Name: Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprende a medir la respiración mitocondrial en células beta pancreáticas intactas mediante respirometría de alta resolución. Este método evalúa el efecto de compuestos naturales sobre la función celular bajo condiciones estimuladoras de insulina.

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Los autores desean agradecer a miembros de los laboratorios Tessem y Hancock para asistente y discusión científica. Los autores agradecen a Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) para proporcionar la fracción de monómero epicatequina derivados cacao. Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación de educación y la investigación acción Diabetes al JST.

1. cultivo celular
<ol><li>Derivado de la cultura INS-1 832/13 beta células en RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina de 1%, 10 mM HEPES, 2 mM glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 0.05 mM de 2-Mercaptoetanol9,10,11 ,12,13.</li>
	<li>Eliminar las células 832/13 un frasco T75 utilizando 2 mL de tripsina 0.25%, incubar a 37 ° C por 10 minutos neutralizar tripsina mediante la adición de 8 mL de Medio RPMI 1640 completo.</li>
	<li>Contar las células usando un hemocitómetro y diluir 100 μl del volumen celular de paso 1.2 en 900 μl de PBS.</li>
	<li>Las células de la placa 832/13 con una densidad de 2 x 106 células/mL en 6 plato bien.</li>
	<li>Células en cultivo durante 48 h en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% de CO2 antes de comenzar los experimentos de respiración.</li>
</ol>2. preparación de células de alta resolución respirometría
<ol><li>
Tratamiento de las células de 832/13 con monómero epicatequina derivados cacao.
	<ol>
<li>La cultura 832/13 células durante 24 h después de la siembra en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2.</li>
		<li>Cambiar medios de 24 h después de la galjanoplastia y tratar células 832/13 con control del vehículo (3 pozos) o monómero de nM cacao 100 (3 pozos), seguido por la cultura para un adicional 24 h (48 h en total) en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2.</li>
		<li>Lavar las células 832/13 en 1 x baja glucosa secreción tampón de ensayo (SAB) para 5 minutos aspirado buffer e incubar células 832/13 en 1 x glucosa baja SAB 3 h, cambio 1 x glucosa baja SAB cada hora.<ol>
<li>Hacer 10 x SAB con 33,32 g de NaCl, 1,73 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4, 0.7 g de MgSO4 y H2O a un volumen final de 500 mL. Filtro estéril la solución final.</li>
			<li>Hacer 1 x glucosa baja SAB con 10 mL de 10 x SAB, 100 μl de glucosa 45%, 2 mL de HEPES, 1 mL de 1 M de 0.25M CaCl2, 0,57 mL de solución de BSA de 35%, 0,21 g de NaHCO3 y H2O a un volumen final de 100 mL. Filtro estéril la solución final.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tratamiento de células 832/13 con curcumina.
	<ol>
<li>La cultura 832/13 células durante 48 h después de la siembra en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2.</li>
		<li>Lavar las células 832/13 en 1 x glucosa baja SAB para el tampón de aspirado de 5 minutos e incubar células 832/13 en 1 x glucosa baja SAB 3 h, cambio 1 x glucosa baja SAB cada hora.</li>
		<li>Después de 2,5 h de la 3 h de incubación en 1 x glucosa baja SAB, Aspire buffer e incubar las células en 1 x baja glucosa SAB con control del vehículo o 40 μm curcumina durante 30 minutos. Tras la incubación, aspirar el búfer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección de células con tripsina de respirometría de alta resolución
	<ol>
<li>Después de la 3 h de incubación en 1 x glucosa baja SAB, extraer las células de la placa con 250 μl de tripsina 0.25% por pozo.</li>
		<li>Combinar las celdas de tripsina de 3 pozos tratados con control del vehículo o el compuesto de interés con 4 mL de SAB en un tubo cónico de 15 mL.</li>
		<li>Contar las células usando un hemocitómetro y diluir 100 μl del volumen celular de paso 2.3.2 en 900 μl de PBS.</li>
		<li>Diluir el número apropiado de células en 1 x glucosa baja SAB hacer 3 mL en la concentración adecuada para cada cámara. Los datos demuestran que una concentración de 1 x 106 células/mL es el más eficaz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección de células con disociación mecánica de respirometría de alta resolución
	<ol>
<li>Después de la 3 h de incubación en 1 x glucosa baja SAB, añadir 1 mL de 1 x baja glucosa SAB a cada bien y suavemente soplar las células de la placa con la disociación mecánica mediante pipeteo con una pipeta de 1000 μl.</li>
