Name: Proliferación y diferenciación de precursores mieloides murinas 32D/G-CFS-R las células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprende a modificar genéticamente células precursoras mieloides murinas 32D/G-CSF-R mediante infecciones virales y evalúa sus efectos en la proliferación y diferenciación neutrofílica. Este método es fundamental para avanzar en el estudio de la hematología y la biología celular.

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Los autores agradecen Prof. Ruud Delwel y Prof. Ivo Touw por facilitarnos la línea 32D/G-CSF-R celular y Prof. Daniel G. Tenen por facilitarnos la línea celular de Bosc23. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agencia de donación de la República Checa (GACR 15-03796S y GACR 17-02177S) a MA-J, el apoyo del Instituto de Genética Molecular de la Academia Checa de Ciencias (RVO 68378050) a MA-J, una beca de Reino Unido GA (proyecto no. 341015) de la Universidad de Charles en Praga a MK y una beca de Reino Unido GA (proyecto Nº 1278217) de la Universidad de Charles en Praga a PD.

Nota: Los pasos que describen la expansión, diferenciación y transducción de las células 32D/G-CSF-R se presentan a continuación.
1. preparación
<ol><li>Preparación de medios de comunicación
	<ol>
<li>Preparar 250 mL de medio de cultivo: (Roswell Park Memorial Institute) de RPMI 1640 suplementado con 10% de calor inactiva FBS (suero bovino fetal) y murino IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>Como alternativa, utilizar caseras IL-3. Para producir IL-3 hecho en casa, transducir las células HEK293 con vector de expresión de IL-3 y cobrar IL-3 que contienen sobrenadante22. Nota: Los antibióticos, como penicilina G (100 UI/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y gentamicina (40 μg/mL), pueden utilizarse para el cultivo de células en cualquier paso del Protocolo a menos que se indique lo contrario.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar 50 mL de medio de diferenciación: Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS y G-CSF humano (100 ng/mL). Nota: (Importante) no todos los lotes de suero ayuda a la diferenciación de las células 32D/G-CSF-R. Antes del inicio del experimento de prueba de diferentes lotes de suero. Se recomienda por lo menos 4 diferentes lotes de prueba y seleccionar el óptimo basado en la capacidad de las células 32D/G-CSF-R para diferenciar. Ver protocolo de diferenciación de 32D/G-CSF-R abajo.</li>
		<li>Preparar 10 mL de medio de congelación: Medio RPMI 1640 suplementado con 40% FBS y 10% DMSO (dimetil sulfóxido).</li>
	</ol></li>
	<li>Producción de retrovirus
	<ol>
<li>Una suspensión unicelular de células de Bosc23 (6 × 106) en un plato de Petri de 16 cm de la placa y cultivar en 18 mL de DMEM (medio modificado Eagle de Dulbecco) que contiene 10% FBS hasta la confluencia de la cultura alcanza el 80% (24 h). Nota: Las células deben crecer en un monocapa y no forma grumos en la cultura. Conteo de células puede realizarse mediante diversos métodos (válidos para el resto de los protocolos aquí presentados). En caso de bajo número de muestras, se recomienda conteo manual bajo el microscopio con cámara de Bürker. En este caso, utilice Trypan azul para la exclusión de las células muertas. Mezclar las células 1:1 con 0.4% azul de tripano en PBS. Para realizar conteo de gran número de muestras, se puede emplear un contador celular automático.</li>
		<li>Se combinan 40 μg de construcción retroviral (como MSCV), 20 μg de pCL-Eco (vector packaging)23, 80 μl de PEI (polietilenimina) y 2 mL de suero reducido medio (por ejemplo, Opti-MEM) medio (sin antibióticos). Incubar la mezcla por 20 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Vuelva a colocar cuidadosamente Bosc23 medio de las células 16 ml de DMEM suplementado con 2% FBS. Pre-calentar el medio a 37 ° C antes de usar. Nota: No utilice antibióticos durante la transfección, ya que puede reducir eficacia de transfección.</li>
		<li>Agregar la mezcla preparada en 1.2.2. gota a gota y con cuidado a la Bosc23 de la cultura e incubar durante 4 h a 37 ° C. Límite de incubación inferior a 6 h debido a la toxicidad del PEI.</li>
		<li>Después de la incubación, cambiar el medio de Bosc23 a 18 mL previamente calentado DMEM con 10% FBS y cultivar las células durante 48 h a 37 ° C. Coloque los platos en un laboratorio de bioseguridad nivel 2, mantener aquí de este paso y seguir procedimientos de seguridad estándar.</li>
