Name: Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Aprende a identificar conexiones monosinápticas en Drosophila mediante electrofisiología de patch-clamp y canales de sodio resistentes a tetrodotoxina. Este método revela la naturaleza química de las sinapsis en el lobo antenal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a Joshua Singer, Jonathan Schenk, así como revisores pensativos por comentarios en el manuscrito. También nos gustaría agradecer a Ben White y Harold Zakon debates sobre la técnica. Jonathan Schenk proporciona los datos de la Figura 3A. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación de Whitehall y un R21 de NIH a QG.

1. preparar moscas y promotor de GAL4 identificar líneas
<ol><li>Seleccione una línea de promotor de GAL4 y cruzar con las moscas con el transgén de UAS-NaChBac y un transgen de optogenetic para la activación. Nota: CsChrimson UAS11 se selecciona debido a su alta conductancia y la facilidad con la cual activa mediada por NaChBac los potenciales de acción. UAS-NaChBac y UAS-CsChrimson están disponibles en el repositorio de las poblaciones de Bloomington.</li>
	<li>Preparar todo-trans retinal como una solución en etanol (35 mM) y guardar la solución en el congelador a-20 ° C.</li>
	<li>Mix 28 μl de este stock en aproximadamente 5 mL de patata rehidratado escamas alimento y añadir esta mezcla a la parte superior de un frasco de medios convencionales de Drosophila .</li>
	<li>Criar moscas adultas expresar csChrimson en alimentos que contienen 0,2 mM all-trans-retinal para 1 – 3 días11.</li>
</ol>2. preparar Stock TTX
<ol><li>Crear una solución stock de 1 mM TTX en agua destilada o desionizada. Almacenar esta solución en un refrigerador de laboratorio durante varios meses. Revise las políticas de las instituciones en relación con el almacenamiento de TTX como muchas instituciones clasifican TTX como una sustancia peligrosa o controlada.</li>
</ol>3. preparar moscas para electrofisiología
<ol><li>Recoger 1 – 3 días adulto viejo vuela que sobresalen en la comida con todo-trans-retinal. Nota: Consulte Murthy y Turner en 2013 para una descripción detallada del parche sujeción Drosophila las neuronas12,13.</li>
	<li>Poner las moscas en un vial de centelleo de vidrio. Coloque el frasco en hielo durante 1 minuto inmovilizar a las moscas.</li>
	<li>Utilizar pinzas gruesas para insertar una mosca en una cámara de grabación a medida. La cámara consta de un 3 ½" círculo corte láser de acrílico de 1/16". Corte un agujero de ¾" está en el centro donde se une una hoja personalizada con epoxy en 2 partes. La hoja contiene un triangular en forma de esperanza de que la mosca se le introduce.</li>
	<li>Aplique cera o epoxi curable UV alrededor del animal para fijarla firmemente dentro de la cámara de grabación.</li>
	<li>Iluminar la preparación con un cuello de cisne de fibra óptica para visualización bajo un estereomicroscopio. Fijar las fibras de cuello de cisne para la iluminación oblicua ajustando para que iluminan la marcha directamente desde el lado.</li>
	<li>Ajustar el nivel de luz a la posición más baja posible que todavía permite la clara visualización de la mosca. Esta intensidad de la luz variará a través de experimentos individuales. Nota: Este protocolo puede ser adaptado mediante el uso de un in situ cerebro explante método14.</li>
	<li>Recuperar la solución salina de grabación externos. La solución salina contiene en mM: NaCl 103, 3 KCl, 5 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoethane-sulfónico, trehalosa 8, glucosa 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2y 4 de MgCl2 (ajustado a mΩ 270 – 275). La solución salina es burbujeada con 95% O25% CO2 (carbogen) y cuenta con un pH ajustado a 7.315.</li>
	<li>Coloque 4-6 gotas de solución salina de grabación extracelular sobre la preparación de la mosca. En este punto, aumentar el nivel de luz en el microscopio de disección para una mejor visibilidad.</li>
	<li>Afilar un alambre de tungsteno mediante electrólisis. Para hacer el cable, preparar una solución saturada de KNO3 y aplicar aproximadamente 20 V de CA corriente sumergir la punta del alambre en la solución 20 veces para 100 ms hasta que la punta es afilada. Use el alambre de tungsteno afilada para quitar la cutícula sobre la cabeza de la mosca y exponiendo el cerebro.</li>
	<li>Además exponer el cerebro quitando tráquea y cuerpos grasos que lo rodean. Si acceder a los lóbulos antenales, use un alambre de tungsteno doblado o una herramienta similar a meter suavemente antenas por debajo de la hoja de grabación cámara para aumentar la visibilidad. Utilice pinzas afiladas para rasgar suavemente lejos el revestimiento glial que cubre el área de interés donde se harán grabaciones.</li>
	<li>Transferencia de la cámara de grabación a la plataforma de electrofisiología. Inmediatamente iniciar la perfusión con solución salina de grabación externo burbujas con carbogen para preservar el cerebro. El depósito de solución salina se coloca sobre la platina del microscopio y es gravedad-alimentó a la preparación. Utilice una línea de vacío y un matraz de Erlenmeyer de 2 L para recoger los residuos salinos.</li>
</ol>4. obtener el registro de celulares
<ol><li>Tire un extractor comercial pipeta pipetas de parche. Consulte el manual de configuración conseguir una pipeta adecuada con una resistencia de punta cerca de mΩ 7.</li>
