Name: Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprende a generar proteínas acetiladas homogéneamente en sitios específicos usando Escherichia coli como huésped de expresión. Este protocolo emplea expansión del código genético para estudiar modificaciones postraduccionales.

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Este trabajo fue financiado por los NIH (AI119813), la puesta en marcha de la Universidad de Arkansas y el premio del Instituto de biociencias de Arkansas.

1. dirigida mutagénesis Gene de la blanco
Nota: MDH se expresa bajo el promotor de T7 en el vector de pCDF-1 con el origen de CloDF13 y un número de copia de 20 a 4034.
<ol><li>Introducir el codón ámbar en la posición 140 en el gene de cartillas (adelante cartilla: GGTGTTTATGACetiquetaAACAAACTGTTCGGCG y revertir la cartilla: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), siguiendo las instrucciones del kit de mutagénesis sitio-dirigida.</li>
	<li>Amplificar el plásmido de plantilla que contiene el gen de la dehidratasa del malato de tipo salvaje e inserte la mutación del codón de parada por la reacción de polimerasa (PCR) reacción en cadena. En la mezcla de reacción, son 12,5 μl de mezcla de enzima de polimerasa de ADN X 2, 1.25 μl de primer avance de 10 μm, 1,25 μl de cebador inverso de 10 μm, 1 μl de ADN de plantilla (20 ng/μL) (pCDF-1 plásmido que contiene el gen de tipo salvaje MDH) y 9 μl de agua libre de nucleasa.<ol>
<li>Utilizar parámetros de reacción de polimerización en cadena del siguiente modo: inicial de desnaturalización a 98 ° C por 30 s; 25 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C y a 3 min a 72 ° C; extensión final a 72 ° C durante 3 minutos. Después de la polimerización en cadena, agregue el material amplificado directamente a la mezcla de enzima quinasa-ligasa-DpnI del kit por 1 h a temperatura ambiente para la eliminación de la circularización y plantilla. Nota: La mezcla de reacción contiene 1 μl del producto PCR, 5 μl de 2 X Buffer de reacción, 1 μl de mezcla de enzima quinasa-ligasa-DpnI de X 10 y 3 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 5 μl de la mezcla de reacción con el tubo 25 μl descongelado competentes de e. coli DH5α células del kit. Cuidadosamente el tubo para mezclar la película y coloque la mezcla en hielo durante 30 min choque del calor la mezcla a 42 ° C por 30 s y el lugar en hielo durante 5 minutos adicionales.<ol>
<li>Pipetear 600 μl de caldo Super óptima con los medios de represión (SOC) de catabolito del kit de temperatura en la mezcla, incubar a 37 ° C durante 60 min, con agitación a 250 rpm, 100 μL en una placa de agar de lisogenia caldo (LB) con el correspondiente antibiótico de propagación e incubar toda la noche a 37 ° C con agitación a 250 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccionar colonias solo 4-6 en 6 mL fresco LB medios con el antibiótico correspondiente e incubar durante una noche a 37 ° C con agitación a 250 rpm. Extraer plásmidos de cada cultura durante la noche por el kit de purificación del plásmido, siguiendo el manual del fabricante, luego enviar plásmidos para la secuenciación del ADN según el protocolo de la empresa para confirmar la mutación del codón de parada en posición correcta.</li>
	<li>Almacenar la tensión con la secuencia correcta a-80 ° C mediante la mezcla de cultura durante la noche de 1 mL y 300 μL 100% DMSO.</li>
</ol>2. expresión de la proteína acetilada
<ol><li>Introducir los genes de optimizado acetyllysyl-tRNA sintetasa33 y optimizado tRNAPyl 32 en el plásmido de pTech . Lugar gen tRNA sintetasa bajo el promotor constitutivo lpp . Lugar el gen tRNA bajo el promotor constitutivo proK del34.<ol>
<li>Transformar conjuntamente la expresión vector34 que contiene el gene transformado que contiene la etiqueta de la malato deshidrogenasa, y el plásmido que el sistema de incorporación de acetyllysine optimizado, en 25 μl descongeladas competente e. coli BL21(DE3) células por choque térmico a 42 ° C por 10 s y el lugar en el hielo durante 5 minutos adicionales.</li>
		<li>Pipetear 600 μl de medio SOC de temperatura en la mezcla, incubar a 37 ° C durante 60 min con agitación en rpm 275, extensión 100 μL en una placa con estreptomicina μg/mL 100 y 50 μg/mL cloranfenicol e incubar durante una noche a 37 ° C con agitación a 275 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger una sola Colonia de la placa e inocular en medios LB frescos 15 mL con 100 estreptomicina μg/mL y el cloramfenicol 50 μg/mL en un tubo de 50 mL durante la noche a 37 ° C con agitación a la velocidad de 250 rpm. Transferencia de la cultura durante la noche de 15 mL a 300 mL fresco LB medios con antibióticos en un matraz de 1 L e incubar a 37 ° C con agitación a 250 rpm.</li>
	<li>Disolver acetyllysine con agua para hacer la solución stock de 100 mM, almacenar a 4 ° C. Añadir acetyllysine de 5 mM y 20 mM nicotinamida (inhibidor de desacetilasas) a los medios de crecimiento cuando la absorbancia alcanza 0.5 a 600 nm.<ol>
<li>Cultivar células por un adicional 1 h a 37 ° C, agitación a 250 rpm, añada 0,5 mM IPTG para expresión de la proteína y crecen las células a 25 ° C durante la noche, con agitación a 180 rpm. Nota: Las condiciones de expresión necesario optimización para diferentes proteínas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recogen las células por centrifugación a 3.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos, descartar el sobrenadante y lavar el pellet celular con el tampón fosfato salino (PBS) buffer (10 mM de Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Recoger las células lavadas a 10.000 x g a 4 ° C por 5 min, descartar el sobrenadante y almacenar pellets de células a-80 ° C.</li>
