La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso de una plataforma de diagnóstico multiplexada en el punto de atención que no requiere una preparación extensa de la muestra ni instrumentación costosa, y que se utiliza en una variedad de muestras biológicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del diagnóstico en el punto de atención, como la detección de diferentes objetivos en un solo tubo de reacción. Mediante el uso de la amplificación isotérmica mediada por bucles junto con sondas de desplazamiento de hebras específicas del objetivo, se pueden detectar de manera eficiente tres virus diferentes.

La principal ventaja de esta técnica es que utiliza la amplificación isotérmica en lugar de la PCR y requiere una preparación mínima de la muestra y se puede aplicar a una serie de muestras clínicas. Comience cortando hojas de papel Q en pequeños rectángulos de tres milímetros por cuatro milímetros con una perforadora de papel. Luego, use un micromortero para triturar los mosquitos hembra Aedes aegypti potencialmente infectados con el Zika en cada papel.

Pipetee 20 microlitros de una solución acuosa de amoníaco molar en cada hoja de papel. Después de cinco minutos, lave cada papel con 20 microlitros de etanol al 50%, seguidos de 20 microlitros de agua sin nucleasas. Seque el papel al aire en un gabinete de bioseguridad BSL-2 durante aproximadamente una hora.

Después del secado, use pinzas para sumergir completamente cada papel en 100 microlitros de mezcla de reacción RT-LAMP e incube a 65 a 68 grados Celsius durante 45 minutos. Lea y registre la fluorescencia proveniente del virus del Zika utilizando una caja de observación impresa en 3D con una fuente de luz LED y un filtro naranja o amarillo. Comience añadiendo 90 microlitros de tampón de rehidratación de 1,1 veces a cada tubo de reacción que contenga reactivos RT-LAMP liofilizados y disuelva agitando.

A continuación, gira brevemente hacia abajo a 1.000 veces la gravedad. Después de la centrifugación, agregue 10 microlitros de muestra de orina enriquecida con el ARN viral a los tubos de reacción y mezcle mediante pipeteo. Si realiza pruebas con mosquitos, agregue un rectángulo de papel Q-paper que contenga los cadáveres de mosquitos junto con 10 microlitros de agua purificada en lugar de orina.

Coloque los tubos cerrados en un bloque de calor preestablecido a 65 a 68 grados centígrados e incube durante 30 a 45 minutos. Después de la incubación, mantenga los tubos cerrados para evitar la contaminación de futuros ensayos y colóquelos en la caja de observación. Encienda el interruptor en la parte posterior de la caja de observación.

Observe la muestra a través del filtro naranja y capture la imagen con la cámara de un teléfono celular que se mantiene a una distancia donde la imagen llena el 80% del campo de visión. Una vez completada la visualización, apague el interruptor. Guarde los tubos sellados en la oscuridad, preferiblemente con refrigeración si se necesita una visualización posterior.

Tanto en el caso singleplex como en el multiplex, los productos RT-LAMP aparecen como una letra de concatemero cuando se ejecutan con gel de agarosa. Las muestras de control negativo que contenían agua como muestra proporcionaron solo las bandas para los cebadores propiamente dichos, incluido el control objetivo inespecífico, donde se utilizó ácido nucleico total extraído de un mosquito hembra no infectado como plantilla. Se observa fluorescencia verde para el zika utilizando sondas como NT de cinco primos marcados con FAM.

La fluorescencia de color amarillo verde claro se asigna a Chikungunya, donde la sonda es NT de cinco primos marcados con HEX. Se utiliza una fluorescencia de color rojo anaranjado para el Dengue-1, donde su sonda es NT de cinco primos marcados con TAMRA. Dos papeles que contenían mosquitos se sumergieron directamente en la mezcla RT-LAMP y, después de la incubación a 65 grados centígrados durante 30 minutos, se observó una fluorescencia verde brillante en presencia del virus del Zika.

Usando nueve volúmenes de tampón de rehidratación y un volumen de muestra de orina, se puede generar fluorescencia verde visible en 30 minutos y la imagen puede ser capturada por la cámara de cualquier teléfono celular. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del diagnóstico clínico exploraran plataformas de punto de atención para detectar virus transmitidos por mosquitos en orina, sangre, saliva o cadáveres de mosquitos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar un sistema de amplificación isotérmica, en este caso una lámpara, para detectar el Zika y otros arbovirus en forma múltiple en una variedad de muestras biológicas.