	<li>Añadir 4 μL de solución de grabación interno en una pipeta de parche. La solución salina interna consta de aspartato de potasio 140, 10 HEPES, MgATP 4, Na 0,53GTP, 1 EGTA y 1 KCl en mM.</li>
	<li>Configurar el amplificador de abrazadera de parche para registro de celulares. Cero offset del amplificador y el amplificador para entregar pulsos de prueba. Aquí, se utiliza un amplificador de abrazadera AM sistemas parche 2.400.</li>
	<li>Aplicar presión positiva a través de la pipeta y acercarse a la célula. Uso de un micromanipulador para dirigir la pipeta y en contacto con la célula. Libere la presión positiva. Conjunto del explotación potencial de la membrana a -60 mV. La pipeta debe formar un sello gigaohm con membrana de la célula según lo evidenciado por una sub-picoamp bajo tenencia actual. Nota: Si usando GFP celular objetivo, intentar minimizar el uso de la luz epifluorescente para evitar activación de ChR2 y potencial depresión sináptica. También espere unos minutos antes de aplicar el paso 5.</li>
	<li>El amplificador para entregar pulsos de prueba de -50 mV a -60 mV. Esta opción es estándar en los amplificadores de la abrazadera del remiendo. Pulsos de prueba revelará un gran capacitativa transitorio que representa la corriente necesaria para cargar la pipeta patch. Eliminar transitorios capacitativa ajustando las perillas de la compensación de capacidad en el AM 2400 o similar amplificador.</li>
	<li>Se aplican breves impulsos de presión negativa para romper la membrana celular y obtener configuración de celulares. Nota: Una configuración de células enteras se observa cuando hay un gran aumento en los transitorios capacitativa mostrando la capacitancia de la neurona. Un pequeño aumento en la explotación actual (línea base) es probable que también se observará. El amplificador a modo de pinza y ajuste potencial de la célula de -50 a -60 mV.</li>
</ol>5. probar la conectividad sináptica
<ol><li>Configurar el sistema de adquisición (DAQ) de datos para activar un controlador LED para generar pulsos de luz. Aquí, se utiliza un sistema DAQ instrumentos nacionales con Matlab para entregar una señal analógica a un conductor del LED. La intensidad del LED se ajusta a través de la señal analógica al conductor. El LED es 620-630 nm longitud de onda LED.</li>
	<li>Coloque el LED rojo alta potencia directamente debajo de la preparación. Ajustar la intensidad de luz para que la mosca llegue a 0.238 mW/mm2 .</li>
	<li>Activar las neuronas presinápticas durante la grabación de la célula postsináptica de interés. Lograr optogenetically de activación de la célula, pharmacogentically, o a través de la estimulación nerviosa. Aquí, se aplican csChrimson y pulsos breves de luz roja. Nota: Las conexiones sinápticas pueden ser monitoreadas en pinza como EPSPs o abrazadera del voltaje como EPSCs. Una conexión sináptica debe ser visible antes de aplicar la TTX en respuesta a un pulso de luz de 40 ms. Si no se observa ninguna conexión, no es probable que las neuronas synaptically están conectados ya sea mono - o polysynaptically. La explotación potencial puede ajustarse para enfatizar las conexiones excitatorias o inhibitorias en consecuencia.</li>
	<li>Si una conexión se observa en solución salina normal, añadir TTX al sistema de perfusión para lograr una concentración final de 1 μm. Utilice una bomba de recirculación para capturar y reutilizar la solución salina para conservar la TTX. La bomba peristáltica se dibuja la solución salina del baño y volver al depósito de solución salino.</li>
	<li>Ajustar la velocidad de la bomba para proporcionar un fuerte vacío constante que no permite ese nivel salino en el baño al subir y bajar. Nota: La aplicación de TTX dará lugar a la cesación de clavar la actividad en la neurona que se está controlando en célula entera. Esto confirma que suficiente TTX ha sido añadido a la solución salina.</li>
	<li>Volver a aplicar pulsos breves de luz roja (40 ms para cada pulso). En este punto, es probable que cualquier conexión sináptica que permanece monosynaptic. Añadir a antagonistas farmacológicos a la solución salina recirculación para probar la naturaleza química de las conexiones sinápticas que permanecen en la TTX. Nota: Cuando se combinan optogenetics y focalización fluorescente de neuronas, puede ser importante no activar persistentemente la población presináptica de las neuronas, tratando de obtener una grabación. Esto puede conducir a la depresión sináptica y hace difícil ver las conexiones. Porque csChrimson tiene una banda de excitación larga que se extiende ampliamente en la gama de la proteína verde fluorescente, un fluoróforo rojo puede utilizarse para visualizar neuronas y channel2rhodopsin (Ch2R) puede utilizarse para excitar a las poblaciones de la célula. Hacerlo requiere genética específica y un cubo de filtro personalizado. Para generar moscas adecuadas, hacer moscas que expresan el fluoróforo rojo (RFP o mCherry) bajo los sistemas de expresión binaria de sistema LexA o Q. Estos tendrán que ser cruzado con moscas expresando un promotor Gal4 y UAS-Ch2R y UAS-NaChBac genes efectores. El cubo de filtro óptimo para epifluorescencia tendrá una gama estrecha de excitación excitar el fluoróforo rojo, pero no excita Ch2R. Además, el sistema de filtro debe incluir un filtro de emisión del pase largo para recoger la mayor cantidad de luz emitida. Se utilizó un filtro personalizado de croma que incluía números de parte et580/25 x y t600lpxr (del conjunto 49306), pero con un filtro de barrera/emisión de et610lp.</li>
</ol>