</ol>3. purificación de la proteína acetilada
<ol><li>Descongelar los pellets de células congeladas en el hielo y vuelva a suspender con 15 mL de tampón de lisis (50 mM tris (hidroximetil) aminometano (Tris), pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol de 20 mM y 20 mM nicotinamida), 5 μl de β-mercaptoetanol y nucleasa de Benzonase μL 1 (250 unidades).</li>
	<li>Rompen las células por sonicación de 40 kHz a 70% potencia de salida con 10 ciclos de ráfagas cortas de 10 s, seguidos por intervalos de 30 s para la refrigeración de extracto crudo de la forma. Extracto de centrífuga crudo a 20.000 x g durante 25 minutos a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante con el filtro de membrana de 0,45 μm y cargar en una columna que contiene 1 mL de resina (Ni-NTA) ácido nitrilotriacético níquel, equilibrada con 20 mL de agua y 20 mL de tampón de lisis. Nota: Las células también podrían romper por detergentes suaves, si no hay baño de ultrasonidos.</li>
	<li>Lavar la columna con 20 mL de tampón de lavado (50 mM Tris, pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol de 50 mM y 20 mM nicotinamida) y luego eluir con 2 mL de tampón de elución (50 mM Tris, pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol de 150 mM y 20 mM nicotinamida).</li>
	<li>Desalar la fracción de elución con buffer 25 mM Tris pH 7,8 y 10 mM (NaCl) la desalación la columna PD-10, siguiendo el manual del fabricante. Medir la concentración de la proteína eluída siguiendo la instrucción del reactivo de análisis de la proteína de Bradford. La proteína desalada está lista para más experimentos. Nota: Hacer stock de glicerol 50% de la proteína y guardar en-80 ° C para el almacenamiento.</li>
</ol>4. bioquímico caracterización de la proteína acetilada
<ol><li>
Análisis de SDS-PAGE y masa espectrometría.
	<ol>
<li>Desnaturalizar las proteínas con el sodio dodecil sulfato (SDS) tampón de muestra (5 μl proteína muestra con 2 μl 4 X tampón SDS) en un tubo de 2 mL a 105 ° C por 5 min, centrifugar la mezcla a 2000 x g durante 10 s, carga sobre el 4-20% sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel este gel oresis (SDS-PAGE) y ejecutar a 200 V durante 30 minutos.</li>
		<li>Lavar el gel con agua destilada y agitar suavemente durante 5 min, repetir el proceso 3 veces. Deseche el agua y teñir el gel con colorante azul de Coomassie para 1 h con agitación suave. -Teñir el gel con agua destilada, agitar suavemente durante 30 minutos y repita esto de manchas 3 veces.</li>
		<li>Corte la banda de 33 kDa en el gel SDS-PAGE teñido de azul de Coomassie y envían a instalaciones de espectrometría de masas o las empresas para confirmar que la acetyllysine fue incorporada en la posición diseñada. Nota: El protocolo de análisis de espectrometría de masas siguió el experimento anterior34.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
El borrar occidental
	<ol>
<li>Correr el gel SDS-PAGE con el mismo protocolo en el paso 4.1. Después el gel ejecutar, poner en remojo el gel con el tampón de transferencia (25 mM Tris, glicina 192 mM, pH 8.3 y 20% metanol) durante 15 minutos.</li>
		<li>Activar un 0.2 μm, membrana de difluoruro (PVDF) del polivinilideno de 7 cm x 8,5 cm con metanol durante 1 min y lavar con tampón de transferencia antes de preparar el sándwich de transferencia. Nota: El metanol es peligroso en caso de contacto con la piel, contacto con los ojos, ingestión o inhalación. La sobreexposición severa puede causar la muerte.</li>
		<li>Hacer el sandwich de la transferencia del cátodo al ánodo (esponja, papel de filtro, SDS-PAGE gel, PVDF membrana, papel de filtro y esponja). Poner la pila en el tanque de la transferencia, a una corriente constante de 350 mA para 45 minutos. Nota: Tiempo de transferencia puede necesitar optimización.</li>
		<li>Lavar la membrana PVDF con 25 mL con tampón Tris salino, 0,1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween 20, pH 7,6) buffer por 5 min con agitación suave. Bloquear la membrana con 5% albúmina sérica bovina (BSA) en el buffer TBST por 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar la membrana con acetyllysine-anticuerpo conjugado con HRP con una concentración final de 1 μg/mL diluido con 5% de BSA en TBST a 4 ° C durante la noche con agitación suave. Nota: Para resultados más rápidos, este paso podría realizarse a temperatura ambiente durante 1 hora. La dilución del anticuerpo puede necesitar optimización.</li>
		<li>Lavar la membrana con 20 mL de tampón de TBST por 5 min con agitación suave, repetir el paso 4 veces. El sustrato de la quimioluminescencia se aplica a la membrana siguiendo las instrucciones del fabricante. Capturar la señal con un sensor de cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La incorporación genética de noncanonical aminoácidos (ncAAs) se basa en la supresión de un codón asignado, sobre todo el ámbar stop codón UAG36,37,38,39, por el tRNA cargado de ncAA que contiene el anticodon correspondiente. Como es sabido, el codón UAG es reconocido por el factor de liberación-1 (RF1) en bacterias y puede también ser suprimido por cerca de tRNAs cognado de anfitriones por ami...