		<li>Recoger Bosc23 medio (contiene ecotropic retroviral partículas) usando una pipeta serológica de 25 mL en un tubo cónico de 50 mL y almacenar a 4 ° C. Nota: Eficiencia de transfección (importante) debe alcanzar el 90% para producir un virus de alto título.</li>
		<li>Añadir 18 mL previamente calentado DMEM con 10% FBS a Bosc23 de las células y cultivar durante 24 h.</li>
		<li>Repita el paso 1.2.6. Nota: Pueden combinarse Retroviral sobrenadantes de 1.2.6 y 1.2.8 una vez que alcanzan la misma temperatura (4 ° C) para preservar la integridad de viral.</li>
		<li>Para evitar la contaminación de la Bosc23 en sobrenadante viral, spin virus recogido en 1500 × g por 10 min a 4 ° C. Virus de la alícuota, snap congelación con nitrógeno líquido o hielo seco y almacenar a-80 ° C. Sin embargo, tenga en cuenta que el virus recién preparado es de mayor calidad en términos de eficiencia de la infección que las reservas congeladas. Nota: (Importante) no repetitiva de congelación/descongelación de virus, puesto que conduce a la degradación viral.</li>
	</ol></li>
	<li>Producción de lentivirus
	<ol>
<li>Una suspensión unicelular HEK293T (riñón embrionario humano 293T) de células de (6 × 106) en un plato de Petri de 16 cm de la placa y cultivar en 18 mL de DMEM con 10% FBS hasta la confluencia de la cultura alcanza el 80% (24 h). Nota: Las células deben crecer en un monocapa y no forma grumos en la cultura.</li>
		<li>Combinar 15 μg de construcción lentivirales (como pGhU6), embalaje pCMVdR8.74 de plásmidos (codificación de gag/pol, 12 μg) y pMD2.VSVG (codificación para VSV-G, 1,4 μg), PEI 85.2 μl y 2 mL de suero reducido medio (sin antibióticos). Incubar la mezcla por 20 min a TA.</li>
		<li>Vuelva a colocar cuidadosamente HEK293T medio con 16 mL de DMEM suplementado con 2% FBS. Pre-calentar el medio a 37 ° C antes de usar. No utilice antibióticos durante la transfección, ya que puede reducir eficacia de transfección.</li>
		<li>Con cuidado deje caer la mezcla preparada en 1.3.2 a la cultura de células HEK293T e incubar 4 h a 37 ° C. Limitar la duración de la incubación para dentro de 6 h para prevenir la toxicidad del PEI.</li>
		<li>Medio de cambio a 18 mL previamente calentado DMEM 10% FBS y cultivar células durante 48 h a 37 ° C. Coloque los platos en un laboratorio de bioseguridad nivel 2, mantener aquí de este paso y seguir procedimientos de seguridad estándar.</li>
		<li>Recoger HEK293T medio (que contiene partículas lentivirales de amphotropic) con una pipeta serológica de 25 mL en un tubo cónico de 50 mL y almacenar a 4 ° C. Nota: Eficiencia de transfección (importante) debe alcanzar el 90% para producir un virus de alto título.</li>
		<li>Con cuidado agregar 18 mL de DMEM con 10% FBS a las células HEK293T. Cultivar durante 24 h a 37 ° C.</li>
		<li>Repetir el punto 1.3.6. Nota: Pueden combinarse lentivirales sobrenadantes de 1.3.6 y 1.3.8 una vez que alcanzan la misma temperatura (4 ° C) para preservar la integridad de viral.</li>
		<li>Para evitar la contaminación del sobrenadante viral con células HEK293T, spin virus recogido en 1500 × g por 10 min a 4 ° C. Virus de la alícuota, snap congelación con nitrógeno líquido o hielo seco y almacenar a-80 ° C. Sin embargo, notar que recién preparado de virus es de mayor calidad en términos de eficiencia de la infección que las reservas congeladas. Nota: (Importante) no repetitiva de congelación/descongelación de virus, puesto que conduce a la degradación viral.</li>
	</ol></li>
	<li>Titulación de virus que contiene un reportero GFP
	<ol>
<li>Semillas de 1 × 105 células NIH/3T3 en 300 μL de DMEM 10% FBS por pozo en una placa de 24 pocillos. 7 pozos se emplearán al un virus título.</li>
		<li>Descongelar el virus a 37 ° C y añadir 1, 5, 10, 50, 100 y 500 virus μl a culturas de NIH/3T3. No añadir ningún tipo de virus en control negativo también. Cultivar las células en presencia de lo virus durante 48 h a 37 ° C.</li>
		<li>Cosechar las células NIH/3T3 con 30 μl de tripsina/EDTA (ácido etilendiaminotetracético) (0.25% tripsina, 0.01% EDTA en PBS) y células en 250 μl PBS en un tubo de FACS (fluorescencia activada célula clasificación).</li>
		<li>Determinar la frecuencia de células GFP+ por citometría de flujo en cada muestra24. Excluir las células muertas, además de un tinte de viabilidad, como Hoechst 33258.</li>