<ol><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. , 684-696 (2012).</li>
<li>Doyle, M. W., Andresen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+monosynaptic+sensory+transmission+in+brain+stem+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro.</a> J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).</li>
<li>Nicholls, J. G., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+chemical+and+electrical+connexions+between+sensory+and+motor+cells+in+the+central+nervous+system+of+the+leech%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol-London%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech.</a> J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).</li>
<li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).</li>
<li>Liao, X., Walters, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+elevated+divalent+cation+solutions+to+isolate+monosynaptic+components+of+sensorimotor+connections+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia.</a> J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).</li>
<li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+%28GRASP%29+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57, 353-363 (2008).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+labelling+of+neural+connections+in+multiple+colours+by+trans-synaptic+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation.</a> Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).</li>
<li>Zhang, X., Gaudry, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+a+serotonergic+neuron+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+olfactory+processing+in+Drosophila%3A+mechanisms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11, 338-346 (2014).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+head+cuticle+and+sheath+of+living+flies+for+whole-cell+patch-clamp+recordings+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li>
<li>Kazama, H., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+Matching+and+Nonlinear+Amplification+at+Identified+Central+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses.</a> Neuron. 58, 401-413 (2008).</li>
<li>Becnel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+in+Drosophila%3A+a+pharmacogenetic+approach+for+controlling+behavior%2C+neuronal+signaling%2C+and+physiology+in+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly.</a> Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).</li>
<li>Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laserspritzer%3A+A+Simple+Method+for+Optogenetic+Investigation+with+Subcellular+Resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions.</a> PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).</li>
<li>Holloway, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Glutamatergic+Activation+of+Locus+Coeruleus+and+Other+Lower+Brainstem+Noradrenergic+Neurons+by+the+C1+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice.</a> J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li>
<li>Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+enhances+central+olfactory+neuron+responses+to+female+sex+pheromone+in+the+male+sphinx+moth+manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta.</a> J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).</li>
<li>Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+GAL4-driven+transgene+expression+in+Drosophila+with+a+GAL80+enhancer-trap%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap.</a> Genesis. 39, 240-245 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Análisis TERPS complementan técnicas actuales utilizadas para circuito agrietarse permitiendo la detección de las sinapsis entre las neuronas identificadas. Específicamente, el enfoque revela conexiones monosynaptic por silenciamiento ampliamente los potenciales de acción con TTX restableciendo la excitabilidad en una población selecta de neuronas con el canal de sodio TTX-insensible NaChBac. Liberación sináptica se produce por el estímulo de optogenetic mientras que eventos postsinápticos son monitoreados con grabacione...