(PTMs) las modificaciones post-traduccionales de las proteínas ocurren después del proceso de traducción y surgen de adición covalente de grupos funcionales a los residuos del aminoácido, jugando papeles importantes en casi todos los procesos biológicos, incluyendo gene transcripción, respuesta al estrés, diferenciación celular y metabolismo1,2,3. Hasta la fecha, cerca de 400 distintivo PTMs han sido identificados4. La complejidad del genoma y el proteoma se amplifica en gran medida por la proteína MPa, regular localización y actividad de la proteína, y afectan la interacción con otras moléculas como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y cofactores5.
Acetilación de proteínas ha estado a la vanguardia de los estudios de MPa en las última dos décadas6,7,8,9,10,11,12. Acetilación de la lisina fue descubierta en las histonas hace más de 50 años13,14, ha sido bien analizado y se sabe para existir en más de 80 factores de transcripción, reguladores y varias proteínas15, 16,17. Estudios sobre la acetilación de proteínas no sólo nos proporciona una comprensión más profunda de sus mecanismos reguladores, sino también guiada por tratamientos para un número de enfermedades causadas por acetilación disfuncional18,19, 20 , 21 , 22 , 23. se creía que la acetilación de la lisina ocurre solo en eucariotas, pero estudios recientes han demostrado que la acetilación de proteínas también juega un papel clave en la fisiología bacteriana, incluyendo chemotaxis, resistencia ácida, la activación y estabilización de Islas de patogenicidad y virulencia otra relacionadas con las proteínas24,25,26,27,28,29.
Un método comúnmente utilizado para caracterizar bioquímicamente la acetilación de la lisina está utilizando mutagénesis sitio-dirigida. Glutamina es utilizada como un imitador de acetyllysine debido a su tamaño y polaridad similar. Arginina es utilizada como un imitador de lisina no acetilado, ya que conserva su carga positiva en condiciones fisiológicas pero no puede ser acetilado. Sin embargo, ambos imitadores no son isosteres reales y no siempre producen los resultados esperados30. El enfoque más riguroso es generar homogéneo acetiladas proteínas en residuos de lisina específico, que es difícil o imposible por métodos más clásicos debido a la baja estequiometría de acetilación de la lisina en naturaleza7,11. Este desafío ha sido desentrañando la estrategia de expansión del código genético, que emplea una ingeniería pyrrolysyl-tRNA sintetasa variante de especies Methanosarcinaceae para cargar tRNAPyl con acetyllysine, utiliza el host traslacional maquinaria para suprimir la UAG stop codon en el mRNA y dirige la incorporación de acetyllysine en la posición diseñada de la proteína blanco del31. Recientemente, hemos optimizado este sistema con una mejor EF-Tu-Unión tRNA32 y un actualizado acetyllysyl-tRNA sintetasa33. Además, hemos aplicado este sistema mayor incorporación en estudios de acetilación de la malato deshidrogenasa34 y Tirosil tRNA sintetasa35. Aquí, demostramos el protocolo para la generación de proteínas puramente acetiladas de la clonación molecular para identificación bioquímica mediante el uso de malato deshidrogenasa (MDH), que hemos estudiado como ejemplo demostrativo.

