Ingeniería Genética de Organoides Intestinales de Ratón Primario utilizando Vectores Virales de Transducción de Nanopartículas Magnéticas para Seccionamiento Congelado
10 de mayo de 2019
Describimos instrucciones paso a paso para: 1) diseñar de manera eficiente organoides intestinales utilizando nanopartículas magnéticas para la transducción lenti- o retroviral, y, 2) generar secciones congeladas a partir de organoides diseñados. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para alterar eficientemente la expresión génica en organoides para la investigación de los efectos posteriores.
Debido a que los organoides recapitulan la organización estructural nativa, así como muchas características moleculares del epitelio intestinal in vivo, esta técnica nos permite estudiar la biología normal y los estados de la enfermedad en el laboratorio. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de diseñar genéticamente organoides utilizando un enfoque de transducción muy altamente eficiente con baja citotoxicidad, lo que permite estudios funcionales de estos organoides manipulados genéticamente. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para la enfermedad intestinal porque podemos exponer organoides intestinales a fármacos y otros agentes o intervenciones.
Este método se puede aplicar para estudiar procesos patéticos y de desarrollo en otros sistemas susceptibles de cultivos organoides, como los tejidos mamarios o para las células que crecen bajo condiciones 2D estándar. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán éxito con la transducción en organoides difíciles de ingenieros u otras células. Primero tuvimos la idea de este método cuando nos encontramos con dificultades para transducir nuestros organoides y células madre.
La demostración visual de este método es crítica, ya que la pérdida estructural de los organoides puede ocurrir si las muestras no se tratan adecuadamente durante el proceso de incrustación en la matriz del sótano para la criosectación. Para cultivar organoides para la transducción viral, los cultivos celulares organoides de semillas con 200 microlitros de medios de transducción por pozo en una placa de 48 pozos, e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar. Descongelar viales de virus para la transducción, permitiendo alrededor de 50 microlitros de virus concentrados para la transducción de cada pozo en placas de 48 pozos.
En un tubo de 1,5 mililitros, mezcle el virus con 12 microlitros de una solución de nanopartícula magnética e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, agregue la solución de nanopartículas magnéticas y la mezcla de virus a las células a transducir. Coloque la placa de 48 pozos en una placa magnética e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar durante al menos dos horas.
Cuando la transfección viral esté completa, transfiera los racimos de células organoides infectadas y el medio de transducción de cada pozo a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante con succión suave y enfríe los tubos que contienen el pellet sobre hielo durante cinco minutos.
Añadir 120 microlitros de matriz de membrana sótano a cada tubo, y resuspender el pellet pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. Siembra de 30 microlitros de la mezcla matriz-célula en una nueva placa de 48 pozos. Incubar la placa a 37 grados celsius durante cinco a 15 minutos hasta que la matriz se solidifique.
Añadir medio de transducción a cada pozo, e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar durante tres a cuatro días. Después de tres a cuatro días, inspeccione los cultivos bajo un microscopio de luz con un aumento de 10 veces para asegurar la organización de los racimos celulares en estructuras organoides. Sustituya suavemente el medio de transducción en cada pozo por 250 microlitros de medio de cultivo organoide ENR.
Devuelva la placa a la incubadora. Comience este procedimiento retirando el medio ENR por succión suave, teniendo cuidado de no perturbar la matriz de membrana del sótano. Lavar suavemente con 500 microlitros de PBS.
Fijar los organoides añadiendo un microlitro de 4%solución de paraformaldehído por pozo, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de 30 minutos, retire la solución de paraformaldehído por succión. Agregue suavemente un microlitros de PBS por pozo, y luego retire el PBS por succión suave.
De esta manera, lave dos veces con PBS. Retire el PBS del segundo lavado y agregue un microlitros de 30% de tampón de sacarosa a cada muestra. Incubar los organoides fijos en sacarosa durante una hora a cuatro grados centígrados para deshidratar las muestras.
Retire el búfer de sacarosa por succión, y agregue suficiente compuesto de incrustación para cubrir la capa de matriz en cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, coloque las muestras en un congelador celsius de menos 80 grados durante 10 minutos o hasta que el compuesto de incrustación se vuelva sólido y blanco.
Coloque la placa con compuesto de incrustación congelado a temperatura ambiente para permitir una fusión mínima del compuesto a lo largo de los bordes. Usa un bisturí o una espátula para separar el bloque de las paredes del pozo. Trabaje rápidamente para evitar el derretimiento, utilizando fórceps para eliminar el bloque compuesto de incrustación de matriz, y colóquelo en un bloque de muestras.
Llene el molde completamente con compuesto de incrustación. Congele a menos 80 grados Centígrados durante 30 minutos antes de usar el bloque para seccionar. Este protocolo se optimizó transduciendo primero organoides intestinales con vectores lentivirales vinculados a la GFP.
La GFP se visualizó en cada etapa del desarrollo organoides, incluso al principio cuando las células de la cripta se organizan en estructuras similares a quistes o en momentos posteriores cuando los organoides forman brotes. Los organoides intestinales transducidos con éxito fueron entonces fijados por formalina, criocoscionados y analizados por imágenes de inmunofluorescencia. En esta imagen, los núcleos se tiñen de azul, y el verde indica moléculas de adhesión de células epiteliales, que demarcan los bordes celulares.
El rojo indica manchas de lisosoma para identificar las celdas de Paneth. Una vez dominados, los organoides transductores se pueden realizar en unas tres horas, y la incrustación de la criosectación de organoides se puede hacer en aproximadamente 2 horas y media. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar en hielo al manipular reactivos de matriz de sótano.
