Investigación de la síntesis de RNA utilizando 5-Bromouridine etiquetado e inmunoprecipitación

El objetivo general de este experimento es medir los cambios en la síntesis de ARN mediante el marcaje y la inmunoprecipitación de bromouridina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo del ARN al medir si un cambio en los niveles de ARN es causado por cambios en la síntesis de ARN. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar en cualquier tipo de cultivo celular preferido y los materiales utilizados son fácilmente accesibles.

Para comenzar el protocolo, siembre 3,5 veces 10 a la sexta HEK293T células en una placa de Petri de 10 centímetros en 10 mililitros de medio de crecimiento para obtener un total de más de 40 microgramos de ARN en la extracción 48 horas después. Mantenga las celdas a 37 grados centígrados y 5% de CO2.48 horas después de la siembra, aspire ocho mililitros de medio de crecimiento y deje dos mililitros para evitar que las celdas se sequen. Agregue dos milimoles de bromouridina y tratamiento al medio de crecimiento, y elimine los dos mililitros residuales de las células antes de volver a aplicar los ocho mililitros de medio de crecimiento que contienen bromouridina.

A continuación, incuba las células durante una hora. Después de la incubación, lave las células en cinco mililitros de tampón de Hank y tripsinícelas con dos mililitros de tripsina al 0,05% durante cinco minutos. Agregue ocho mililitros de medio de crecimiento para detener la reacción, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y haga girar las células durante dos minutos a 1.000 veces g.

A continuación, retire el sobrenadante y extraiga el ARN total de la célula utilizando un kit de aislamiento de ARN, y eluya el ARN en agua libre de ARNasa. Esta técnica es muy sensible, por lo que es importante trabajar con ARN de alta calidad. Por lo tanto, la extracción de ARN es un paso crítico, pero también se realiza fácilmente con los kits de extracción de ARN actuales.

Prepare las perlas en un lote para el número de muestras que se van a investigar, más una adicional para tener en cuenta las pérdidas durante el pipeteo y la mezcla por remolino. Vuelva a suspender completamente las perlas magnéticas IgG anti-ratón mezclándolas con remolino y extraiga 20 microlitros de perlas por muestra en un tubo de 1,5 mililitros sin ARNasa. Coloque el tubo de 1,5 mililitros en un soporte magnético durante 20 segundos para que las cuentas se acumulen en el costado.

Retire el sobrenadante, saque el tubo del soporte magnético y vuelva a suspender las perlas en 40 microlitros de tampón de bromouridina-IP una vez por pipeteo. Gire el tubo durante dos segundos en una centrífuga de mesa, vuelva a colocarlo en el soporte magnético y retire el sobrenadante. A continuación, bloquee la unión inespecífica a las perlas mediante heparina.

Vuelva a suspender las perlas en un mililitro de una vez bromouridina-IP más un miligramo por mililitro de tampón de heparina, y gire el tubo durante 30 minutos. Luego, lava las cuentas una vez. Vuelva a suspender las perlas en un mililitro de tampón de bromouridina-IP y agregue 1,25 microgramos por muestra de anticuerpo anti-alfa-bromodeoxiuridina.

Incuba las perlas durante una hora mientras giras. Después de la incubación, lave las perlas tres veces. Vuelva a suspender las perlas lavadas en 50 microlitros por muestra de tampón una vez bromouridina-IP suplementado con un milimolar de bromouridina, y deje las perlas en rotación durante 30 minutos.

Después de la rotación, lavar las perlas tres veces y volver a suspender las perlas en 50 microlitros por muestra de tampón de bromouridina-IP cada vez. Mida las concentraciones de ARN en los extractos de ARN utilizando espectrofotometría ultravioleta-visible y diluya 40 microgramos de ARN de cada muestra en agua libre de ARNasa hasta un volumen total de 200 microlitros. Después de desnaturalizar el ARN durante dos minutos a 80 grados centígrados, centrifugar brevemente las muestras en una centrífuga de mesa.

Después de centrifugar, añadir 200 microlitros de dos veces bromouridina-IP más BSA, inhibidor de la RNasa. A continuación, añada 50 microlitros de las perlas resuspendidas y preparadas a cada muestra, y rote las muestras durante una hora. Después de la incubación, lave las perlas cuatro veces.

Vuelva a suspender las perlas en 200 microlitros de tampón de elución para eluir el ARN y agregue rápidamente 200 microlitros de fenol de pH 6.6 para eliminar cualquier molécula que no sea ARN de la muestra. Gire la muestra para mezclarla y gírela durante tres minutos a 25.000 veces g en una centrífuga de mesa. A continuación, aspire la mayor cantidad posible de la fase superior, aproximadamente 190 microlitros, y muévala a un tubo con 200 microlitros de fenol-cloroformo de pH 6,6.

Asegúrese de aspirar la misma cantidad en todas las muestras. Gira la muestra y gírala. Después del centrifugado, realice la extracción de cloroformo aspirando la fase superior acuosa, aproximadamente 180 microlitros, y transfiéralo a un tubo que contenga 200 microlitros de cloroformo.

Gire y luego gire la muestra. Aspirar la fase superior acuosa, aproximadamente 170 microlitros, y transferirla a un tubo que contenga 17 microlitros de acetato de sodio de pH seis molar para neutralizar y precipitar el ARN de la solución acuosa. A continuación, añade dos microlitros de glucógeno, que precipitarán con el ARN y harán que el pellet sea más visible.

Agregue 500 microlitros de etanol al 96% para aumentar la unión entre los iones de sal y el ARN, y mezcle invirtiendo el tubo un par de veces. Deje el tubo toda la noche a menos 20 grados centígrados o durante 15 minutos sobre hielo seco. Centrifugar la muestra refrigerada, desechar el sobrenadante sin alterar el pellet y lavar el pellet en 185 microlitros de etanol al 75% para eliminar la sal residual.

A continuación, centrifugar la muestra a 25.000 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante por completo sin alterar el pellet y deje que el pellet se seque durante cinco a 10 minutos con la tapa abierta. Vuelva a suspender el pellet en 10 microlitros de agua sin RNasa aplicada en el lateral del tubo para evitar perturbar el pellet.

Las células AsPC-1 se trataron con bromouridina durante cero, una, dos y 4,5 horas, seguidas de extracción de ARN total y bromouridina-IP. GAS5 y GAPDH se midieron en ARN de bromouridina-IP, lo que demostró que una hora de marcaje fue suficiente para alcanzar un cambio de nueve y 44 veces en comparación con el de fondo. Dos milimoles de tratamiento con bromouridina no indujeron ningún cambio morfológico en las células HEK293T durante una hora ni durante el tratamiento más largo de cuatro horas.

La inhibición de PLK-2 causó un aumento en el ARNm de alfa-sinucleína tanto en la entrada como en la bromouridina-IP, lo que sugiere que el aumento en el ARN de estado estacionario es causado por un aumento en la síntesis de ARN. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo marcar el ARN recién sintetizado con bromouridina y realizar una inmunoprecipitación posterior de bromouridina y el ARN marcado.