		<li>Calcular el número total de células GFP+ (basados en el número de células plateados y porcentaje de células GFP+ ) y trazar contra el volumen de virus utilizado para la infección. Nota: La eficiencia (importante) de la infección alcanza una meseta cuando se aplican grandes dosis virales. Por lo tanto, es importante estimar el título basado en las concentraciones virales en que infección eficiencia se produce en un rango lineal (ejemplo que se muestra en la tabla 1). El número de células GFP+ indica el número de partículas virales funcionales (TU - transformación de unidades) en un volumen determinado virus. Calcular el número de TU por mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Titulación de virus que contiene un reportero puromicina
	<ol>
<li>Semilla de 5 × 104 células NIH/3T3 en 3 mL de DMEM 10% FBS por pozo en una placa de 6 pozos; emplear 6 pozos al un virus título. Cultura durante la noche a 37 ° C.</li>
		<li>Al día siguiente diluir virus como se indica en la tabla 2. Para diluir el virus, uso de DMEM con 10% FBS. No no agitar con vortex.</li>
		<li>Retire el medio de cultivo de las células NIH/3T3 y añadir 1 mL de virus diluido.</li>
		<li>Incubar durante una noche a 37 ° C.</li>
		<li>Vuelva a colocar el medio que contiene el virus con 2 mL de DMEM con 10% FBS e incubar toda la noche a 37 ° C.</li>
		<li>Vuelva a colocar los NIH/3T3 mediano con 2 mL de precalentado DMEM 10% FBS con puromicina (2 μg/mL).</li>
		<li>Cultivo a 37 ° C y cuidadosamente refresco mediano con puromicina cada 3 días o cuando el medio se vuelve amarillo.</li>
		<li>A los 10-12 días después de la infección, aspirar el medio de cada pozo y lavar suavemente con PBS.</li>
		<li>Mancha con 1 mL de solución de violeta cristal (violeta de cristal de 0,5% en 20% etanol y dH2O), 2 min a temperatura ambiente y lavar cuidadosamente con PBS dos veces.</li>
		<li>Cuenta colonias azul presentes en cada bien bajo el microscopio (aumento X4). No colonias deben observarse bien en el control negativo.</li>
		<li>Calcular el número total de TU/mL considerando el factor de dilución.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ampliación y mantenimiento de las células 32D/G-CSF-R
<ol><li>Si se congelan las células 32D/G-CSF-R, tomar una alícuota y descongelar las células en un baño de agua de 37 ° C por 1 min y las células del frasco en 10 mL de precalentado Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS en un tubo de 15mL. Invertir el tubo 3 veces y las células de la vuelta abajo a 400 × g. eliminar el sobrenadante y resuspender las células IL-3 que contienen medio de cultivo a una concentración de 0,3 × 106 células/mL.</li>
	<li>Concentración de crecimiento celular óptimo es de 0.25-0.5 × 106 células/mL. Dividir celdas cada 2 días a una concentración de 0.1-0.2 × 106 células/mL. Nota: Las células 32D/G-CSF-R (importante) pueden perder parcialmente su capacidad para distinguir si se cultiva a concentraciones superiores a 1 × 106 células/mL. Por lo tanto, es muy importante dividir celdas 32D/G-CSF-R en el tiempo.</li>
	<li>Según sea necesario, congelar y almacenar alícuotas de células durante largos períodos de tiempo a-80 ° C o en nitrógeno líquido. Desactivación de 3 × 106 células, eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de medio de congelación. Coloque el tubo en un recipiente de congelación a-80 ° C. Para almacenamiento a largo plazo, volver a colocar las células en nitrógeno líquido.</li>
</ol>3. transducción de células 32D/G-CSF-R
<ol><li>Células 32D/G-CSF-R de placa en placa de 6 pozos a una concentración de 0,3 × 106 células/mL.</li>
	<li>Añadir la cantidad apropiada de virus a un MOI (multiplicidad de infección) entre 10 y 40. Nota: MOI más alto dará lugar a aumento del porcentaje de células GFP+ , así como mayores niveles de expresión del gen de interés. Ejemplo: Para infectar a 0,3 × 106 células con un MOI de 10; 3 × 106 TU tendrá que añadirse a las células 32D/G-CSF-R.</li>
	<li>Añadir polibreno a concentración final 8 μg/mL e incubar durante 6 h a 37 ° C. Como alternativa, realizar un procedimiento de centrifugado-inoculación: centrifugar a 1200 × g durante 90 minutos a 30 ° C en una placa de cultivo con un rotor de columpio-cubo e incubar durante 3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Las células recogemos, transferir a un tubo de 15 mL y girar a 450 × g por 5 min (4 ° C).</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante, resuspender las células concentradas en 6 mL de medio de cultivo, colocar en un frasco de cultivo celular T25 y cultivo a 37 ° C.</li>
