Un time-lapse, libre de etiquetas, cuantitativa fase estudio de células cancerosas humanas latentes y activos de imagen

El objetivo general de este experimento es caracterizar cuantitativamente los fenotipos angiogénicos y no angiogénicos de las células de osteosarcoma humano de manera sistemática combinando análisis de la morfología, proliferación y motilidad de las células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave con respecto al establecimiento y la progresión del cáncer humano. En particular, el escape de la latencia tumoral y el cambio endógeno.

La principal ventaja de esta técnica es que los parámetros multicelulares se pueden analizar simultáneamente mediante este método integrado de alta dispersión. Esto incluye el área celular, el grosor celular, el volumen celular, la tasa de proliferación, el tiempo de duplicación, la velocidad de motilidad, la migración y la motilidad. Para comenzar, precaliente el medio de cultivo a 37 grados centígrados en un baño de agua.

A continuación, extraiga los viales criogénicos de células de osteosarcoma humano angiogénico y no angiogénico del tanque de nitrógeno líquido. Sumerja el fondo de los viales en un baño de agua a 37 grados centígrados y agite suavemente los viales criogénicos para acelerar el proceso de descongelación. Tan pronto como se descongelen las células, rocíe el vial con etanol al 70% y limpie el vial para esterilizarlo.

A continuación, aspire inmediatamente la suspensión celular del vial y suspenda suavemente en 10 mililitros de medio de cultivo caliente. A continuación, centrifugar las suspensiones celulares durante cinco minutos para granular las células. De vuelta en el capó, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda con 10 mililitros de medio de cultivo calentado.

A continuación, transfiera la suspensión de la célula a un matraz T75. Pipetee suavemente la suspensión celular varias veces para dispersar uniformemente las células. Coloque el matraz en una incubadora y deje que las celdas se adhieran durante al menos 12 horas.

Cambie el medio de cultivo cada dos o tres días. Cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 100 por ciento, retire el medio de cultivo del matraz y lave las células con cinco mililitros de PBS estéril sin calcio ni magnesio. A continuación, añada un mililitro de una solución de EDTA al 0,25% en el matraz y agite brevemente el matraz.

Incube el matraz durante dos o tres minutos y luego revise las células bajo un microscopio para asegurarse de que las células estén redondeadas y desprendidas. Una vez que las células se hayan separado, use una pipeta para agregar 10 mililitros de medio de cultivo y pipetee suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo varias veces para romper los agregados celulares restantes. Después de contar las células, siembre dos millones de ellas en un nuevo matraz T75.

Coloque el matraz en una incubadora y cultive las células hasta una confluencia de entre el 80 y el 100 por ciento antes de sembrar las células para el experimento de imágenes de fase cuantitativa. Recolecta células por digestión tripson y siembra células de osteosarcoma humano angiogénico y no angiogénico en placas de seis pocillos con una densidad de 50.000 a 300.000 células por pocillo. Cubrir las células con un total de cinco mililitros de medio de cultivo.

A continuación, incuba las placas durante al menos 12 horas para dar tiempo a que las células se adhieran. Reemplace el medio con medios nuevos antes de obtener imágenes. Limpie un cubreobjetos enjuagándolo varias veces con agua desionizada corriente.

A continuación, sumérjalo en una solución de etanol al 75% durante 15 minutos. Coloque el cubreobjetos esterilizado en una campana de flujo laminar para que se seque. A continuación, coloque con cuidado el cubreobjetos en una placa de seis pocillos, evitando las burbujas obvias.

Coloque la placa en la incubadora para que se equilibre durante al menos 15 minutos. Si se forma niebla en la tapa del plato, use un hisopo de algodón estéril para limpiarlo antes de tomar imágenes. Abra el software de imágenes de fase cuantitativa e inicialice el sistema.

Asegúrese de que los valores sean aceptables en la autocalibración del tiempo de exposición, el contraste del patrón y el ruido del holograma. A continuación, coloque la placa de seis pocillos en la platina del microscopio de imágenes de fase cuantitativa. De vuelta en el software, haga clic en captura en vivo.

A continuación, vaya al menú de enfoque del software y seleccione manual. A continuación, vaya al menú de configuración del microscopio y enfoque de forma aproximada las imágenes de fase de las células ajustando la distancia de trabajo para obtener contornos de las células en las imágenes de fase. Cuando termine, vuelva al menú de enfoque del software y cambie la configuración de enfoque a automático.