		<li>Combinar las celdas de 3 pozos tratados con control del vehículo o el compuesto de interés en un total de 3 mL SAB en un tubo cónico de 15 mL para la respiración.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. alta resolución respirometría
<ol><li>Preparación de la alta resolución respirómetro.
	<ol>
<li>Encienda el respirómetro de alta resolución y conectar al escritorio con el lanzamiento del programa de análisis del respirómetro.</li>
		<li>Aspire el etanol al 70% de ambas cámaras. Disfrutar de estas cámaras en etanol al 70% durante un mínimo de 45 minutos.</li>
		<li>Lavar las cámaras dos veces con etanol al 70%, aspirar después de cada paso.</li>
		<li>Lavar las cámaras tres veces con ddH2O, aspirando después de cada paso.</li>
		<li>Enjuague los émbolos de cámara en el ddH2O. Esto limpia de etanol residual de los émbolos y desde el puerto de titanio.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibración de sensores de oxígeno polarográfico.
	<ol>
<li>Añadir a cada cámara oxygraph, revolviendo el búfer continuamente por medio de barras de agitación magnética en la cámara a 750 rpm y 37 ° C con un intervalo de registro de datos en 2.0 2,4 mL de 1 x buffer de baja glucosa SAB s pulsando la tecla F7 y abriendo la pestaña con la etiqueta "Sistemas". Empujar los émbolos en y luego retraerse a la posición de aireación de la llave. Deje que la máquina equilibrar por un mínimo de 1 hora hasta que se obtiene el flujo de oxígeno estable.</li>
		<li>Coloque la máquina a 37 ° C durante la duración del experimento. Ajustar la tensión de polarización a 800 mV, con una ganancia de 2 pulsando la tecla F7 y abriendo la ficha marcada "Oxígeno, O2". Equilibrar la concentración de oxígeno del búfer SAB durante al menos 30 minutos, mientras que el cambio en la concentración de oxígeno es estable (menos de 2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>Tras la estabilización de la concentración de oxígeno, seleccionar una región donde el cambio de concentración de oxígeno es estable para establecer la medida de fondo de cambio en la concentración de oxígeno.<ol>
<li>Seleccione una región pulsando la tecla shift, click izquierdo del mouse y arrastrando el ratón a través de la región seleccionada. Haga clic en la letra asociada con la región seleccionada y el cambio a "R1" para cada rastro, correspondiente con cada una de las dos cámaras.</li>
			<li>Haga doble clic en el cuadro "O2 calibración" en la parte inferior izquierda y esquinas de la pantalla a la derecha, haga clic en el botón "select marca" para la "calibración de aire" como R1 y luego seleccione "calibrar y copiar al portapapeles" para ambas cámaras.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación de la respiración de las células beta 832/13 había elaborado en pasos 2.1.5 o 2.2.5.
	<ol>
<li>2,4 mL de muestra en cada cámara (una cámara con control vehículo tratado las células, una cámara con células tratadas compuestas) de la carga en 1 x baja glucosa Sab Conservar 0,5 mL de muestra de células para la cuantificación de proteínas por ensayo BCA (ácido Bicinchoninic) si se utiliza el enfoque de disociación mecánica (congelación a-20 ° C para la medición más adelante).<ol>
<li>Empuje el émbolo y aspirar el volumen residual. Remover las células continuamente durante todo el experimento en 750 rpm y 37 ° C durante todos los pasos posteriores. Haga una marca haciendo clic en F4 y etiquetado como "células" cuando se cargan las muestras.</li>
			<li>Medir las muestras durante 30 minutos. Después de la estabilización de la señal, seleccione una región del cambio en la concentración de oxígeno correspondiente a las condiciones de baja glucosa (glucosa de 2.5 mM) como se describe en 3.2.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 12,5 μl de una solución de glucosa estéril 45% (concentración final de 16,7 mM) en cada compartimiento a través de titanio puerto utilizando una jeringa de carga. Hacer que una marca de medida "Glucosa", como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione la región del cambio en la concentración de oxígeno, como se describe en 3.2.3. Esta es la lectura de glucosa de 16,7 mM y corresponde con las condiciones de estimulación7.</li>
		<li>Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 1 μl de oligomycin 5mM (2,5 μm concentración final) en cada compartimiento a través del puerto de carga. Hacer que una marca de medida "OligoA" como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione esta área de la curva como se describe en 3.2.3. A Oligomycin inhibe la ATP Sintetasa y por lo tanto el único oxígeno flujo que ocurre es por pérdida de electrones y no de la fosforilación oxidativa7.</li>