<table><tbody><tr><td>Ensayo de proteínas Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Concentración de proteínas</td></tr><tr><td>4x Tampón de muestra Laemmli</td><td>Tampón de muestra</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td> SDS</tr><tr><td>Coomassie G-250 Tinción</td><td>Bio-Rad</td><td>1610786</td><td>SDS-PAGE tinción en gel</td></tr><tr><td>4-20% Gel listo para SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>4561093</td><td>Determinación</td></tr><tr><td>de proteínas Ac-K-100 (HRP Conjugate)</td><td>Cell Señalización</td><td>6952</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>CHEM-IMPEX</td><td>194</td><td>Inductor de expresión</td></tr><tr><td>N&epsilon; -acetil-L-lisina</td><td>CHEM-IMPEX</td><td>5364</td><td>Columna</td></tr><tr><td>de desalinización de aminoácidos no canónicos PD-10</td> GE <td>Healthcare</td><td></td><td>17085101 Desalinización</td></tr><tr><td>Q5 Kit de mutagénesis dirigida al sitio</td><td>NEB</td><td>E0554</td><td>Presentamos las células de codón de parada</td></tr><tr><td>BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527</td><td>Expresando cepa</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN</td><td></td><td>27106</td><td>Extracción de plásmidos Resina</td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>Resina de purificación por afinidad</td></tr><tr><td>nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3376</td><td>Inhibidor de la desacetilasa</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Agente reductor</td></tr><tr><td>BugBuster Reactivo de extracción de proteínas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70584</td><td>Rompiendo células</td></tr><tr><td>Benzonasa nucleasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>DNasa</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>ThermoFisher</td><td>32106</td><td>Quimioluminiscencia</td></tr><tr><td>Caldo LB premezclado</td><td>VWR</td><td>97064</td><td>Medio de crecimiento celular</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td>Western blots Bloqueo</td></tr></tbody></table>

un protocolo fácil de generar proteínas site-specifically acetiladas en escherichia coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Modificaciones post-traduccionales que ocurren en las posiciones específicas de proteínas han demostrado desempeñar un papel importante en una variedad de procesos celulares. Entre ellos, la acetilación reversible de la lisina es uno de los más ampliamente distribuidos en todos los ámbitos de la vida. Aunque se han realizado numerosos estudios de acetylome basada en espectrometría de masa, más caracterización de estos objetivos de acetilación putativo ha sido limitada. Una razón posible es que es difícil generar proteínas puramente acetiladas en posiciones deseadas por mayoría enfoques bioquímicos clásicos. Para superar este reto, se ha aplicado la técnica de expansión del código genético para utilizar el par de una variante de ingeniería pyrrolysyl-tRNA sintetasa y su cognado tRNA de las especies de Methanosarcinaceae , para dirigir la incorporación cotranslacional de acetyllysine en el sitio específico en la proteína de interés. Después de la primera aplicación en el estudio de la acetilación de histonas, este enfoque ha facilitado estudios de acetilación sobre una variedad de proteínas. En este trabajo, hemos demostrado un protocolo fácil para producir proteínas site-specifically acetiladas utilizando la bacteria Escherichia coli de la modelo como anfitrión. Malato deshidrogenasa fue utilizada como un ejemplo de demostración en este trabajo.

El rendimiento de proteína MDH acetilado fue 15 mg por cultura de 1 L, mientras que la de tipo salvaje MDH fue 31 mg por cultura de 1 L. Proteínas purificadas fueron analizadas por SDS-PAGE, como se muestra en la figura 1. El MDH de tipo salvaje fue utilizado como un control positivo de34. La proteína purificada de células que el sistema de incorporación de acetyllysine (AcK) y el gen mutante mdh , pero sin confirmación en med...

Expansión del código genético sirve como una poderosa herramienta para el estudio de una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo acetilación de proteínas. Aquí demostramos un protocolo fácil aprovechar esta técnica para generar homogéneo acetilado proteínas en sitios específicos en células de Escherichia coli .

Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

En este trabajo, demostraremos un protocolo fácil para producir proteínas acetiladas homogéneamente en sitios específicos mediante el uso de E. coli como huésped de expresión. La acetilación reversible de lisina de proteínas es una de las modificaciones postraduccionales más abundantes en la naturaleza. Desempeña un papel importante en una amplia gama de procesos biológicos, como la transcripción de genes, la respuesta al estrés, la diferenciación celular y el metabolismo.La generación de proteínas puramente acetiladas en posiciones de diseño es muy útil para estudiar la acetilación de proteínas. Sin embargo, es difícil para la mayoría de los métodos clásicos. Este reto se ha resuelto mediante la técnica de expansión del código genético.Utiliza una variación de pirrolisil-ARNt sintetasa diseñada para cargar ARNt-Pyl con acetillisina, luego utiliza la maquinaria de traducción del huésped para suprimir el codón de parada UAG en el ARNm y dirige la incorporación de acetillisina en la posición de diseño de la proteína objetivo. En primer lugar, el codón de parada ámbar debe introducirse en la posición correspondiente en el gen diana mediante mutagénesis dirigida al sitio. Amplifique el plásmido molde que contiene el gen de las proteínas de tipo salvaje e inserte la mutación del codón de parada de los cebadores mediante la reacción de PCR.Después de la PCR, el material amplificado se añade directamente a la mezcla de enzimas quinasa-ligasa-Dpn1 durante una hora a temperatura ambiente para su circularización y eliminación de la plantilla. Agregue cinco microlitros de la mezcla al tubo de 25 microlitros de células competentes de E. coli descongeladas. Agite con cuidado el tubo para mezclar y coloque la mezcla en hielo durante 30 minutos.Calienta la mezcla a 42 grados centígrados durante 30 segundos y colócala en hielo durante cinco minutos más. Pipetee 600 microlitros de medios SOC a temperatura ambiente en la mezcla. Incubar a 37 grados centígrados durante 60 minutos con agitación.Esparcir 100 microlitros en el plato con el antibiótico correspondiente, e incubar toda la noche a 37 grados centígrados. El plásmido de la colonia única se envía para su secuenciación. El segundo paso es expresar y purificar la proteína acetilada específica del sitio.Recoge una sola colonia de la placa, que contiene el gen diana mutado que contiene TAG y el sistema de incorporación de acetillisina. Inocular en 15 mililitros de medios LB frescos con los antibióticos correspondientes durante la noche a 37 grados centígrados. Transfiera el cultivo de 15 mililitros durante la noche a un medio LB fresco de 300 mililitros con antibióticos e incube a 37 grados centígrados.Agregue acetillisina de cinco milimolares y nicotinamida de 20 milimolares como concentraciones finales en el medio de crecimiento cuando la absorbancia alcance 5 a 600 nanómetros. Cultive las células durante una hora adicional a 37 grados centígrados. Luego agregue el inductor para la expresión de proteínas y haga crecer las células a 25 grados centígrados durante la noche.Recoja las células centrifugando a 3.000 g durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos de celda a menos 80 grados. Descongele los gránulos de células congeladas en hielo y vuelva a suspender con 15 mililitros de tampón de lisis, cinco microlitros de beta-mercaptoetanol y un microlitro de nucleasa.Las células se rompen por sonicación. Centrifugar el extracto crudo a 20.000 g durante 25 minutos a cuatro grados. Filtre el sobrenadante con un filtro de membrana de 45 micrómetros.Cargue la muestra filtrada en una columna que contenga un mililitro de resina NTA de níquel, equilibrada con 20 mililitros de tampón de lisis. Lave la columna con 20 mililitros de tampón de lavado. La proteína diana se elude con dos mililitros de tampón de elución.La proteína purificada es desalinizada por la columna PD-10 agregando una muestra de 2,5 mililitros y recolecta la muestra desalinizada con tampón desalinizante de 3,5 mililitros. El siguiente paso es caracterizar bioquímicamente la proteína acetilada purificada. Desnaturalice las proteínas con el tampón de muestra SDS por encima de 100 grados durante cinco minutos.Centrifugar la mezcla, cargarla en el gel SDS-PAGE y hacer funcionar a 200 voltios durante 30 minutos. Lave el gel con agua destilada y agite suavemente. Para hacer el sándwich para Western bloting, desde el cátodo hasta el ánodo hay una esponja, papel de filtro, tampón de transferencia, gel SDS-PAGE empapado, membrana de PVDF activada por metanol, otro papel de filtro, retire las burbujas del sándwich y otra esponja.Coloque la pila en el tanque de transferencia. Funciona a una corriente constante de 350 miliamperios durante 45 minutos. Lave la membrana de PVDF con tampón TBST de 25 mililitros durante cinco minutos agitando suavemente.Bloquee la membrana con 5%BSA y el tampón TBST durante una hora a temperatura ambiente. Incubar la membrana con anticuerpo de acetillisina conjugado con HRP diluido a temperatura ambiente durante una hora o cuatro grados durante la noche con una agitación suave. Lave la membrana con 20 mililitros de tampón TBST durante cinco minutos agitando suavemente.Repita este paso cuatro veces. Aplique el sustrato de quimioluminiscencia a la membrana durante un minuto. Capture la señal con un generador de imágenes con base de cámara CCD.Los mismos volúmenes de fracciones de elución y purificación de proteínas se cargaron en el gel SDS-PAGE. El rendimiento de la proteína acetilada es aproximadamente la mitad de la proteína de tipo salvaje, que es altamente eficiente, y la misma cepa de expresión sin acetillisina y medios de crecimiento no puede producir proteínas con cantidad detectable, lo que indica una alta pureza de la proteína acetilada ya que no hay aminoácidos canónicos incorporados en esta posición específica. La Western blot mostró que no hay acetilación detectable en la proteína de tipo salvaje, lo que indica el bajo fondo de acetilación no específica de este sistema de expresión, mientras que la proteína acetilada tenía una banda clara.La espectrometría de masas en tándem confirmó que la acetilación se produce en el sitio correcto cuya posición correspondiente en el gen estaba mutada al codón de parada. Para obtener buenos rendimientos y pureza de las proteínas acetiladas, se debe utilizar el sistema optimizado de incorporación de acetillisina tanto para una alta eficiencia como para una alta pureza. Las celdas BL21 (DE3) deben usarse para acetilación de fondo bajo e inespecífica para aumentar la pureza.El sistema de incorporación genética podría utilizarse en sistemas eucariotas para aplicaciones más amplias.

