Tratamiento combinacional de tricostatina A y la vitamina C mejora la eficiencia de la clonación de ratones por transferencia Nuclear de células somáticas

El objetivo general de este experimento es mejorar la eficiencia de la producción de embriones reconstruidos y ratones clonados mediante la transferencia nuclear de células somáticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología básica, la biología del desarrollo y el rescate de animales en peligro de extinción. Tales como el desarrollo embrionario, la programación nuclear y la conservación de la investigación genética.

La principal ventaja de este método y técnica es que es posible generar ratones clonados con un nivel práctico de eficiencia con procedimientos sencillos. Después de preparar el medio de cultivo de acuerdo con el protocolo de texto, disuelva 1,2 gramos de BSA en 10 ml de agua estéril a temperatura ambiente. Agregue aproximadamente 0,12 gramos de perlas de resina de intercambio iónico mixto a la solución BSA a temperatura ambiente con una agitación suave.

Cuando las cuentas cambien de color de azul verde a dorado, use una pipeta para recuperar la solución sobrenadante, luego reemplace las cuentas con un lote nuevo. Después de confirmar que las cuentas frescas no cambian de color, recupere la solución. A continuación, añadir 250 microlitros de bicarbonato de sodio al 10,5%.

Con un filtro de 0,45 micras, esterilice el sobrenadante, luego etiquételo como solución madre DBSA y guárdelo a menos 20 grados centígrados. Después de realizar la eutanasia en ratones hembra sometidos a superovulación de acuerdo con el protocolo de texto, se utilizaron técnicas de disección estándar para incidir el abdomen para acceder al tracto reproductivo. Con unas tijeras rectas pequeñas y unas pinzas, extirpe los oviductos y transfiéralos a una hoja de papel de filtro para limpiar la sangre de la superficie.

A continuación, coloque los oviductos en aceite mineral, luego use agujas de disección para cortar la ampolla del oviducto y mueva los complejos de ovocitos del cúmulo que provienen de la ampolla en 200 gotas de microlitros de medio HCZB con hialuronidasa al 0,1%. Incuba el tejido en una placa de calentamiento durante cinco minutos. Bajo un microscopio estereoscópico, confirme que las células del cúmulo se liberan de los complejos de ovocitos del cúmulo, luego transfiera los ovocitos de la segunda etapa meiótica o de metafase M2 con algunas células del cúmulo restantes al medio MKSOM que contiene 0,3% de DBSA.

Lave los ovocitos de la etapa M2 cuatro veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo en el medio para separar las células del cúmulo restante. Luego incubar los ovocitos en medio a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta la enucleación. Para aislar los ovocitos denudados de los complejos de ovocitos del cúmulo, bajo un microscopio estereoscópico mientras se utiliza una pipeta, se transfiera un pequeño número de las células del cúmulo restantes dispersas de los complejos de ovocitos del cúmulo al medio HCZB con 6% de DBSA.

Coloque las células del cúmulo en la placa de calentamiento a 37 grados centígrados hasta que sea necesario para la transferencia nuclear de células somáticas o SCNT. Después de preparar el medio PVP y las soluciones madre de CB de acuerdo con el protocolo de texto, utilice una pipeta esterilizada con 20 microlitros de medio HCZB que contenga cinco microgramos por mililitro de CB para lavar los ovocitos en estadio M2. Después de repetir el lavado cinco veces, incubar los ovocitos en solución de enucleación en la placa de calentamiento durante 10 minutos.

A continuación, prepare la cámara de enucleación, luego use una pipeta para transferir los ovocitos M2 a la cámara. Agregue cuatro microlitros de solución de enucleación y cubra la cámara con aceite mineral. Bajo un microscopio a temperatura ambiente, identifique los husos y los cromosomas del ovocito en etapa M2.

