Análisis cinético de vasculogénesis cuantifica la dinámica de la vasculogénesis y angiogénesis In Vitro

El objetivo general de este método experimental es visualizar y cuantificar el proceso dinámico de la vasculogénesis a lo largo del tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la angiogénesis y la vasculogénesis sobre las tasas de formación de vasos y las diferencias entre los patrones estructurales de la red formada. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación de un gran número de puntos temporales de vasculogénesis, lo que brinda la oportunidad de evaluar la cinética del proceso vasculogénico.

Este método se puede aplicar a cualquier población celular o estado patológico que afecte los procesos de vasculogénesis o angiogénesis para el estudio de poblaciones celulares individuales o sistemas de cocultivo. Aproximadamente una o dos horas antes de comenzar el experimento, precaliente una incubadora superior de etapa de microscopio a 37 grados centígrados y ajuste el dióxido de carbono al 5% y la humedad al 85%. Coloque la cámara de células vivas en el microscopio y, a continuación, coloque un portaobjetos vacío en una de las dos posiciones abiertas dentro de la cámara de células vivas.

Llene el portaobjetos con agua destilada y ajuste un soplador secundario a 39 a 42 grados centígrados para calentar los portaobjetos desde abajo y minimizar la condensación. Mantener la temperatura y la humedad adecuadas dentro de la cámara de imágenes de células vivas es fundamental para el éxito del experimento. Agregue una segunda diapositiva en blanco hasta que se pueda agregar la diapositiva experimental.

Luego, agregue agua a los depósitos que rodean los pozos en el segundo portaobjetos para imitar las condiciones durante el experimento de imágenes. Para cargar el portaobjetos de la cámara experimental con matriz de membrana basal, primero cargue una pipeta de 20 microlitros con una punta de pipeta fría de 20 microlitros y use unas tijeras para cortar aproximadamente un centímetro desde el extremo de la punta. Ajuste el volumen de la pipeta a ligeramente más de 10 microlitros y aspire lentamente la matriz en la punta de la pipeta modificada.

Coloque inmediatamente la punta de la pipeta en el centro de un pocillo deslizante, tocando suavemente la punta con el fondo del pocillo, y presione lentamente el émbolo para empujar la matriz hacia afuera. Después de agregar la matriz a los 15 pocillos, empuje la tapa hasta el fondo del portaobjetos. El pipeteo preciso y consistente de los volúmenes de Matrigel en cada pocillo es fundamental para obtener imágenes de contraste de fase de alta calidad.

Luego, coloque el portaobjetos a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos junto a una tapa de tubo cónico de 50 mililitros llena de dos a tres mililitros de PBS para reducir la deshidratación de la matriz. Cuando la matriz se haya solidificado, retire el sobrenadante de un cultivo celular formador de colonias endoteliales cultivado durante la noche y lave las células con siete mililitros de PBS. Aspire el PBS, lave y separe las células con dos a tres mililitros de tripsina a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos.

A continuación, vuelva a suspender las células disociadas en tres mililitros de Endothelial Growth Medium-2 para romper los grupos de células y transferir la suspensión celular resultante a un tubo cónico de 15 mililitros. Después de que se hayan resuspendido todas las muestras de células formadoras de colonias endoteliales, granule las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en uno o dos mililitros de medio de crecimiento endotelial fresco. Cuente el número de células viables en cada muestra y agregue suficientes células formadoras de colonias endoteliales en un nuevo tubo de 1,5 mililitros para permitir la dilución de las células a una concentración de 1,4 veces 10 a la cuarta célula por 175 microlitros de concentración media.

A continuación, mezcle cada mezcla maestra con un pipeteo suave. Retire la tapa del portaobjetos y ceda 50 microlitros de cada mezcla maestra por pocillo por triplicado en el portaobjetos. Para obtener una imagen de las células, reemplace el portaobjetos en blanco por un portaobjetos experimental y agregue agua a los depósitos que rodean las celdas en el portaobjetos.

Recorra cada posición de la etapa y confirme que el centro del primer pozo esté seleccionado. Concéntrese en las celdas colocadas en el pozo y establezca la posición Z de la plataforma. Cuando los ajustes sean precisos, apague las luces para comenzar el experimento de imágenes.