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Este artículo ilustra el uso del etiquetado de radio de persecución de pulsos en combinación con la fotoreticulación específica del sitio para monitorear las interacciones entre una proteína de interés y otros factores en E. coli. A diferencia de los métodos tradicionales de reticulación química, este enfoque genera "instantáneas" de alta resolución de una vía de ensamblaje ordenada en una célula viva.

Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

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La incorporación de residuos específicos de no canónicos aminoácidos en las proteínas modelo usando una<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sistema de transcripción-traducción libre de células

Aquí, presentamos un protocolo para introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida, y posteriormente acoplar la azida con una sonda química mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC).

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Análisis bioquímicos y estructurales de proteínas glicosiladas requieren cantidades relativamente grandes de muestras homogéneas. Aquí, presentamos un método químico eficiente para el glycosylation sitio-específico de proteínas recombinantes purificados de bacterias dirigiéndose a tioles reactivos de Cys.

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Biología sintética permite la ingeniería de proteínas con propiedades sin precedentes mediante la inserción co-translational de aminoácidos no-canónico. Aquí, se presenta como una variante espectralmente rojo-cambiado de puesto de un fluoróforo tipo GFP con propiedades espectroscópicas fluorescencia novela, llamado proteína fluorescente de "oro" (GdFP), se produce en e. coli mediante incorporación de presión selectiva (SPI).

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Aquí presentamos un método para expresar proteínas de histonas acetiladas utilizando la expansión del código genético y ensamblar nucleosomas reconstituidos in vitro.

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Este estudio estableció un método que utiliza la expansión del código genético para incorporar con éxito la lactillisina (Klac) en sitios específicos de la enolasa-1 humana (hENO1) y la GFP superplegadora (sfGFP) en Escherichia coli y células de mamíferos.

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