Una meta importante de la neurociencia es mapear las conexiones entre las neuronas para entender cómo fluye la información a través de circuitos. Numerosos enfoques y recursos se han convertido en disponibles para probar la conectividad funcional entre las neuronas en una gama de modelo sistemas1,2. Para generar los diagramas más precisos utilizando electrofisiología, es importante resolver si las conexiones observadas entre dos células son directos y monosynaptic versus indirecta y polysynaptic. Un estándar de oro para hacer esta distinción en las neuronas mamíferas es medir la latencia entre action potentials solo en las células presinápticas y la aparición de corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en la segunda neurona. Conexiones monosynaptic deben tener latencias cortas de unos pocos milisegundos y baja variabilidad3. Este enfoque puede ser complicado en invertebrados neuronas porque las sinapsis pueden ocurrir en sus dendritas lejos del sitio de grabación somáticos, provocando retrasos en la detección debido a las distancias largas electrotónicos entre conductancias postsinápticas y la grabación electrodo. Estos retrasos pueden introducir ambigüedad con respecto a poli-versus contribuciones monosynaptic. Además, pequeños eventos sinápticos puede decaer antes de llegar a la página grabaciones somática y conducir la actividad presináptica más fuerte, es probables que contratar eventos polysynaptic.
Han desarrollado varias técnicas para probar las conexiones monosynaptic en invertebrados. Un método utiliza soluciones de cationes divalentes alta (Hi-Di) que contiene exceso de magnesio++ y Ca++. Esta solución bloquea conexiones polysynaptic reduce probabilidad de liberación y aumento umbral potencial de acción a favor de la detección de monosynaptic entrada4,5. Determinar la proporción exacta de Mg++ ++ de CA requiere, sin embargo, no es trivial y polysynaptic contribuciones pueden persistir incluso modesta estimulación6. Un enfoque alternativo denominado reconstitución GFP a través de socios sináptica (GRASP) aprovecha la proximidad entre las membranas previas y postsinápticas en sinapsis para inferir una conexión monosynaptic 7. Aquí, un componente de la proteína verde fluorescente (GFP) se expresa en una neurona, y el fragmento complementario de la molécula se expresa en un supuesto socio postsináptico. La presencia de fluorescencia indica que las dos neuronas están lo suficientemente cerca para permitir la reconstitución de la molécula GFP e implica la existencia de sinapsis. ASIMIENTO puede Informe sinapsis falso, sin embargo, si dos celdas han estrechamente apposed membranas, como en un nervio o fascículo. Variantes del asimiento de eliminan tales falsos positivos por atar el presináptico fragmento de GFP directamente a synaptobrevin, permitiendo así la reconstitución solamente en sinapsis activa8. Mientras que asimiento y sus variantes han sido instrumentales en la determinación de conectividad funcional en la Drosophila del CNS, algunas conexiones pueden no hacerse visibles por comprensión si las distancias entre los socios pre- y postsinápticas es relativamente grande. Esto es particularmente pertinente en la evaluación de la transmisión de volumen asociada a neuromodulación9 o GABAérgicas inhibición10.
Aquí, se demuestra una técnica complementaria y novedosa para probar conexiones monosynaptic directas en Drosophila del CNS. Este método, llamado tetrodotoxina resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS), funciona por la coexpresión de la tetrodotoxina (TTX)-canal sodio resistente, NaChBac y un activador de optogenetic en una célula presináptica durante la grabación de la supuesta socios postsynaptic9. En presencia de TTX, se suprime toda actividad mediada por el potencial de acción en células distintas de las que NaChBac. El canal de NaChBac selectivamente restaura la excitabilidad en las celdas presinápticos específicos, permitiendo la transmisión sináptica evocada por la luz. Este método permite la fuerte activación de las neuronas presinápticas, tal que las conexiones se pueden resolver postsynaptically somática grabación mientras reduce la probabilidad de contratar circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite el estudio de la transmisión de volumen y revela la difusión del transmisor liberado de una sola neurona a lo largo de un circuito. Además, los TERPS puede revelar la naturaleza química de la conexión a través de la farmacología convencional. TERPS es conveniente para el uso en cualquier modelo de sistema que permite la expresión transgénica de los canales de sodio TTX-insensible.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Utilizado como activador neuronal</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Recupera la excitabilidad en las células en TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>Es posible que se necesite un permiso especial para comprar TTX, ya que es una sustancia controlada</td></tr><tr><td>en su totalidad.</td><td> trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Requiere cofactor para el</td></tr><tr><td>acero inoxidable 321 soldable con cidoopsina &nbsp; Hoja,&nbsp; 0.002"&nbsp; Grueso,&nbsp; 10"&nbsp; Wide</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Se utiliza para hacer un soporte para moscas personalizado. La lámina personalizada se puede cortar con láser en pololu.com del archivo PDF proporcionado</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Se utiliza para la disección de la preparación</td></tr><tr><td>Cera</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Se utiliza durante la disección para asegurar la mosca en la lámina</td></tr><tr><td>Cera de parafina</td><td>Joann 4917217</td><td></td><td>Se utiliza con las</td></tr><tr><td>pinzas</td> de enceradora Número 5 <td>Herramientas de ciencia fina</td><td>#5CO</td><td>Se utiliza para la disección y el desenvainado</td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>Se utiliza para eliminar partes de la cutícula durante la disección</td></tr><tr><td>Alambre de tungsteno</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Úselo con electrólisis para hacer agujas afiladas para la disección</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica recíproca</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>para recirculación</td></tr><tr>Controlador de velocidad TTX<td>para bomba peristáltica</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM Controlador de atenuación para luces LED o cinta, 12 voltios 8 amperios, interruptor de luz de brillo ajustable Controlador de atenuación DC12V 8A 96W para tira de luz LED B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&nbsp; Regulador de aire comprimido de precisión</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>Para aplicar presión positiva durante el parcheo</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>Para pipetas de parche</td></tr><tr><td>Manómetro multipropósito</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Manómetro para regulador</td></tr><tr><td>de presión Cámara de electrofisiología</td><td>Dage MTI&nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Cualquier cámara que funcione en el rango IR (850 nm) funcionará. No desea utilizar la iluminación roja, ya que puede activar csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>M850F2</td><td>Para iluminación oblicua</td></tr><tr><td>de fibra óptica para IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Se acopla a la</td></tr><tr><td>lente del objetivo IR LED&nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>Se puede utilizar en la mayoría de los microscipes y funciona bien para visualizar las neuronas de las moscas.</td></tr><tr><td>LED ámbar</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>Para visualizar RFP y</td></tr><tr><td>mCherry Blue</td><td>LED Thorlabs</td><td>M470L3d</td><td>Para visualizar GFP</td>Juego de</tr><tr><td>filtros GFP</td><td>Chroma</td><td>49011</td><td>Para visualizar GFP o estimular el canal2rodopsina</td></tr><tr><td>Juego de filtros mCherry</td><td>personalizado Chroma</td><td>&nbsp; ET580/25X y T600LPXR (del conjunto 49306) pero con una óptica de barrera/emisión ET610LP</td><td>Úselo solo si desea parchear las neuronas identificadas con channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic para combinar LED ámbar y azul</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP550R</td><td>Use solo el parche debajo de mCherry y excite channel2rhodopsin con luz azul.</td></tr><tr><td>LED rojo</td><td>LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Se utiliza para accionar el controlador LED csChrimson</td></tr><tr><td></td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Se utiliza para accionar LEDs para la estimulación optogenética</td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Se utiliza para posicionar la pipeta durante las grabaciones</td></tr><tr><td>Amplificador de abrazadera de parche</td><td>A-M Systems</td><td>modelo 2400</td><td>Un amplificador equivalente es adecuado</td></tr><tr><td>Filtro Bessel</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Filtro auxiliar utilizado para filtrar la traza de corriente al osciloscopio durante la aplicación de parches.</td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de datos&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 781044-01</td><td>Se utiliza para registrar datos del amplificador al ordenador Bloque de</td></tr><tr><td>conectores - Terminal BNC BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Se utiliza para conectar el amplificador a la tarjeta DAQ.</td></tr><tr><td>Lámina de acero&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Lámina de acero para cámara de grabación personalizada</td></tr><tr><td>Imanes K</td><td>& J Magnetics</td><td>D42</td><td>Para asegurar la cámara de grabación al soporte del anillo 1</td></tr><tr><td>/16" Cell Cast Acrylic Clear Pololu</td><td></td><td></td><td>Se utiliza para hacer una cámara de grabación personalizada. El acrílico se puede cortar con láser a pololu.com del archivo PDF proporcionado</td></tr></tbody></table>

examinar las conexiones monosynaptic en drosophila utilizando canales de sodio tetrodotoxin resistentes

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Aquí, se aplica una nueva técnica denominada Tetrotoxin (TTX) resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS) para probar conexiones monosynaptic entre neuronas de destino. El método se basa en la expresión de un activador de transgénico con el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac, en la neurona presináptica específico. Conexiones con supuestos socios postsinápticos dependen de grabaciones de celulares en presencia de TTX, que bloquea la actividad eléctrica de las neuronas que no expresan NaChBac. Este enfoque puede ser modificado para trabajar con cualquier activador o proyección de imagen de calcio como un reportero de conexiones. TERPS agrega al conjunto creciente de herramientas disponibles para determinar la conectividad en redes. Sin embargo, los TERPS es único en que confiablemente también divulga a granel o transmisión de volumen y derrame transmisión.

TERPS se utiliza para distinguir entre mono - y polysynaptic en conexiones sinápticas entre las neuronas. Mientras que una estimulación débil de una célula puede utilizarse para probar las conexiones directas, conduciendo a una mayor actividad presináptica a menudo reclutas polysynaptic conexiones (figura 1A). TERPS funciona Co expresando el canal de sodio TTX-insensible NaChBac y un activador de optogenetic y pruebas de conexiones en presencia de TTX para el...

Este artículo presenta un método para probar las conexiones monosynaptic entre neuronas mediante el empleo de tetrodotoxin y el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac.

Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

El objetivo general de esta técnica es identificar conexiones monosinápticas electrofisiológicamente en drosophila utilizando canales de sodio resistentes a la tetrodotoxina. Las principales ventajas de esta técnica es que es sencilla y puede revelar la naturaleza química de las sinapsis. También es adecuado para el estudio de la transmisión volumétrica o a granel.Generalmente, en los videos nuevos en este método, luchamos debido a la dificultad de la disección. Sin embargo, con solo comprender el método, la lógica es fácilmente transferible a otros sistemas modelo, como los ratones. Para las grabaciones, tenga pipetas de parche para la resistencia cercana a los siete megaohmios.Además, tenga solución salina de registro externo con un pH de 7.3 o menos aireada continuamente con carbógeno que contenga 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. En el caso de los sujetos, tener un stock de moscas que exprese csChrimson, propagándose en alimentos que contengan 0,2 milimolares de todo el trans-retinal. Para las grabaciones, seleccione adultos de uno a tres días de nacidos.Cárguelos en un frasco de centelleo de vidrio e inmovilícelo con una exposición de un minuto a condiciones heladas. A continuación, baje el nivel de luz del endoscopio de disección y de las pinzas gruesas para cargar una mosca anestesiada en la cámara de grabación hecha a medida. Asegure la mosca a la cámara rodeándola con cera o epoxi curable por UV.Colócalo con el lado dorsal hacia arriba con el papel de aluminio aproximadamente a la mitad del tórax. La clave para obtener una gran preparación es tener el agujero cortado en el papel de aluminio para que tenga el tamaño adecuado, de modo que la mosca no se exprima ni pueda caerse. Ilumine la preparación con luces de fibra óptica desde ambos lados y manténgalas lo más tenues posible.A continuación, cubra la preparación con cuatro a seis gotas de solución salina de grabación. A continuación, afila el alambre o filamento de tungsteno para la disección. Aplique unos 20 voltios de corriente alterna a una solución saturada de nitrato de potasio y sumerja repetidamente la punta del cable muy rápidamente en la solución.Después de 20 inmersiones, la punta será afilada. Ahora, ajuste las luces para proporcionar la visibilidad suficiente para usar el cable afilado para exponer el cerebro quitando la cutícula, seguida de la tráquea y los cuerpos gordos. Para acceder a los lóbulos de las antenas, use un cable de tungsteno doblado para meter suavemente la antena debajo del protector de aluminio.A continuación, utilice unas pinzas afiladas para arrancar suavemente la vaina glial que cubre la zona de interés. Ahora transfiera la preparación al equipo de electrofisiología para realizar grabaciones. En el equipo, comience inmediatamente a perfundir la preparación con solución salina de registro, burbujeante con carbógeno.Utilice un depósito de solución salina alimentado por gravedad colocado encima de la platina del microscopio. Para recoger la solución salina residual, utilice una línea de vacío y un matraz de 2 litros. A continuación, cargue la pipeta de parche con 4 microlitros de solución de registro interna y conecte la pipeta a un micromanipulador.A continuación, ponga a cero el desplazamiento del amplificador y configure el amplificador para que entregue pulsos de prueba. A continuación, ajuste la iluminación oblicua infrarroja para obtener una visión clara del cerebro. Ahora, mientras aplica presión positiva a la pipeta, acérquese a la célula con la pipeta.Cuando se produzca el contacto con la célula, libere la presión positiva para sellar la pipeta a la membrana. Luego, ajuste el potencial de retención de la membrana a menos 60 milivoltios. Y la pipeta debe formar un sello de gigaohmios con la membrana celular.La corriente de retención debe caer a un nivel bajo de sub-picoamperio. Para obtener sellos constantes de gigaohmios, asegúrese de mantener su pipeta limpia manteniendo la presión positiva y evite golpear el tejido o acercarse a sus células. Para continuar, configure el amplificador para que entregue pulsos de prueba de menos 50 a menos 60 milivoltios.Los pulsos de prueba revelarán un gran transitorio capacitativo que representa la corriente necesaria para cargar la pipeta de parche. Para eliminar la transitoriedad capacitiva, ajuste las perillas de compensación de capacidad en el amplificador. Ahora, aplique pulsos breves de presión negativa para romper la membrana celular y obtener la configuración celular completa.Un gran aumento en la transitoriedad capacitiva indica éxito. También se debe observar un pequeño aumento en la corriente de retención. Luego, configure el amplificador en modo de pinza amperimétrica.Y ajuste el potencial de la celda entre menos 50 y menos 60 milivoltios. En preparación, configure el sistema de adquisición de datos como se indica en el protocolo de la tecnología. El sistema requiere un LED rojo de alta potencia colocado debajo de la preparación, posicionado para iluminar la mosca a 0,238 milivatios por milímetro cuadrado.Ahora, activar las neuronas presinápticas optogenéticamente, utilizando luz roja pulsada en la expresión de csChrimson. También se pueden utilizar otros métodos. Antes de aplicar tetrodotoxina, debe ser visible una conexión sináptica en respuesta a un pulso de luz de 40 milisegundos.La falta de respuesta significa que es poco probable que se establezca una conexión. El potencial de retención se puede ajustar para enfatizar las conexiones excitadoras o inhibitorias, en consecuencia. Una vez que se verifica una conexión, configure la profusión de solución salina para la recirculación en la solución salina.Ajuste la bomba para que el nivel de solución salina en el baño se mantenga estable. Luego, agregue suficiente tetrodotoxina al sistema para una concentración final de un micromolar. Esto debería detener la actividad de aumento de la neurona parcheada.De lo contrario, agregue más tetrodotoxina al sistema. Ahora, aplica breves pulsos de luz roja para activar lo que probablemente sea una conexión monosináptica. A continuación, se procede a añadir antagonistas farmacológicos a la solución salina recirculante para comprobar la naturaleza química de las conexiones sinápticas.La expresión transgénica de la tetrodotoxina en el canal sensible de sodio notchback rescata la excitabilidad en las neuronas y da como resultado un gran potencial de meseta. Las interneuronas del lóbulo antenal responden a los olores. Sin embargo, las corrientes postsinápticas excitatorias no se resuelven fácilmente en el soma.Entonces, ¿las respuestas surgen directamente de la entrada de las neuronas receptoras olfativas? El uso de tERPs revela que las neuronas receptoras olfativas hacen conexiones directas con las interneuronas locales. La estimulación de las neuronas serotoninérgicas en el lóbulo antenal da lugar a una mezcla de excitación e inhibición en las interneuronas locales.La aplicación de metisergida, un amplio antagonista del receptor 5HT, bloqueó una hiperpolarización lenta, pero no tuvo ningún efecto sobre la despolarización, mientras que la mecamilamina bloquea la despolarización rápida. Esto sugiere que la estimulación es colinérgica. La tERP se utilizó para resolver la transmisión de volumen extrasináptico que ocurre con GABA o neuromoduladores.En un ejemplo, la aplicación de tetrodotoxina no suprimió una señal inhibitoria en la interneurona local. Esta inhibición se bloqueó utilizando el antagonista de la serotonina, el metisergida, lo que sugiere una señal directa de una neurona serotoninérgica específica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener grabaciones de células completas de neuronas de Drosophila y evaluar su conductividad utilizando tERP.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser paciente y practicar la disección difícil repetidamente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la farmacología, para responder a preguntas adicionales, como la naturaleza de la sinapsis química.No olvide que trabajar con tetrodotoxina puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y trabajar con pequeños volúmenes, mientras se realizan estos procedimientos.

