Proliferación y diferenciación de precursores mieloides murinas 32D/G-CFS-R las células

El objetivo general de este experimento consiste en modificar genéticamente las células murinas mieloides 32D-G-CSF-R mediante la sobreexpresión o silenciamiento del gen de interés y determinar el efecto de estos cambios sobre la proliferación y la diferenciación neutrófila de la línea celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hematología, como la participación de su proteína de interés en el crecimiento y la diferenciación de células precursoras mieloides. La principal ventaja de esta línea celular es que posee una capacidad ilimitada de proliferación, es susceptible a manipulaciones genéticas, su costo es relativamente bajo y permite un grado de simplificación biológica necesario en ciertos enfoques experimentales. Quien demostrará el procedimiento hoy será Petr Danek, un estudiante de doctorado en mi laboratorio.

Prepare 250 mililitros de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 10 nanogramos por mililitro de interleucina-3 murina. Luego prepare 50 mililitros de medio de diferenciación.

En una placa de Petri de 16 centímetros, siembre una suspensión de células individuales de células Bosc23 en 18 mililitros de medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal. Incube durante aproximadamente 24 horas hasta que la confluencia alcance el 80%. Luego, combine el vector retroviral MSCV, el vector de empaquetamiento PCL-echo, polietilenimina y medio con suero reducido sin antibióticos. Incube esta mezcla en una cabina de flujo laminar a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, reemplace cuidadosamente el medio de cultivo de las células Bosc23 con 16 mililitros de medio DMEM precalentado, suplementado con 2% de suero bovino fetal y mantenido a 37 grados Celsius. Después, agregue gota a gota la mezcla retroviral sobre las células Bosc23. Incube entonces el cultivo a 37 grados Celsius durante cuatro horas.

Una vez finalizada la incubación, aspire el medio de cultivo de Bosc23 y agregue 18 mililitros de medio DMEM precalentado con 10% de suero bovino fetal. Incube las células a 37 grados Celsius durante 48 horas. Utilice una pipeta serológica de 25 mililitros para transferir el medio de Bosc23 que contiene el virus a un tubo cónico de 50 mililitros. Almacene el tubo a cuatro grados Celsius. A continuación, agregue 18 mililitros de medio DMEM precalentado con 10% de suero bovino fetal a las células Bosc23 y cultive las células durante 24 horas.

Centrifugar el sobrenadante viral a 1.500 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, alícuotar el virus y congelarlo rápidamente con nitrógeno líquido para almacenarlo a menos 80 grados Celsius.

En cada pocillo de una placa de seis pocillos, siembre células NIH/3T3 en tres mililitros de medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal para titular un virus. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, diluya el virus con medio precalentado sin vortexar las partículas virales. Aspire el medio de cultivo de las células NIH/3T3 y agregue un mililitro de virus diluido en cada pocillo. Incube a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, aspire cuidadosamente el medio viral diluido y sustitúyalo con dos mililitros de medio DMEM con 10% de suero bovino fetal e incube nuevamente a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la incubación, aspire los medios antiguos y sustitúyalos con medio DMEM que contenga dos microgramos por mililitro de puromicina. Continúe cultivando las células cada tres días o a menos que el medio se vuelva amarillo, y reponga con medio fresco que contenga puromicina.

Entre el día 10 y el día 12 posteriores a la infección, aspire el medio de los pocillos y lave suavemente con solución salina tamponada con fosfato. Luego, tiña con un mililitro de solución de violeta de cristal a temperatura ambiente durante dos minutos. Después de la tinción, lave cuidadosamente dos veces con solución salina tamponada con fosfato. Cuente el número total de colonias azules presentes en cada pocillo bajo un microscopio.