A continuación, con una pipeta de sujeción y una micropipeta, oriente el ovocito con un primer cuerpo polar pronunciado de modo que la posición del huso y el cromosoma esté en la posición 3:00 o 9:00. Ajuste la intensidad del pulso del paizo de tres a seis, y con una pipeta de micromanipulación, perfore hasta la zona pelúcida y abra un agujero en ella. Luego, con una cantidad mínima de citoplasma, enuclear completamente los husos y los cromosomas.

Bajo luz visible, confirme la ausencia de cromosomas en el citoplasma, luego con un medio MKSOM que contenga 0.3% de DBSA sin CB, lave a fondo los ovocitos enucleados. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta la fusión celular. Para preparar el HBJE, agregue 260 microlitros de solución de suspensión de HBJE helada al HVJ-E liofilizado y pipetee hacia arriba y hacia abajo hasta que esté completamente suspendido.

Prepare cinco alícuotas de microlitros de la solución y guárdelas a menos 80 grados centígrados hasta la fusión celular. Para llevar a cabo la fusión celular, use 20 microlitros de tampón de fusión celular para diluir cinco microlitros de solución de HVJ-E. Coloque la solución diluida de HBJE en hielo hasta su uso.

Después de preparar la cámara de fusión celular como se muestra aquí, use una pipeta para transferir los ovocitos enucleados al medio HCZB en la cámara. Agregue cuatro microlitros de cada solución como se muestra y use aproximadamente un mililitro de aceite mineral para cubrir la cámara. Coloque la cámara con los ovocitos enucleados a temperatura ambiente bajo un microscopio con un aumento de 400x.

A continuación, con la pipeta de micromanipulación, transfiera las células del donante a la solución de suspensión HVJ-E. Aspire las células del cúmulo una por una para separarlas por igual entre sí, lo que permite la fusión de células en serie. A continuación, con una pipeta de sujeción, mantenga los ovocitos enucleados en medio HCZB y utilice el pulso de paizo con la pipeta de micromanipulación para perforar la zona pelúcida.

Después de abrir el orificio en la zona pelúcida, pipetear un cúmulo de células con aproximadamente cinco veces el volumen de la solución HVJ-E y expulsarla firmemente dentro de la membrana del ovocito sin pasar por la membrana. Después de la manipulación de la fusión celular, transfiera rápidamente los ovocitos a un medio MKSOM que contenga 0,3% de DBSA y muévalos a una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante una hora. Los pasos posteriores deben completarse en un plazo de 10 minutos desde la colocación de los ovocitos enucleados en medio HCVB bajo el microscopio hasta su regreso a la incubadora.

Después de la fusión celular, bajo un microscopio con un aumento de 400x, compruebe si hay condensación cromosómica prematura en los ovocitos reconstruidos. Transfiera los ovocitos reconstruidos a un medio de activación que contenga tristolatina A, o TSA, e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en el aire durante seis horas. Observar la formación de pronúcleos en los embriones SENT, luego aplicar dos horas más de tratamiento con TSA en medio MKSOM con 0,3% de TBSA.

Llevar a cabo el tratamiento con vitamina C según el protocolo de texto. Como se observa en esta tabla, el tratamiento con TSA y vitamina C en ovocitos de ratones clonados mostró una tasa muy alta de formación de pronucleares y se desarrolló hasta la etapa de dos células en todas las condiciones. Algunos embriones clonados, que se derivaron de células de cúmulos y se desarrollaron hasta la etapa de dos células, se transfirieron a oviductos de hembras pseudo embarazadas.

Esta figura muestra seis crías clonadas que se desarrollaron a partir de 72 embriones transferidos producidos a partir de tres hembras embarazadas mediante el tratamiento en serie de TSA y vitamina C. Finalmente, como se demostró aquí, el tratamiento con TSA y VC mejoró significativamente la eficiencia del desarrollo embrionario in vitro hasta la etapa de blastocisto. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que todos los medios y reactivos necesarios se preparan con anticipación. El procedimiento en sí mismo, un material fácil de seguir y bien preparado, garantizará el logro de los resultados esperados.

Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo producir ovocitos reconstruidos.