Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales

El objetivo general de este enfoque es evaluar directamente la función respiratoria de las células beta pancreáticas, en condiciones estimuladoras de insulina. Esto también se puede utilizar para observar el efecto de diferentes compuestos en la función respiratoria de las células beta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología de las células beta pancreáticas, como si un determinado compuesto afecta la función de las células beta pancreáticas a través de cambios en la respiración.

La principal ventaja de esta técnica, es que se puede utilizar para evaluar directamente la función respiratoria en las células beta pancreáticas, en condiciones basales y estimuladoras de insulina. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación de la célula y uso de la máquina son difíciles de aprender, debido a la precisión requerida en la preparación de la célula y la medición de la respiración. Para empezar, cultive células beta 832/13 derivadas de INS-1 en RPMI 1640 suplementado.

Retirar las células de un matraz T75, añadiendo dos mililitros de tripsina al 0,25%, e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, neutralice la tripsina añadiendo ocho mililitros de medios RPMI 1640 completos. Diluya 100 microlitros del volumen celular en 900 microlitros de PBS y cuente las células con un hemocitómetro.

Luego, coloque las células a una densidad de un millón de células por mililitro, en un plato de 10 centímetros. Cultive las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de CO2, antes de comenzar los experimentos de respiración. Cambie el medio 24 horas después de la siembra y el cultivo de las células 832/13 en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius y 5% de CO2.

A continuación, tratar las células con vehículo control o derivado del cacao, monómero de epicatequina, para obtener una concentración final de 100 nanomolares. Después de la adición del tratamiento con cultivo, durante 24 horas adicionales en una incubadora humidificada, a 37 grados centígrados y 5% de CO2. A continuación, lave las células con 1x tampón de ensayo de baja secreción de glucosa, o SAB, durante cinco minutos.

Aspire el tampón e incube las células en 1x SAB de glucosa baja durante tres horas, cambiando el tampón cada hora. Después de la incubación, retire las células de la placa con un mililitro de tripsina al 0,25%. Combine las células en tripsina de la placa tratada con control de vehículo, con cuatro mililitros de SAB en un tubo cónico de 15 mililitros.

Del mismo modo, combine el plato tratado con el compuesto de interés, con un tampón. Diluya 100 microlitros del volumen celular en 900 microlitros de PBS y cuente las células con un hemocitómetro. Diluya 100 microlitros del volumen celular en 900 microlitros de PBS y cuente las células con un hemocitómetro.

Los datos demuestran que una concentración de un millón de células por mililitro es la más efectiva. Después de preparar el respirómetro de alta resolución como se detalla en el protocolo de texto, agregue 2,4 mililitros de 1x tampón SAB de baja glucosa a cada cámara de oxígrafo. Agite el tampón de forma continua utilizando barras de agitación magnéticas en la cámara a 750 rpm y 37 grados Celsius, con un intervalo de registro de datos de 2,0 segundos.

Para ello, seleccione el botón F7 y abra la pestaña etiquetada como sistemas. Empuje los émbolos hasta el fondo y luego retírelos a la configuración de aireación de la llave. Deje que la máquina se equilibre durante un mínimo de una hora hasta que se obtenga un flujo de oxígeno estable.

A continuación, ajuste la máquina a 37 grados centígrados durante la duración del experimento. Presione el botón F7 y abra la pestaña etiquetada como Oxígeno O2 para configurar el voltaje de polarización a 800 milivoltios con una ganancia de dos. Equilibre la concentración de oxígeno del tampón SAB durante al menos 30 minutos, hasta que el cambio en la concentración de oxígeno sea estable.

A continuación, seleccione una región en la que el cambio de la concentración de oxígeno sea estable para establecer la medición en segundo plano del cambio en la concentración de oxígeno, pulsando la tecla Mayús, haciendo clic con el botón izquierdo del ratón y arrastrando el ratón por la región seleccionada. Haga clic en la letra asociada con la región seleccionada y cámbiela a R1 para cada traza correspondiente a cada una de las dos cámaras. Haga doble clic en el cuadro de calibración de O2 en las esquinas inferior izquierda y derecha de la pantalla.

Haga clic en el botón Seleccionar marca para la calibración de aire como R1 y, a continuación, seleccione calibrar y copiar en el portapapeles para ambas cámaras. A continuación, cargue 2,4 mililitros de muestra en cada cámara, cargando una cámara con las células tratadas con el vehículo de control y una cámara con células tratadas con compuestos en 1x SAB de baja glucosa. Empuje el émbolo hasta el fondo y aspire el volumen residual.

Agite las células continuamente durante todo el experimento a 750 rpm y 37 grados centígrados para todos los pasos posteriores. Haga una marca haciendo clic en F4 y etiquetando la marca como celdas cuando se carguen las muestras. Mida las muestras durante 30 minutos.