	<li>48 h más tarde, las células de la cosecha y girar a 450 × g por 5 min (4 ° C). Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>En el caso de un reportero GFP: colocar las células en 500 μl de PBS y tipo células GFP+ utilizando un clasificador de citometría de flujo. En el caso de un reportero de puromicina que contiene vector: colocar las células en medio de cultivo que contiene 2 μg/mL de puromicina.</li>
	<li>Expandir las células según sea necesario para los experimentos y su análisis posterior. Nota: Células Transduced (opcional) pueden ser congeladas en los medios de comunicación en un recipiente de congelación a-80 ° C de congelación y más almacenadas en nitrógeno líquido.</li>
</ol>4. 32D/G-CSF-R análisis de proliferación de la célula
<ol><li>Para evaluar la proliferación tasa lugar 0,2 × 106 células en 1 mL de medio de cultivo e incubar durante una noche a 37 ° C.</li>
	<li>Al día siguiente cuenta el número de células y diluir a una concentración de 0,2 x 106 células/mL con medio de cultivo. Incubar durante una noche a 37 ° C. Mantener registros de las concentraciones celulares y diluciones aplicadas a las culturas diario utilizando la tabla 3.</li>
	<li>Repita el paso 4.2 durante tantos días como proliferación debe evaluarse. Nota: La duración de los ensayos de proliferación dependerá el efecto del gen de interés. En el caso de un fenotipo fuerte, 8-9 días podría ser suficientes para observar un efecto significativo (véase Figura 3A). Sin embargo, en el caso de un fenotipo suave, largos períodos de tiempo pueden ser necesarios.</li>
	<li>Evaluar el crecimiento de la célula haciendo una curva de proliferación, tal como se indica en la tabla 3.</li>
</ol>5. ensayo de diferenciación de la célula 32D/G-CSF-R
<ol><li>Lavar 0,2 × 106 32D/G-CSF-R las células dos veces con Medio RPMI sin citoquinas. Nota: Los pasos de lavado antes de la adición de G-CSF en la cultura son importantes, ya que la presencia de IL-3 residual puede inhibir la diferenciación.</li>
	<li>Colocar las células en medio de la diferenciación de la 1 mL (contiene 100 ng/mL de G-CSF) en un bien/placa 24, dando por resultado una concentración celular de 0,2 x 106 células/mL (día 0). Cultura durante la noche a 37 ° C.</li>
	<li>Contar el número de células/mL como se indicó anteriormente (paso 1.2.1).</li>
	<li>Cytospin 2-5 × 104 células sobre un portaobjetos de vidrio (76 X 26 mm) utilizando una centrífuga con adaptadores necesarios en 20 × g.</li>
	<li>Actualizar diferenciación medio y placa de las células a una concentración de 0,2 × 105 células/mL en un pozo/placa 24 (día 1). Deseche la placa vieja y continuar al día siguiente paso 5.6 con la nueva placa.</li>
	<li>En los días de 2 a 7, repita los pasos del 5.3 a 5.5. Evaluar la proliferación celular en presencia de G-CSF como se describe en el paso 4. Nota: (Importante) durante la diferenciación, proliferación celular se ralentiza, por lo tanto después de 3 a 4 días en presencia de G-CSF es adecuada para células en cultivo en concentraciones más altas.</li>
	<li>Evaluar el estado de diferenciación de las células 32D/G-CSF-R basado en la morfología celular.<ol>
<li>Fijar las células en el paso 5.4 en metanol durante 5 minutos a temperatura ambiente y dejar el portaobjetos se seque al aire. Nota: Diapositivas del día 0 al 7 pueden almacenarse a temperatura ambiente y fijo al mismo tiempo. Del mismo modo, se puede también mantener a temperatura ambiente durante más tiempo después de la fijación.</li>
		<li>Se tiñen las células con May-Grünwald Giemsa tinción protocolo de siguiente fabricante.</li>
		<li>Visualizar células usando un microscopio y aumento X40.</li>
		<li>Cuantificar el número de blastos, células intermedio diferenciadas y granulocitos maduros con cuadros ilustrativos en la figura 1 y la descripción en el cuadro 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La elección de un modelo experimental es uno de los temas principales en la investigación. Aunque las células animales y humanas primarias se creen para producir los datos más relevantes, estos modelos pueden incluir preocupaciones éticas y a menudo se asocian a procedimientos costosos y sofisticados aislamiento/cultivo. Células primarias son limitadas en número y es difícil manipularlos genéticamente. Además, las células primarias representan una población heterogénea compuesta por diversos tipos celulares que pueden co...

La población de madre y progenitoras hematopoyética suministra al organismo una gran variedad de células maduras, incluyendo las células del linaje mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos). El proceso que impulsa la producción de células mieloides de las células madre hematopoyéticas se conoce como mielopoyesis y producción adecuada de células mieloides maduras en respuesta a las cambiantes demandas es un prerrequisito para el adecuado afrontamiento del organismo con el estrés condiciones, como infecciones y la pérdida de sangre. Producción insuficiente de células mieloides maduras puede provocar incapacidad para eliminar patógenos, coagulación de la sangre y otros mortales condiciones1,2. Además, alteraciones en el desarrollo del linaje mieloide también pueden ser asociadas con malignidades hematológicas, tales como la leucemia mieloide aguda (AML)3. Alteraciones en la mielopoyesis pueden ocurrir debido a diversas razones, tales como defectos en células receptores de la superficie4, expresiones alteradas de transcripción factores5, deterioraron señalización vías6, dando por resultado la formación de mutaciones / activación de oncogenes7o inactivación de genes de supresor de tumor8.
Varios métodos se han desarrollado para estudiar desarrollo mieloide y evaluar el efecto de las alteraciones genéticas específicas en este proceso. Métodos comunes utilizados para el estudio de la mielopoyesis consisten en células primarias y ratones transgénicos. Aunque estos modelos permiten la adquisición de datos biológicamente relevantes, tienen ciertas limitaciones. El uso de pilas encuentra con un número limitado de células y un período restringido de la cultura, estrechamiento de las posibilidades para alterar la expresión génica y posterior análisis biológico o bioquímico. Ratones transgénicos son costosas y requieren un grado razonable de justificación biológica. Además, trabajar con modelos en vivo añade un grado de complejidad al entender el papel de un gen de interés en un proceso dado. Por lo tanto, se necesitan alternativas para sortear estas limitaciones. Las líneas celulares tienen indiscutibles ventajas: (1) que poseen la capacidad de proliferación ilimitada que permite generar suficiente material para estudios bioquímicos y biológicos, (2) son susceptibles a la manipulación genética (caída, golpe de gracia, la sobreexpresión), (3) el costo es relativamente bajo, y (4) permiten un grado de simplificación biológica necesaria en ciertas aproximaciones experimentales.
La IL-3 padres (interleucina-3) 32D dependiente celular fue establecida en 1983 por Greenberger y colegas por la infección de células de médula ósea de los ratones C3H/HeJ amigo de virus de leucemia murina9. Varios clones 32D fueron descritos en la literatura: cl 2393 cl10y cl 1011. Las células de cl-3 32D mostraron proliferan en IL-3 y experimentan diferenciación neutrofílica sobre el tratamiento con estimulación de granulocitos factor (G-CSF)10. Por el contrario, 32D cl-10 células, siendo dependiente de la IL-3, originalmente no se diferencian en respuesta al tratamiento de G-CSF. En 1995 el grupo del Dr. Ivo Touw retrovirally transduced 32D cl-10 células tipo salvaje y mutante del receptor G-CSF (G-CSF-R), con el fin de identificar regiones funcionalmente importantes de este receptor11. Este estudio dio lugar a la generación de las células 32D/G-CSF-R, que son igualmente dependientes de IL-3, pero dentro de 6 a 10 días después del reemplazo de IL-3 con G-CSF, células para proliferar y diferenciarse irreversiblemente en neutrófilos maduros. Estas propiedades hacen 32D cl-3 y modelos simplificados 32D/G-CSF-R células de diferenciación neutrofílica murino que puede ser modulada por dos bien definido crecimiento y factores de diferenciación - IL-3 y G-CSF. Durante las últimas décadas varios grupos han utilizado células 32D/G-CSF-R para el estudio de la función de genes particulares en proliferación y diferenciación de las células mieloides en cultura12,13,14,15 , 16y para el estudio de G-CSF señalización17,18. Importante, los resultados obtenidos en esta línea celular se correlacionan con datos obtenidos con células primarias y ratones transgénicos16,19,20,21. En consecuencia, creemos que las células 32D/G-CSF-R, un modelo ampliamente utilizado y bien establecida, representan un sistema valioso para estudiar diferenciación mieloide que puede utilizarse en paralelo con otros enfoques de abordar esta cuestión.
Aquí, se presenta protocolos detallados que describen el manejo de la línea celular 32D/G-CSF-R, que cubierta de expansión, diferenciación y evaluación de la proliferación y diferenciación de estas células. Información detallada de la modificación genética de células 32D/G-CSF-R, ya sea por transducción retroviral o lentivirales, así como protocolos para la titulación de virus se proporcionan. Además, disponen de varios resultados representativos que muestran posibles aplicaciones de las células 32D/G-CSF-R.