Ahora haga clic en nuevo experimento. Comience a seleccionar las posiciones de adquisición de imágenes con el ratón o las teclas de flecha del teclado numérico. Haga clic en recordar después de cada selección.

Una vez que se hayan seleccionado todas las posiciones, vaya a la sección de lapso de tiempo y configure los intervalos de imagen para que sean inferiores a cinco minutos y el período de tiempo total sea de 48 horas. Para iniciar el experimento, haga clic en capturar. Esto enfocará y adquirirá automáticamente imágenes en las posiciones seleccionadas en cada punto de tiempo de intervalo.

Después de la adquisición de la imagen, analice la morfología de las células haciendo clic primero en identificar celdas. Ajuste la configuración numérica del umbral de fondo para que las áreas de celda estén bien separadas del ruido de fondo. A continuación, ajuste el número de configuración para el tamaño del objeto para asegurarse de que cada celda tenga un solo núcleo.

Modifique manualmente los segmentos de celda que no coincidan con este requisito mediante cambios manuales. A continuación, utilice la función de análisis de datos del software para analizar las celdas. Inicie un nuevo análisis de datos haciendo clic en nuevo análisis.

Arrastre las imágenes seleccionadas a la pestaña de fotogramas de origen y registre los parámetros de morfología de la celda, incluido el área de la celda, el grosor óptico y el volumen de cada celda individual. Cuando termine, elija el modo de diagrama de dispersión o histograma y exporte los datos como tablas o figuras. Seleccione al menos cinco imágenes espaciadas por 12 horas y registre los números de celda proporcionados por el software.

Calcule la tasa de proliferación de las células normalizando con los números de células iniciales y luego graficando los números de células. Por último, estime el tiempo de duplicación ajustando los puntos de datos utilizando una curva de crecimiento exponencial. Para analizar el movimiento de las células, utilice la función de seguimiento de celdas en el software.

Comience haciendo clic en nuevo análisis para iniciar un nuevo análisis de datos. A continuación, arrastre una serie de imágenes del período de tiempo de interés a la pestaña de fotogramas de origen. A continuación, en el modo de selección de agregar celdas, elija aleatoriamente de 10 a 30 celdas haciendo clic en ellas.

Asegúrese de revisar el seguimiento en la serie de imágenes. En el caso de que el sistema pierda el rastro de una celda o rastree la celda incorrecta, ajuste manualmente la celda de seguimiento haciendo clic en identificar para identificar celdas o yendo al modo de selección y haciendo clic en modificar ubicación para modificar la ubicación de una celda. Cuando termine, vaya a trazar movimiento y elija el gráfico de filas de las trayectorias de las celdas o vaya a trazar las características y trazar los otros parámetros relacionados con el movimiento, como la velocidad de motilidad, la motilidad, la migración y la dirección de la migración.

Exporte los datos como tablas o figuras. En este protocolo, las imágenes de fase cuantitativa se presentan como hologramas. Las células que se muestran aquí representan la morfología celular típica de las células de osteosarcoma humano angiogénico y no angiogénico.

El grosor de la celda se calcula mediante el índice de refracción y la longitud del camino óptico y se muestra aquí como un diagrama de dispersión. Los dos tipos de fenotipos de células diferentes mostraron diferentes patrones de distribución e indican que las células angiogénicas tienen áreas celulares más pequeñas y un mayor grosor celular que las células no angiogénicas. La tasa de proliferación celular de los dos tipos de células se puede calcular a partir de imágenes 2D como estas, que han sido segmentadas y abarcan el transcurso de dos días.

Para estos tipos específicos de células, no se encontraron diferencias significativas. Para determinar las características de movimiento de las células, se deben seleccionar y realizar un seguimiento de las células individuales a lo largo del tiempo. Aquí, las celdas rastreadas están delineadas con diferentes colores.

Cada celda individual se rastreó en el transcurso de cuatro horas con su trayectoria total descrita aquí, donde el punto cero, cero es su ubicación inicial y su ubicación final se indica con el punto de color. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar imágenes de fase cuantitativas para comparar cuantitativamente una bandeja de parámetros morfológicos y de comportamiento de la célula. En este caso, entre fenotipos celulares angiogénicos y no angiogénicos.

Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer exploraran el escape de la latencia tumoral y el papel de la angiogenia en este proceso. En una plataforma continua y sin etiquetado. No olvide que trabajar con líneas celulares humanas puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento.