Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes

El objetivo general de esta técnica es identificar conexiones monosinápticas electrofisiológicamente en drosophila utilizando canales de sodio resistentes a la tetrodotoxina. Las principales ventajas de esta técnica es que es sencilla y puede revelar la naturaleza química de las sinapsis. También es adecuado para el estudio de la transmisión volumétrica o a granel.

Generalmente, en los videos nuevos en este método, luchamos debido a la dificultad de la disección. Sin embargo, con solo comprender el método, la lógica es fácilmente transferible a otros sistemas modelo, como los ratones. Para las grabaciones, tenga pipetas de parche para la resistencia cercana a los siete megaohmios.

Además, tenga solución salina de registro externo con un pH de 7.3 o menos aireada continuamente con carbógeno que contenga 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. En el caso de los sujetos, tener un stock de moscas que exprese csChrimson, propagándose en alimentos que contengan 0,2 milimolares de todo el trans-retinal. Para las grabaciones, seleccione adultos de uno a tres días de nacidos.

Cárguelos en un frasco de centelleo de vidrio e inmovilícelo con una exposición de un minuto a condiciones heladas. A continuación, baje el nivel de luz del endoscopio de disección y de las pinzas gruesas para cargar una mosca anestesiada en la cámara de grabación hecha a medida. Asegure la mosca a la cámara rodeándola con cera o epoxi curable por UV.

Colócalo con el lado dorsal hacia arriba con el papel de aluminio aproximadamente a la mitad del tórax. La clave para obtener una gran preparación es tener el agujero cortado en el papel de aluminio para que tenga el tamaño adecuado, de modo que la mosca no se exprima ni pueda caerse. Ilumine la preparación con luces de fibra óptica desde ambos lados y manténgalas lo más tenues posible.

A continuación, cubra la preparación con cuatro a seis gotas de solución salina de grabación. A continuación, afila el alambre o filamento de tungsteno para la disección. Aplique unos 20 voltios de corriente alterna a una solución saturada de nitrato de potasio y sumerja repetidamente la punta del cable muy rápidamente en la solución.

Después de 20 inmersiones, la punta será afilada. Ahora, ajuste las luces para proporcionar la visibilidad suficiente para usar el cable afilado para exponer el cerebro quitando la cutícula, seguida de la tráquea y los cuerpos gordos. Para acceder a los lóbulos de las antenas, use un cable de tungsteno doblado para meter suavemente la antena debajo del protector de aluminio.

A continuación, utilice unas pinzas afiladas para arrancar suavemente la vaina glial que cubre la zona de interés. Ahora transfiera la preparación al equipo de electrofisiología para realizar grabaciones. En el equipo, comience inmediatamente a perfundir la preparación con solución salina de registro, burbujeante con carbógeno.

Utilice un depósito de solución salina alimentado por gravedad colocado encima de la platina del microscopio. Para recoger la solución salina residual, utilice una línea de vacío y un matraz de 2 litros. A continuación, cargue la pipeta de parche con 4 microlitros de solución de registro interna y conecte la pipeta a un micromanipulador.

A continuación, ponga a cero el desplazamiento del amplificador y configure el amplificador para que entregue pulsos de prueba. A continuación, ajuste la iluminación oblicua infrarroja para obtener una visión clara del cerebro. Ahora, mientras aplica presión positiva a la pipeta, acérquese a la célula con la pipeta.

Cuando se produzca el contacto con la célula, libere la presión positiva para sellar la pipeta a la membrana. Luego, ajuste el potencial de retención de la membrana a menos 60 milivoltios. Y la pipeta debe formar un sello de gigaohmios con la membrana celular.

La corriente de retención debe caer a un nivel bajo de sub-picoamperio. Para obtener sellos constantes de gigaohmios, asegúrese de mantener su pipeta limpia manteniendo la presión positiva y evite golpear el tejido o acercarse a sus células. Para continuar, configure el amplificador para que entregue pulsos de prueba de menos 50 a menos 60 milivoltios.

Los pulsos de prueba revelarán un gran transitorio capacitativo que representa la corriente necesaria para cargar la pipeta de parche. Para eliminar la transitoriedad capacitiva, ajuste las perillas de compensación de capacidad en el amplificador. Ahora, aplique pulsos breves de presión negativa para romper la membrana celular y obtener la configuración celular completa.

Un gran aumento en la transitoriedad capacitiva indica éxito. También se debe observar un pequeño aumento en la corriente de retención. Luego, configure el amplificador en modo de pinza amperimétrica.

Y ajuste el potencial de la celda entre menos 50 y menos 60 milivoltios. En preparación, configure el sistema de adquisición de datos como se indica en el protocolo de la tecnología. El sistema requiere un LED rojo de alta potencia colocado debajo de la preparación, posicionado para iluminar la mosca a 0,238 milivatios por milímetro cuadrado.

Ahora, activar las neuronas presinápticas optogenéticamente, utilizando luz roja pulsada en la expresión de csChrimson. También se pueden utilizar otros métodos. Antes de aplicar tetrodotoxina, debe ser visible una conexión sináptica en respuesta a un pulso de luz de 40 milisegundos.

La falta de respuesta significa que es poco probable que se establezca una conexión. El potencial de retención se puede ajustar para enfatizar las conexiones excitadoras o inhibitorias, en consecuencia. Una vez que se verifica una conexión, configure la profusión de solución salina para la recirculación en la solución salina.

Ajuste la bomba para que el nivel de solución salina en el baño se mantenga estable. Luego, agregue suficiente tetrodotoxina al sistema para una concentración final de un micromolar. Esto debería detener la actividad de aumento de la neurona parcheada.

De lo contrario, agregue más tetrodotoxina al sistema. Ahora, aplica breves pulsos de luz roja para activar lo que probablemente sea una conexión monosináptica. A continuación, se procede a añadir antagonistas farmacológicos a la solución salina recirculante para comprobar la naturaleza química de las conexiones sinápticas.

La expresión transgénica de la tetrodotoxina en el canal sensible de sodio notchback rescata la excitabilidad en las neuronas y da como resultado un gran potencial de meseta. Las interneuronas del lóbulo antenal responden a los olores. Sin embargo, las corrientes postsinápticas excitatorias no se resuelven fácilmente en el soma.

Entonces, ¿las respuestas surgen directamente de la entrada de las neuronas receptoras olfativas? El uso de tERPs revela que las neuronas receptoras olfativas hacen conexiones directas con las interneuronas locales. La estimulación de las neuronas serotoninérgicas en el lóbulo antenal da lugar a una mezcla de excitación e inhibición en las interneuronas locales.

La aplicación de metisergida, un amplio antagonista del receptor 5HT, bloqueó una hiperpolarización lenta, pero no tuvo ningún efecto sobre la despolarización, mientras que la mecamilamina bloquea la despolarización rápida. Esto sugiere que la estimulación es colinérgica. La tERP se utilizó para resolver la transmisión de volumen extrasináptico que ocurre con GABA o neuromoduladores.

En un ejemplo, la aplicación de tetrodotoxina no suprimió una señal inhibitoria en la interneurona local. Esta inhibición se bloqueó utilizando el antagonista de la serotonina, el metisergida, lo que sugiere una señal directa de una neurona serotoninérgica específica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener grabaciones de células completas de neuronas de Drosophila y evaluar su conductividad utilizando tERP.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser paciente y practicar la disección difícil repetidamente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la farmacología, para responder a preguntas adicionales, como la naturaleza de la sinapsis química.

No olvide que trabajar con tetrodotoxina puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y trabajar con pequeños volúmenes, mientras se realizan estos procedimientos.