<table><tbody><tr><td>Medio en polvo RPMI 1640</td><td>Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.</td><td>T 121-10</td><td>sin NaHCO3, con L-glutamina</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>31985-047</td><td>L-glutamina, fenol</td></tr><tr><td>Suero fetal fetal bovino (FBS)</td><td>Laboratorios PAA (GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.)</td><td>MT35011CV</td><td>Para la diferenciación de células 32D/G-CSF-R Suero</td></tr><tr><td>fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td><td>. 10270</td><td>Se utiliza para el cultivo de células HEK293T, NIH3T3, BOSC23</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>S9137</td><td>Polvo de sal de sulfato de estreptomicina en polvo</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>IL-3 murino</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE. UU.</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>humano G-CSF</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE. UU</td><td>. 300-23</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina</td><td>Polyscience, Warrington, PA, EE. UU.</td><td>23966</td><td>Lineal, MW 25,000 (PEI 25000)</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR Chemicals, Radnor, PA, EE. UU.</td><td>0458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Violeta cristalino</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald Giemsa</td><td>DiaPath, Martinengo, BG, Italia</td><td>10802</td><td></td></tr></tbody></table>

proliferación y diferenciación de precursores mieloides murinas 32d/g-cfs-r las células

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Comprensión de la biología de células madre y progenitoras hematopoyética tiene implicaciones importantes para la medicina regenerativa y el tratamiento de patologías hematológicas. A pesar de los datos más relevantes que se pueden adquirir con modelos en vivo o cultivos primarios, la baja abundancia de células madre y progenitoras hematopoyéticas restringe considerablemente el conjunto de técnicas apropiadas para su investigación. Por lo tanto, el uso de líneas celulares permite suficiente producción de material biológico para la realización de pruebas o ensayos que requieren un número grande de células. Aquí presentamos una descripción detallada, lectura e interpretación de ensayos de proliferación y diferenciación que se utilizan para la investigación de los procesos implicados en la diferenciación neutrofílica y mielopoyesis. Estos experimentos emplean la línea de células mieloides murinas dependiente 32D/G-CSF-I del cytokine, que posee la capacidad de proliferar en presencia de IL-3 y diferenciar en el G-CSF. Ofrecemos protocolos optimizados para manipular células 32D/G-CSF-R y discutir los principales escollos e inconvenientes que pudieran comprometer el análisis descritos y los resultados esperados. Además, este artículo contiene protocolos de producción lentivirales y retroviral, titulación y transducción de las células 32D/G-CSF-R. Demostramos que la manipulación genética de estas células puede emplearse para realizar con éxito los estudios funcionales y moleculares, que pueden complementar los resultados obtenidos con primarias células madre y progenitoras hematopoyéticas o modelos en vivo .

Proliferación y diferenciación de las células 32D/G-CSF-R
Para evaluar la proliferación de las células en condiciones de pro-proliferativa y de Pro-diferenciación 32D/G-CSF-R, 32D/G-CSF-R las células fueron cultivadas en medios que contienen IL-3 y G-CSF, respectivamente. Se observó que células cultivadas en medio con IL-3 (10 ng/mL) dividen aproximadamente cada 24 h (figura 2A). En reemplazo de la IL-...

Aquí se presentan protocolos detallados para el cultivo de la línea de célula 32D/G-CSF-R precursor mieloide murinas, realizar infecciones virales y llevar a cabo ensayos de proliferación y diferenciación. Esta línea celular es conveniente para el estudio de desarrollo de las células mieloides y el papel de los genes de interés en el crecimiento de las células mieloides y diferenciación neutrofílica.

Proliferación y diferenciación de precursores mieloides murinas 32D/G-CFS-R las células