Después de la estabilización de la señal, seleccione una región del cambio en la concentración de oxígeno correspondiente a las condiciones de glucosa baja. A continuación, añada 12,5 microlitros de una solución de glucosa estéril al 45% en cada cámara a través del puerto de carga de titanio con una jeringa. Haga una marca de glucosa etiquetada cuando se agregue el tratamiento.

Deje que la señal se estabilice y registre la respiración celular hasta que se logre un flujo de oxígeno estable. En este punto, seleccione la región del cambio en la concentración de oxígeno para representar la lectura de glucosa de 16,7 milimolares, que corresponde a las condiciones estimuladoras. Una vez alcanzada la estabilización de la señal, agregue un microlitro de oligomicina A de cinco milimolares en cada cámara a través del puerto de carga.

Haga una marca etiquetada, OligoA, cuando se agregue el tratamiento. Deje que la señal se estabilice y registre la respiración celular hasta que se logre un flujo de oxígeno estable. Una vez que se haya logrado un flujo de oxígeno estable, seleccione esta área de la curva.

La oligomicina A inhibe la ATP sintasa y, por lo tanto, el único flujo de oxígeno que se produce es a través de la fuga de electrones y no de la fosforilación oxidativa. A continuación, agregue un milimolar de FCCP en incrementos de un microlitro hasta que se establezca una tasa de respiración máxima. Esto representa la respiración desacoplada máxima.

Entre tres y cuatro microlitros de FCCP es suficiente para inducir la máxima respiración desacoplada de las células beta 832/13 derivadas de INS-1. Haga una marca etiquetada, FCCP cuando se agregue el tratamiento. Deje que la señal se estabilice y registre la respiración celular hasta que se logre un flujo de oxígeno estable.

A continuación, seleccione esta área de la curva. El FCCP es un agente de desacoplamiento que permite medir la respiración desacoplada. Una vez alcanzada la estabilización de la señal, agregue un microlitro de cinco milimolares de antimicina A en cada cámara a través del puerto de carga.

Haga una marca etiquetada, AntiA, cuando se agregue el tratamiento y repita el procedimiento de selección de la curva. Introduzca el número de células por mililitro utilizadas en el ensayo, pulsando el botón F3 del programa de análisis del respirómetro. Cambie las unidades a celdas por mililitro, ingrese la concentración celular y cambie el medio a SAB.

Seleccione las lecturas de fondo para normalizar los datos seleccionando e ingresando en el formulario de calibración de oxígeno. Realice selecciones de lecturas de 2,5 milimolar de glucosa, 16,7 milimolar de glucosa, oligomicina A, FCCP y antimicina A. Dentro del programa de análisis del respirómetro, ingrese la concentración de proteínas y seleccione los valores promedio apropiados para cada tratamiento durante la medición de la respiración. Luego, haga clic en F2 y haga clic en la función de copiar al portapapeles.

De este modo, se exportan los datos para utilizarlos en otros programas de análisis. Utilice los valores negativos de pendiente de O2 para los cálculos. Compilar los datos de tres a cinco series independientes de células de control tratadas con vehículos y células tratadas con compuestos naturales para determinar el efecto sobre la respiración celular intacta de las células beta 832/13 derivadas de INS-1.

Las células beta 832/13 derivadas de INS-1 intactas demuestran un aumento inducido por la glucosa en la utilización de oxígeno. Es fundamental que se utilice el número adecuado de células. Los resultados obtenidos en este experimento demuestran que un millón de células por mililitro es la cantidad óptima.

células beta 832/13 derivadas de INS-1 tratadas con curcumina no muestran cambios en la respiración general. Por el contrario, las células beta 832/13 derivadas de INS-1 tratadas con epicatequinas monoméricas de cacao tenían un aumento de la respiración a 2,5 milimolares de glucosa y 16,7 milimolares de glucosa. También se observa un aumento de la respiración durante el estado de fuga, que es el estado respiratorio basal no fosforilante, así como la respiración del sistema de transporte de electrones o el estado ETS, que es la respiración máxima.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo evaluar directamente la función respiratoria de las células beta pancreáticas en condiciones estimuladoras de insulina. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tratar previamente las células con tampón SAB de baja glucosa y obtener recuentos celulares precisos para el ensayo.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para obtener la cantidad correcta de células para mediciones efectivas. Con demasiadas celdas, la señal es difícil de evaluar y con muy pocas, la señal no es lo suficientemente alta como para medirla de manera consistente. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de la diabetes y cualquier afección afectada por cambios en la función de las células beta pancreáticas, ya que la respiración mitocondrial es un componente crítico de cómo funciona la secreción de insulina.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secreción de insulina estimulada por glucosa para responder preguntas adicionales, como, ¿cuál es el efecto de estos compuestos sobre la secreción de insulina? Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de las células beta, también se puede aplicar a otros sistemas, como los análisis musculares, hepáticos, adiposos y otros análisis respiratorios mitocondriales.