorescente.

Prueba de permeabilidad epitelial en enteroides derivados de tejido fetal

El presente protocolo describe un método que utiliza lucifer amarillo en un modelo enteroide apical-out para determinar la permeabilidad intestinal. Este método se puede utilizar para determinar la permeabilidad paracelular en enteroides que modelan enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante.

Determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out

Aquí descritos son protocolos que se utilizan para visualizar el proceso dinámico de la MG53 mediada por reparación de la membrana celular en todo el animal y en el nivel celular. Estos métodos se pueden aplicar para investigar la biología celular de volver a sellar la membrana plasmática y la medicina regenerativa.

Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

Aprende a medir la permeabilidad epitelial intestinal in vitro e in vivo mediante resistencia transepitelial y gavaje de FITC-dextran en ratones. Estas técnicas permiten estudiar enfermedades inflamatorias intestinales.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

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