		<li>Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 1 mM FCCP en incrementos de 1 μl hasta que se establezca una tasa de respiración máxima. Esto representa máxima respiración desacoplada. Entre 3-4 μL FCCP es suficiente (1.5-2.0 μm concentración final) para inducir la respiración desacoplada máxima de células de INS-1 832/13. Haga una marca con la etiqueta "FCCP" como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione esta área de la curva como se describe en 3.2.3. FCCP es un agente Desacoplador. Esto nos permite medir respiración desacoplada7.</li>
		<li>Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 1 μl de 5 mM antimicina A (concentración final de 2.5 μm) en cada compartimiento a través del puerto de carga. Haga una marca con la etiqueta "AntiA" como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione esta área de la curva como se describe en 3.2.3. Nota: Antimycin A une citocromo C reductasa inhibe la oxidación de la ubiquinona y bloquea la respiración de todos. Esto nos permite parar completamente la respiración7.</li>
	</ol></li>
	<li>Medición de las células beta de 832/13 para la normalización de la proteína concentración y respiración.
	<ol>
<li>Usando 0.5ml de muestra retenida en el cargamento, muestra de proteína medida usando el método BCA13.</li>
		<li>Ejecute cada muestra por triplicado, sin dilución, siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 cálculos de respiración de la célula beta de células tripsinizaron.<ol>
<li>Introduzca el número de células por mL uso en el ensayo pulsando la tecla F3 del programa de análisis del respirómetro. Cambiar las unidades a células/mL, introducir la concentración celular y cambiar el medio Sab a</li>
		<li>Seleccionar lecturas de fondo para normalizar los datos seleccionando y entrar en el O2 forma de calibración como se describe en 3.2.3.</li>
		<li>Hacer selecciones de lecturas de 2,5 mM glucosa, 16,7 mM de glucosa, A Oligomycin, FCCP y Antimycin A como se describe en 3.3.1.</li>
		<li>Dentro del programa de análisis del respirómetro, exportar las lecturas para cada cámara después de entrar en la concentración de proteína y seleccionando los valores medios apropiados para cada tratamiento durante la medición de la respiración. Esto se hace haciendo clic en F2 y luego empuja la "copia a la función de Portapapeles". Exporta los datos para su uso en otros programas de análisis. Utilice los valores "O2 cuesta neg." para los cálculos.</li>
		<li>Compilar datos para 3-5 funciona independiente del vehículo tratado controles y naturales compuestos de células tratadas para determinar el efecto sobre intacto respiración celular de las células beta INS-1 832/13.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 cálculos de respiración de la célula beta de disociaron mecánicamente las células.<ol>
<li>Entrar en los cálculos de proteína desde el ensayo BCA pulsando la tecla F3 del programa de análisis del respirómetro. Cambiar las unidades a mg, entrar en la concentración de BCA y cambiar el medio Sab a</li>
		<li>Seleccionar lecturas de fondo para normalizar los datos seleccionando y entrar en el O2 forma de calibración como se describe en 3.2.3.</li>
		<li>Hacer selecciones de lecturas de 2,5 mM glucosa, 16,7 mM de glucosa, A Oligomycin, FCCP y Antimycin A como se describe en 3.3.1.</li>
		<li>Dentro del programa de análisis del respirómetro, exportar las lecturas para cada cámara después de entrar en la concentración de proteína y seleccionando los valores medios apropiados para cada tratamiento durante la medición de la respiración. Esto se hace haciendo clic en F2 y luego empuja la "copia a la función de Portapapeles". Exporta los datos para su uso en otros programas de análisis. Utilice los valores "O2 cuesta neg." para los cálculos.</li>
		<li>Compilar datos para 3-5 funciona independiente del vehículo tratado controles y naturales compuestos de células tratadas para determinar el efecto sobre intacto respiración celular de las células beta INS-1 832/13.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo de este protocolo es utilizar respirometria de alta resolución para medir tasas respiratorias en intacto las células beta pancreáticas. Este método permite la medición de la respuesta de la célula beta a niveles creciente de la glucosa. El protocolo también permite el tratamiento previo con varios compuestos, como se demuestra en el presente Protocolo con el natural monómero epicatequina o curcumina4,5. Tratamiento con...

El propósito principal de la célula beta pancreática es mantener sistema normoglycemia a través de la secreción de insulina estimulada por glucosa. Las células beta detecta cambios fisiológicos en la circulación de la glucosa en gran parte debido a la baja afinidad, transportador de glucosa de alta capacidad GLUT2 (glucosa transportador 2, Km 16,7 mM)1. Al aumentar los niveles de glucosa circulatoria, este transportador de baja afinidad alta capacidad facilita un aumento proporcional de la glucosa intracelular dentro de la célula beta. La glucosa se metaboliza a través de la glucólisis, el ciclo TCA (ciclo del ácido tricarboxílico) y respiración mitocondrial que resulta en elevados niveles celulares de ATP (trifosfato de adenosina). La concentración elevada de ATP bloquea los canales de ATP sensibles K+ , dando por resultado la despolarización de la membrana. Despolarización de la membrana provoca la apertura de canales de Ca2 + voltaje cerrada y posterior liberación de la vesícula obligado de gránulos de insulina2. Disfunción de célula beta es un sello de la Diabetes tipo 2 (T2D) y resulta en la secreción de insulina disminuida y mal controlada y en última instancia de la muerte de la célula beta3. Mecanismos que mantengan o mejoran la función de célula beta podrían ser utilizados como un tratamiento para T2D.
Los estudios han demostrado los efectos beneficiosos de origen natural compuestos a base de plantas en la célula beta pancreática4. Estos compuestos pueden tener su efecto a través de la creciente proliferación de la célula beta, la supervivencia o la secreción de insulina estimulada por glucosa. Por ejemplo, estudios recientes han demostrado que la antocianina monomérica aumenta la secreción de insulina estimulada por glucosa mediante el aumento de la respiración mitocondrial y aumento de ATP celular niveles5. Por lo tanto, entender cómo estos compuestos pueden aumentar la célula beta funcional masa es importante aprovechar estos compuestos como terapéutica potencial.
Respiración celular puede medirse a través de una serie de herramientas. Uso de un respirómetro alta resolución permite la titulación de moduladores químicos a una población celular permeabilized o intacto del6. Esta herramienta permite la adición de compuestos diversos, a diferentes concentraciones, dando así una amplia gama de información.
Dada la íntima conexión entre metabolismo de la glucosa y la función de células beta, las mediciones de la respiración celular son críticas. Las mediciones de la respiración celular se pueden hacer con que las células beta permeabilized o intactas, cada uno con su propio conjunto de ventajas y desventajas de7,8. Mientras que la permeabilización de las células beta permite medir diferentes aspectos de la cadena de transporte de electrones, lo hace sin respeto al mecanismo para inducir la respiración en la célula beta, la absorción de la glucosa y el metabolismo. Por lo tanto, el uso de la respiración de la célula beta unpermeabilized es una técnica muy útil para determinar la respuesta de las células beta a diversos niveles de la glucosa, utilizando el consumo de oxígeno como la lectura.
El propósito de esta técnica es medir consumo de oxígeno intactas INS-1 derivados de las células beta 832/13. Esta técnica nos permite determinar la respuesta de las células beta a las condiciones unstimulatory de la glucosa (glucosa 2,5 mM) así como de las condiciones estimulantes glucosa (16,7 mM de glucosa). Mientras que las células unpermeabilized no nos permiten probar individualmente complejo I, II o III del electrón transporte de cadena, la técnica de permitir mediciones con respiración de inhibición (Oligomycin A), desacoplada IV complejo (FCCP-carbonilo cianuro- 4- phenylhydrazone (de trifluoromethoxy)) y totalmente inhibida (Antimycin A) la respiración. Este estudio demuestra la eficacia de la medición de la respiración en intactas unpermeabilized las células beta pancreáticas, así como el efecto de dos compuestos que ocurren naturalmente, antocianina monomérica y curcumina, sobre la respiración de la célula beta.