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.

Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

Este procedimiento utiliza una luz azul activa el canal de las algas y las células específicas de las herramientas de la expresión genética para evocar los potenciales sinápticos con pulsos de luz en la unión neuromuscular (UNM),...

Channelrhodopsin2 estimulación mediada de los potenciales sinápticos en Drosophila Las uniones neuromusculares

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

Este video muestra cómo probar conexiones monosinápticas usando una mosca transgénica. La mosca tiene canales de sodio resistentes a la tetrodotoxina y canales activados por luz roja en sus neuronas presinápticas, que están optogenéticamente excitadas para transmitir señales a las neuronas postsinápticas.

Prueba de conexiones monosinápticas utilizando tetrodotoxina y canales de sodio resistentes a la tetrodotoxina

Este video muestra la técnica para registrar las corrientes sinápticas de un botón sináptico en la unión neuromuscular de la larva de Drosophila. Esta técnica permite monitorizar la actividad de un único botón sináptico, lo que es importante para el estudio de líneas de moscas mutantes con una mayor actividad sináptica espontánea o asíncrona.

Registro de corrientes sinápticas en la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila

Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio.

Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneración de Neuronas Motoras

Las corrientes sinápticas pueden grabarse focal de visualizadas botones sinápticos en la Drosophila tercer instar larvas Unión neuromuscular. Esta técnica permite la monitorización de la actividad de una sola bouton sináptico.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Este protocolo evalúa la actividad sináptica funcional entre parejas neuronales definidas in vivo en el sistema nervioso central de las larvas de Drosophila melanogaster utilizando herramientas codificadas genéticamente. CsLa estimulación optogenética mediada por Chrimson de neuronas sensoriales presinápticas cIVda induce la fotoconversión dependiente de calcio de CaMPARI en interneuronas possinápticas de la Cuenca-4.

Caracterización funcional de parejas pre- y postsinápticas individuales en el sistema nervioso central larvario de Drosophila usando CaMPARI

Aprende a identificar conexiones monosinápticas en Drosophila mediante electrofisiología de patch-clamp y canales de sodio resistentes a tetrodotoxina. Este método revela la naturaleza química de las sinapsis en el lobo antenal.

Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes

Explorar más videos