Después de completar este procedimiento, se pueden realizar análisis inmunofluorescentes y otros métodos para detectar proteínas u orgánulos para evaluar la localización o la abundancia relativa. Esta técnica allana las formas para que los investigadores exploren la biología normal y los estados de la enfermedad in vitro y también para estudios in vivo si los organoides o células transducidas se pueden implantar en ratones. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo utilizar virus etiquetados magnéticamente para diseñar genéticamente organoides para la criocciones.
Por favor, no olvide que trabajar con virus puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección adecuado al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para la ingeniería de organoides intestinales utilizando nanopartículas magnéticas para la transducción génica eficiente. También detalla la generación de secciones congeladas a partir de estos organoides modificados, lo que facilita el estudio de la expresión génica y sus efectos posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Tecnología de organoides
Antecedentes
- Los organoides imitan las características estructurales y moleculares del epitelio intestinal in vivo.
- Esta técnica permite el estudio de la biología normal y de estados patológicos.
- La ingeniería genética de organoides puede lograrse con baja citotoxicidad.
- Las aplicaciones se extienden a la exposición a fármacos y a intervenciones para enfermedades intestinales.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para la transducción de organoides.
- Permitir estudios funcionales de organoides manipulados genéticamente.
- Facilitar el estudio de procesos desarrollados y patológicos.
Métodos Utilizados
- Desarrollo de organoides intestinales con nanopartículas magnéticas.
- Transducción con lenti- o retrovirus para modificar la expresión génica.
- Obtención de secciones congeladas a partir de organoides modificados.
- Estudios funcionales mediante organoides modificados genéticamente.
Resultados Principales
- Demuestra alta eficiencia en la transducción de organoides difíciles de manipular genéticamente.
- Mostró baja citotoxicidad asociada con el método de transducción.
- Proporcionó información sobre los efectos de las modificaciones genéticas en la función de los organoides.
- Destacó las posibles aplicaciones terapéuticas para enfermedades intestinales.
Conclusiones
- El método ofrece una herramienta poderosa para estudios de expresión génica en organoides.
- Se puede aplicar a diversos cultivos de organoides más allá de los tejidos intestinales.
- La investigación futura puede aprovechar esta técnica para intervenciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La ingeniería genética eficiente de organoides intestinales permite una evaluación funcional rápida de objetivos genéticos en un sistema fisiológicamente relevante, reduciendo la dependencia de protocolos CRISPR costosos y que consumen mucho tiempo. Este enfoque facilita la validación temprana de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas al vincular la modulación genética con lecturas fenotípicas en estructuras epiteliales relevantes para enfermedades. El método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al preservar la arquitectura nativa del tejido, a la vez que posibilita una transducción escalable y reproducible para estudios posteriores de respuesta a fármacos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación rápida de hipótesis terapéuticas mediante la transducción viral eficiente de organoides intestinales con mínima citotoxicidad.
- Valor operativo: Reduce el tiempo y el costo asociados con la selección y cribado mediante CRISPR/Cas9, acelerando los plazos de validación de dianas.
- Valor estratégico: Facilita la evaluación funcional de la expresión o silenciamiento génico en compartimentos de células madre y criptas, mejorando la confianza en las dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera organoides con capacidad de transducción adecuados para el análisis inmunohistoquímico o inmunofluorescente de los cambios en la expresión génica.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo estandarizado para la sección por congelación que preserva la morfología tisular para estudios posteriores de localización proteica.
- Valor estratégico: Permite la evaluación confiable de compuestos al posibilitar estudios de exposición a fármacos en organoides modificados genéticamente que imitan la organización epitelial in vivo.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la evaluación de la función de las células madre intestinales y de las criptas tras manipulaciones genéticas, apoyando lecturas funcionales relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Permite implantar organoides transducidos en ratones para análisis funcionales in vivo, vinculando hallazgos in vitro con validación fisiológica.
- Valor estratégico: Facilita la predicción de respuestas terapéuticas mediante la modelización de los efectos de fármacos sobre la expresión génica o la función proteica, en lugar de alteraciones genómicas.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir una modulación génica rápida en organoides, facilitando el avance desde la hipótesis del blanco hasta la validación funcional antes de la identificación del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la transducción eficiente de organoides intestinales para estudios de expresión génica o silenciamiento.
- Cribado Proporciona organoides genéticamente modificados, listos para ensayos, con morfología preservada para imágenes cuantitativas y lecturas funcionales.
- Análisis: Permite la cuantificación basada en inmunofluorescencia de moléculas de adhesión epitelial, marcadores lisosomales y tinción nuclear para evaluar la eficiencia de transducción y los fenotipos celulares.
- Investigación traslacional Conecta la ingeniería de organoides in vitro con estudios in vivo mediante la implantación de organoides transducidos en ratones para análisis funcional.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la manipulación genética de organoides intestinales y otros epiteliales, aplicable a múltiples objetivos y campañas de cribado de fármacos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al vincular modificaciones genéticas con resultados funcionales en un sistema epitelial relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante la transducción asistida por nanopartículas magnéticas y corte criostático estandarizado.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al reducir la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas mediante evaluación fenotípica rápida.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en las respuestas funcionales de organoides a perturbaciones genéticas y farmacológicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de organoides, manipulación de virus y preparación de nanopartículas magnéticas.
- Necesita acceso a placas magnéticas, equipos de criostato e infraestructura para imágenes de inmunofluorescencia.
- Exige una formación estandarizada para prevenir la pérdida estructural durante los pasos de inclusión y seccionado.
- Requiere optimización entre diferentes tipos de organoides y serotipos virales para lograr una eficiencia de transducción constante.
- Implica precauciones de bioseguridad debido al uso de vectores virales, incluyendo equipos de protección personal (PPE) y protocolos de contención.