Siembre las células 32D-G-CSF-R en una placa de seis pocillos. Añada el virus a una multiplicidad de infección entre 10 y 40. Luego añada polibreno a una concentración final de ocho microgramos por mililitro a las células e incube a 37 grados Celsius durante seis horas. Tras la incubación, reúna las células en un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 450 veces g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Las células 32D pueden perder parcialmente su capacidad de diferenciación si se cultivan a concentraciones superiores a un millón de células por ml; por lo tanto, es muy importante dividir estas células a tiempo y no sobrecultivarlas.

Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en un matraz de cultivo T25 que contenga seis mililitros de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 10 nanogramos por mililitro de interleucina-3 murina. Incube las células a 37 grados Celsius durante 48 horas.

Lave las células 32D-G-CSF-R dos veces con medio RPMI-1640 sin citoquinas. A continuación, siembre las células en un mililitro de medio de diferenciación en una placa de 24 pocillos el día cero e incube a 37 grados Celsius durante la noche. Las células tardarán de siete a nueve días en diferenciarse en granulocitos maduros. Luego, cuente el número de células utilizando azul de tripano para excluir las células muertas.

Dado que la IL-3 puede inhibir el proceso de diferenciación, es absolutamente fundamental eliminar todos los rastros de la citocina antes de cultivar las células en GCSF.

Centrifugar las células en una portaobjetos de vidrio en una centrífuga con los adaptadores necesarios a 20 veces g durante cinco minutos. Luego, fijar las células en metanol durante cinco minutos a temperatura ambiente y dejar secar las células. Teñir las células utilizando la tinción de May-Grunwald Giemsa siguiendo el protocolo del fabricante. Una vez teñidas, visualizar las células que han tomado el tinte utilizando un aumento de 40X.

Basándose en la morfología celular, cuantifique el número de blastos, células diferenciadas intermedias y granulocitos maduros en las células teñidas.

Aquí se muestra una representación gráfica que demuestra la proliferación de células 32D-G-CSF-R en medios que contienen interleucina-3 y factor estimulante de colonias de granulocitos. El eje x representa los días de tratamiento, y el eje y representa el recuento celular en escala logarítmica. El gráfico negro muestra la proliferación cuando las células se cultivan en medio que contiene interleucina-3. El gráfico azul muestra una disminución en la proliferación celular cuando se cultivan en medio que contiene factor estimulante de colonias de granulocitos.

Aquí se muestran gráficos circulares representativos y tinción con May-Grunwald Giemsa que muestran la proporción y la morfología de diferenciación de las células 32D-G-CSF-R en medio que contiene factor estimulante de colonias de granulocitos. Los gráficos circulares muestran la proporción de blastos, células intermedias diferenciadas y neutrófilos tras el tratamiento con factor estimulante de colonias de granulocitos a los cero, dos, cuatro y seis días. Las células teñidas con Giemsa en el día cero presentan núcleos grandes y característicos y citoplasma oscuro. En el día seis, el tamaño nuclear se reduce y el citoplasma aumenta pero no es oscuro.

Se muestran aquí gráficos circulares representativos que indican la mayor proporción de células blásticas al ser transducidas con proteínas de fusión BCR-ABL en comparación con el vector control MSCV en medios que contienen factor estimulante de colonias de granulocitos. La tinción con Giemsa en el panel inferior es representativa de las células transducidas con el vector control o con proteínas de fusión BCR-ABL.

Las células experimentaron diferenciación neutrófila en el día seis cuando se transdujeron con el vector de control MSCV, pero las células transducidas con BCR-ABL mostraron principalmente células blasticas y ningún neutrófilo maduro.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cultivar las células del receptor 32D-G-CSF en las concentraciones indicadas. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos de migración y experimentos de supervivencia, para responder preguntas adicionales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular la línea celular 32D-G-CSF, incluyendo la manipulación genética mediante transducción lentiviral y retroviral, expansión, diferenciación, y evaluación de la proliferación y diferenciación de estas células. No olvide que trabajar con virus puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y gafas protectoras, durante la realización de este procedimiento.