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

El objetivo general de este experimento consiste en modificar genéticamente las células murinas mieloides 32D-G-CSF-R mediante la sobreexpresión o silenciamiento del gen de interés y determinar el efecto de estos cambios sobre la proliferación y la diferenciación neutrófila de la línea celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hematología, como la participación de su proteína de interés en el crecimiento y la diferenciación de células precursoras mieloides. La principal ventaja de esta línea celular es que posee una capacidad ilimitada de proliferación, es susceptible a manipulaciones genéticas, su costo es relativamente bajo y permite un grado de simplificación biológica necesario en ciertos enfoques experimentales. Quien demostrará el procedimiento hoy será Petr Danek, un estudiante de doctorado en mi laboratorio.Prepare 250 mililitros de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 10 nanogramos por mililitro de interleucina-3 murina. Luego prepare 50 mililitros de medio de diferenciación.En una placa de Petri de 16 centímetros, siembre una suspensión de células individuales de células Bosc23 en 18 mililitros de medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal. Incube durante aproximadamente 24 horas hasta que la confluencia alcance el 80%. Luego, combine el vector retroviral MSCV, el vector de empaquetamiento PCL-echo, polietilenimina y medio con suero reducido sin antibióticos. Incube esta mezcla en una cabina de flujo laminar a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, reemplace cuidadosamente el medio de cultivo de las células Bosc23 con 16 mililitros de medio DMEM precalentado, suplementado con 2% de suero bovino fetal y mantenido a 37 grados Celsius. Después, agregue gota a gota la mezcla retroviral sobre las células Bosc23. Incube entonces el cultivo a 37 grados Celsius durante cuatro horas.Una vez finalizada la incubación, aspire el medio de cultivo de Bosc23 y agregue 18 mililitros de medio DMEM precalentado con 10% de suero bovino fetal. Incube las células a 37 grados Celsius durante 48 horas. Utilice una pipeta serológica de 25 mililitros para transferir el medio de Bosc23 que contiene el virus a un tubo cónico de 50 mililitros. Almacene el tubo a cuatro grados Celsius. A continuación, agregue 18 mililitros de medio DMEM precalentado con 10% de suero bovino fetal a las células Bosc23 y cultive las células durante 24 horas. Centrifugar el sobrenadante viral a 1.500 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, alícuotar el virus y congelarlo rápidamente con nitrógeno líquido para almacenarlo a menos 80 grados Celsius. En cada pocillo de una placa de seis pocillos, siembre células NIH/3T3 en tres mililitros de medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal para titular un virus. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, diluya el virus con medio precalentado sin vortexar las partículas virales. Aspire el medio de cultivo de las células NIH/3T3 y agregue un mililitro de virus diluido en cada pocillo. Incube a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, aspire cuidadosamente el medio viral diluido y sustitúyalo con dos mililitros de medio DMEM con 10% de suero bovino fetal e incube nuevamente a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la incubación, aspire los medios antiguos y sustitúyalos con medio DMEM que contenga dos microgramos por mililitro de puromicina. Continúe cultivando las células cada tres días o a menos que el medio se vuelva amarillo, y reponga con medio fresco que contenga puromicina.Entre el día 10 y el día 12 posteriores a la infección, aspire el medio de los pocillos y lave suavemente con solución salina tamponada con fosfato. Luego, tiña con un mililitro de solución de violeta de cristal a temperatura ambiente durante dos minutos. Después de la tinción, lave cuidadosamente dos veces con solución salina tamponada con fosfato. Cuente el número total de colonias azules presentes en cada pocillo bajo un microscopio.Siembre las células 32D-G-CSF-R en una placa de seis pocillos. Añada el virus a una multiplicidad de infección entre 10 y 40. Luego añada polibreno a una concentración final de ocho microgramos por mililitro a las células e incube a 37 grados Celsius durante seis horas. Tras la incubación, reúna las células en un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 450 veces g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Las células 32D pueden perder parcialmente su capacidad de diferenciación si se cultivan a concentraciones superiores a un millón de células por ml; por lo tanto, es muy importante dividir estas células a tiempo y no sobrecultivarlas. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en un matraz de cultivo T25 que contenga seis mililitros de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 10 nanogramos por mililitro de interleucina-3 murina. Incube las células a 37 grados Celsius durante 48 horas.Lave las células 32D-G-CSF-R dos veces con medio RPMI-1640 sin citoquinas. A continuación, siembre las células en un mililitro de medio de diferenciación en una placa de 24 pocillos el día cero e incube a 37 grados Celsius durante la noche. Las células tardarán de siete a nueve días en diferenciarse en granulocitos maduros. Luego, cuente el número de células utilizando azul de tripano para excluir las células muertas. Dado que la IL-3 puede inhibir el proceso de diferenciación, es absolutamente fundamental eliminar todos los rastros de la citocina antes de cultivar las células en GCSF. Centrifugar las células en una portaobjetos de vidrio en una centrífuga con los adaptadores necesarios a 20 veces g durante cinco minutos. Luego, fijar las células en metanol durante cinco minutos a temperatura ambiente y dejar secar las células. Teñir las células utilizando la tinción de May-Grunwald Giemsa siguiendo el protocolo del fabricante. Una vez teñidas, visualizar las células que han tomado el tinte utilizando un aumento de 40X.Basándose en la morfología celular, cuantifique el número de blastos, células diferenciadas intermedias y granulocitos maduros en las células teñidas. Aquí se muestra una representación gráfica que demuestra la proliferación de células 32D-G-CSF-R en medios que contienen interleucina-3 y factor estimulante de colonias de granulocitos. El eje x representa los días de tratamiento, y el eje y representa el recuento celular en escala logarítmica. El gráfico negro muestra la proliferación cuando las células se cultivan en medio que contiene interleucina-3. El gráfico azul muestra una disminución en la proliferación celular cuando se cultivan en medio que contiene factor estimulante de colonias de granulocitos.Aquí se muestran gráficos circulares representativos y tinción con May-Grunwald Giemsa que muestran la proporción y la morfología de diferenciación de las células 32D-G-CSF-R en medio que contiene factor estimulante de colonias de granulocitos. Los gráficos circulares muestran la proporción de blastos, células intermedias diferenciadas y neutrófilos tras el tratamiento con factor estimulante de colonias de granulocitos a los cero, dos, cuatro y seis días. Las células teñidas con Giemsa en el día cero presentan núcleos grandes y característicos y citoplasma oscuro. En el día seis, el tamaño nuclear se reduce y el citoplasma aumenta pero no es oscuro.Se muestran aquí gráficos circulares representativos que indican la mayor proporción de células blásticas al ser transducidas con proteínas de fusión BCR-ABL en comparación con el vector control MSCV en medios que contienen factor estimulante de colonias de granulocitos. La tinción con Giemsa en el panel inferior es representativa de las células transducidas con el vector control o con proteínas de fusión BCR-ABL.Las células experimentaron diferenciación neutrófila en el día seis cuando se transdujeron con el vector de control MSCV, pero las células transducidas con BCR-ABL mostraron principalmente células blasticas y ningún neutrófilo maduro. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cultivar las células del receptor 32D-G-CSF en las concentraciones indicadas. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos de migración y experimentos de supervivencia, para responder preguntas adicionales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular la línea celular 32D-G-CSF, incluyendo la manipulación genética mediante transducción lentiviral y retroviral, expansión, diferenciación, y evaluación de la proliferación y diferenciación de estas células. No olvide que trabajar con virus puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y gafas protectoras, durante la realización de este procedimiento.