Una vez completada la imagen, escale y exporte los archivos de la pila de imágenes dentro del software Image Capture, guardando las imágenes como archivos TIFF para su análisis. Para analizar las imágenes, arrastre el archivo de análisis cinético de vasculogénesis desde su carpeta a la barra gris en la parte inferior de la ventana del software para abrir el software y haga clic en Guardar para agregar el software a la lista. Haga clic en Archivo y Abrir para seleccionar el archivo de imagen que desea abrir, o arrastre el archivo de imagen a la barra gris dentro del software.

Haga clic en Imagen, Ajustar y Brillo/Contraste para abrir la ventana Brillo/Contraste. Haga clic en Restablecer dentro de la ventana Brillo/Contraste para visualizar la imagen. A continuación, haga clic en Imagen, Tipo y 8 bits para convertir las imágenes a 8 bits.

Seleccione Herramientas y Administrador de regiones de interés y utilice una herramienta de selección con la forma adecuada para crear una nueva región de interés. Haga clic en Agregar para agregar la forma de región de interés a la ventana Administrador de región de interés y haga clic en la etiqueta Región de interés en el Administrador de región de interés para ver la región en la imagen. Ajuste la región de interés según sea necesario.

Cuando la región esté en su lugar, haga clic en Imagen y, a continuación, en Recortar, para recortar la imagen. A continuación, abra el menú Editar y seleccione Borrar fuera para eliminar los datos de la imagen fuera de la región de interés de cada imagen de la pila. A continuación, abra el menú Plugins y seleccione el plugin Analizar red.

Utilice la flecha desplegable en la ventana emergente para cambiar el método de umbral y haga clic en Aceptar para iniciar el procesamiento del software. Al final del análisis, se abrirá una tabla de datos y una pila de imágenes fusionadas que representan representaciones de esqueleto y máscara. Haga clic en Archivo y Guardar como para transferir los valores numéricos a una hoja de cálculo y guardar la hoja de cálculo que contiene los valores de datos sin procesar.

Haga clic en la imagen fusionada de esqueleto y máscara y guarde la pila de imágenes de máscara de esqueleto fusionada y la pila de imágenes de contraste de fase recortadas como archivos TIFF. A continuación, haga clic en la ventana Administrador de regiones de interés, seleccione la región de interés utilizada para recortar las imágenes y haga clic en Más y Guardar para guardar la región de interés para su uso futuro. Las redes celulares formadoras de colonias endoteliales, identificadas por el análisis cinético de la vasculogénesis, se representan pictóricamente como representaciones de esqueleto y máscara para ilustrar las estructuras utilizadas por el software para la cuantificación.

Cuando la calidad de las imágenes de contraste de fase es alta y se logra un contraste suficiente, el análisis cinético de la vasculogénesis identificará con precisión las redes celulares formadoras de colonias endoteliales, como lo indican las similitudes observadas entre la imagen de contraste de fase y las representaciones de esqueleto y máscara generadas por el análisis cinético de la vasculogénesis. Si las imágenes de contraste de fase no tienen un alto contraste, o si se producen artefactos de imagen como cuadrículas, la precisión de la detección de la red se reduce y los resultados se vuelven ambiguos. Sin embargo, se pueden seleccionar diferentes métodos de umbral, como la media y el Otsu, que se muestran aquí, antes del análisis en el menú desplegable del software para adaptarse a las diferencias en la calidad de la imagen.

El uso del análisis cinético de la vasculogénesis para determinar si las células formadoras de colonias endoteliales expuestas a la diabetes mellitus gestacional muestran una cinética alterada de la formación de la red, revela una formación de estructura de red heterogéneamente alterada en los cultivos de diabetes mellitus gestacional en comparación con los cultivos de células formadoras de colonias endoteliales de un embarazo sin complicaciones. De hecho, las muestras de embarazo sin complicaciones suelen formar un mayor número de redes cerradas en comparación con las muestras de diabetes mellitus gestacional. Sin embargo, todas las muestras de células formadoras de colonias endoteliales muestran un patrón bifásico de formación de redes en general, aunque las tasas de formación y el número máximo de redes alcanzadas varían entre las muestras.

Siguiendo este procedimiento, los valores de los datos generados por el Análisis Cinético de la Vasculogénesis pueden ser graficados y analizados para determinar si las estructuras de red formadas por las diferentes muestras son estadísticamente diferentes y, en caso afirmativo, en qué puntos temporales. El análisis cinético de la vasculogénesis permite el procesamiento eficiente de experimentos de lapso de tiempo que involucran un gran número de imágenes. Una vez dominado, la adquisición, el posprocesamiento y el análisis de la imagen pueden completarse en dos días si todos los sistemas funcionan correctamente.