<table><tbody><tr><td>O2k Core: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrumento para respirometría de alta resolución</td></tr><tr><td>Programa DatLab 6</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>Programa informático para el análisis de la respirometría de alta resolución</td></tr><tr><td>Línea celular INS-1 832/13</td><td>Centro Médico de la Universidad de Duke</td><td>NONE</td><td>Línea celular beta, regalo del Dr. Christopher Newgard</td></tr><tr><td>Curcumina</td><td>Sigma</td><td>C7727</td><td>Pretratamiento de células beta</td></tr><tr><td>Monómero de epicatequina de cacao</td><td>Instituto Politécnico y Universidad Estatal de Virginia</td><td>NINGUNO</td><td>Pretratamiento de células beta, regalo del Dr. Andrew Neilson</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 medios de células beta</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 componente de medios de células beta</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 componente de medios de células beta</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 componente de medios de células beta/ 1x SAB</td></tr><tr><td>Buffer Glutamine</td><td>Caisson</td><td>GLL01</td><td>832/13 componente de medios de células beta</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>832/13 componente</td></tr> <tr>de medios de células beta<td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 componente de medios de células beta</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>Componente de tampón SAB 10x</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Componente de tampón SAB 10x</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Componente de tampón SAB 10x</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Componente de 10x tampón SAB</td></tr><tr><td>D-(+)-Solución de glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Componente de 1x tampón SAB, químico para ensayo de respiración</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Componente de 1x tampón SAB</td></tr><tr><td>35% BSA Solución</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>Componente de 1x tampón SAB</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Componente de 1x tampón SAB</td></tr><tr><td>200 prueba de etanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Oxygraph Oxygraph O2k Chambers</td></tr><tr><td>Oligomicina A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Productos químicos para el ensayo de respiración</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Productos químicos para el ensayo de respiración</td></tr><tr><td>Anitmicina A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Productos químicos para el ensayo de respiración</td></tr><tr><td>BCA Protein Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>Para determinar la concentración de proteínas</td></tr></tbody></table>

respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de beta en presencia de compuestos naturales

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Respirometría de alta resolución permite la medición de consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas, células y tejidos. Las células beta juega un papel fundamental en el cuerpo por controlar niveles de glucosa en sangre a través de la secreción de insulina en respuesta a las concentraciones de glucosa elevada. La secreción de insulina es controlada por la respiración mitocondrial y el metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, medir respiración intacta de la célula beta es esencial para poder mejorar la función de célula beta como tratamiento para la diabetes. Con intacto 832/13 INS-1 derivados de las células beta podemos medir el efecto de aumentar la concentración de glucosa en la respiración celular. Este protocolo nos permite medir la respiración de la célula beta en la presencia o ausencia de diferentes compuestos, que le permitirán determinar el efecto de dar compuestos sobre la respiración de la célula intacta. Aquí se demuestra el efecto de dos compuestos que ocurren naturalmente, antocianina monomérica y curcumina, sobre la respiración de la célula beta bajo la presencia de condiciones de alta glucosa (16,7 mM) o baja (2,5 mM). Esta técnica puede utilizarse para determinar el efecto de diversos compuestos sobre la respiración de la célula beta intacta en presencia de diferentes concentraciones de glucosa.

INS-1 832/13 beta células que son preparadas y cosecha como se describe en el protocolo de demostrará la modulación en el consumo de oxígeno, basado en las diversas intervenciones químicas (figura 1A). Se observó un aumento en la respiración cuando la concentración de glucosa se incrementa a 16,7 mM de glucosa (figura 1B). La respiración disminuye cuando se tratan de las células intactas Oligomycin A. Esta respiración se conoce como escape, que se define como el...

El objetivo de este protocolo es medir el efecto de la glucosa mediada por cambios en la respiración mitocondrial en presencia de compuestos naturales en las células beta de la intacta 832/13 mediante respirometría de alta resolución.

Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

El objetivo general de este enfoque es evaluar directamente la función respiratoria de las células beta pancreáticas, en condiciones estimuladoras de insulina. Esto también se puede utilizar para observar el efecto de diferentes compuestos en la función respiratoria de las células beta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología de las células beta pancreáticas, como si un determinado compuesto afecta la función de las células beta pancreáticas a través de cambios en la respiración.La principal ventaja de esta técnica, es que se puede utilizar para evaluar directamente la función respiratoria en las células beta pancreáticas, en condiciones basales y estimuladoras de insulina. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación de la célula y uso de la máquina son difíciles de aprender, debido a la precisión requerida en la preparación de la célula y la medición de la respiración. Para empezar, cultive células beta 832/13 derivadas de INS-1 en RPMI 1640 suplementado.Retirar las células de un matraz T75, añadiendo dos mililitros de tripsina al 0,25%, e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A conti

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describen los métodos de biopsia de músculo vasto lateral, la preparación de las mitocondrias purificada, y perfilado respirométrico. El uso de volumen muscular pequeña hace que esta técnica adecuada para aplicaciones de investigación clínica.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

Aquí, se toma una muestra de músculo cuádriceps de un cerdo anestesiado y se aíslan las mitocondrias por centrifugación diferencial. A continuación, se determinan las frecuencias respiratorias de los complejos de cadenas respiratorias mitocondriales I, II y IV mediante respirometría de alta resolución.

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.

Respirometría de alta resolución para evaluar la bioenergética en células y tejidos utilizando respirómetros basados en cámaras y placas

La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

El estado metabólico de las células epiteliales pigmentarias de la retina humana (H-RPE) refleja su salud y función. Aquí se presenta un protocolo optimizado para examinar el flujo metabólico en tiempo real de H-RPE utilizando respirometría de alta resolución.

Análisis en tiempo real de la bioenergética en células epiteliales pigmentarias de la retina humana primaria mediante respirometría de alta resolución

El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Los métodos para estudiar la bioenergética mitocondrial bajo concentraciones de sustrato fisiológicamente relevantes en las células inmunitarias son limitados. Proporcionamos un protocolo detallado que utiliza fluororrespirometría de alta resolución para evaluar los cambios en la respuesta del potencial de la membrana mitocondrial a la demanda de energía en células T humanas, monocitos y células mononucleares periféricas.

Fluorrespirometría de alta resolución para evaluar los cambios dinámicos en el potencial de la membrana mitocondrial en células inmunitarias humanas

Aquí, mostramos que la cámara de 0,5 ml para la respirometría de alta resolución muestra resultados que son consistentes con la cámara de 2,0 ml si se aplica la corrección de fondo instrumental O2 adecuada. Requiere menos muestra, lo que es ventajoso para estudios con disponibilidad limitada o bajas capacidades respiratorias.

Respirometría de alta resolución en una cámara de pequeño volumen

Presentamos un método no invasivo y en tiempo real para monitorizar la salud mitocondrial utilizando la espectroscopía Raman por resonancia (RRS). Utilizamos RRS para cuantificar los estados redox mitocondriales y desarrollamos una métrica para la salud mitocondrial, la Resonancia Raman reduce la relación mitocondrial (3RMR), que muestra una respuesta más rápida a los cambios en la oxigenación que los analitos hemato-gases tradicionales.

Evaluación en tiempo real y no invasiva de la función mitocondrial mediante espectroscopía Raman por resonancia

Aprende a medir la respiración mitocondrial en células beta pancreáticas intactas mediante respirometría de alta resolución. Este método evalúa el efecto de compuestos naturales sobre la función celular bajo condiciones estimuladoras de insulina.

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Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales

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