proliferation-differentiation-murine-myeloid-precursor-32dg-csf-r

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

Este protocolo describe la derivación de gliales Precursores restringidos de fetales médulas espinales y mantuvieron in vitro ya sea para el trasplante o para el estudio de linaje oligodendrocíticos.

Derivación de los precursores gliales restringidas de los ratones E13

Este video muestra un método para obtener células similares a las células de Schwann a partir de células estromales de médula ósea multipotentes (BMSC). Inicialmente, las BMSC se someten a un tratamiento de hipoxia, seguido de una diferenciación dirigida en células progenitoras neuronales. Posteriormente, se emplean medios y condiciones de cultivo específicos para inducir la transformación de estas células progenitoras en células similares a las células de Schwann.

Generación de células similares a las células de Schwann a partir de células estromales de la médula ósea

Este protocolo describe los procedimientos experimentales para evaluar la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides en las placas de Peyer a partir de progenitores comunes de células dendríticas, usando técnicas que implican el aislamiento mediada por FACS de células, la transferencia génica hidrodinámica, y análisis de flujo de subconjuntos inmunes en las placas de Peyer.

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

En este estudio presentamos un sistema de cultivo in vitro que puede generar eficientemente pDCs mediante el co-cultivo de progenitores linfoides comunes con células alimentadoras AC-6 en presencia de ligando Flt3.

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Existen células del estroma de la médula (MSC) con potencial neural dentro de la médula ósea. Nuestro protocolo enriquece esta población de células a través de un preacondicionamiento hipóxico y luego las dirige a convertirse en células maduras de Schwann.

Precondicionamiento hipóxico de las células progenitoras derivadas de la médula como fuente para la generación de células maduras de Schwann

Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Aquí, describimos un nuevo método citométrico de flujo para el aislamiento prospectivo de progenitores eritroides unitarios formadores de ráfagas tempranas (BFU-e) y eritroides unitarios formadores de colonias (UFC-e) directamente de médula ósea y bazo de ratón frescos. Este protocolo, desarrollado en base a datos transcriptómicos unicelulares, es el primero en aislar todos los progenitores eritroides del tejido con alta pureza.

Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

Aprende a modificar genéticamente células precursoras mieloides murinas 32D/G-CSF-R mediante infecciones virales y evalúa sus efectos en la proliferación y diferenciación neutrofílica. Este método es fundamental para avanzar en el estudio de la hematología y la biología celular.

Proliferación y diferenciación de precursores mieloides murinas 32D/G-CFS-R las células

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