Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli
9 de diciembre de 2017
Expansión del código genético sirve como una poderosa herramienta para el estudio de una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo acetilación de proteínas. Aquí demostramos un protocolo fácil aprovechar esta técnica para generar homogéneo acetilado proteínas en sitios específicos en células de Escherichia coli .
En este trabajo, demostraremos un protocolo fácil para producir proteínas acetiladas homogéneamente en sitios específicos mediante el uso de E. coli como huésped de expresión. La acetilación reversible de lisina de proteínas es una de las modificaciones postraduccionales más abundantes en la naturaleza. Desempeña un papel importante en una amplia gama de procesos biológicos, como la transcripción de genes, la respuesta al estrés, la diferenciación celular y el metabolismo.
La generación de proteínas puramente acetiladas en posiciones de diseño es muy útil para estudiar la acetilación de proteínas. Sin embargo, es difícil para la mayoría de los métodos clásicos. Este reto se ha resuelto mediante la técnica de expansión del código genético.
Utiliza una variación de pirrolisil-ARNt sintetasa diseñada para cargar ARNt-Pyl con acetillisina, luego utiliza la maquinaria de traducción del huésped para suprimir el codón de parada UAG en el ARNm y dirige la incorporación de acetillisina en la posición de diseño de la proteína objetivo. En primer lugar, el codón de parada ámbar debe introducirse en la posición correspondiente en el gen diana mediante mutagénesis dirigida al sitio. Amplifique el plásmido molde que contiene el gen de las proteínas de tipo salvaje e inserte la mutación del codón de parada de los cebadores mediante la reacción de PCR.
Después de la PCR, el material amplificado se añade directamente a la mezcla de enzimas quinasa-ligasa-Dpn1 durante una hora a temperatura ambiente para su circularización y eliminación de la plantilla. Agregue cinco microlitros de la mezcla al tubo de 25 microlitros de células competentes de E. coli descongeladas. Agite con cuidado el tubo para mezclar y coloque la mezcla en hielo durante 30 minutos.
Calienta la mezcla a 42 grados centígrados durante 30 segundos y colócala en hielo durante cinco minutos más. Pipetee 600 microlitros de medios SOC a temperatura ambiente en la mezcla. Incubar a 37 grados centígrados durante 60 minutos con agitación.
Esparcir 100 microlitros en el plato con el antibiótico correspondiente, e incubar toda la noche a 37 grados centígrados. El plásmido de la colonia única se envía para su secuenciación. El segundo paso es expresar y purificar la proteína acetilada específica del sitio.
Recoge una sola colonia de la placa, que contiene el gen diana mutado que contiene TAG y el sistema de incorporación de acetillisina. Inocular en 15 mililitros de medios LB frescos con los antibióticos correspondientes durante la noche a 37 grados centígrados. Transfiera el cultivo de 15 mililitros durante la noche a un medio LB fresco de 300 mililitros con antibióticos e incube a 37 grados centígrados.
Agregue acetillisina de cinco milimolares y nicotinamida de 20 milimolares como concentraciones finales en el medio de crecimiento cuando la absorbancia alcance 5 a 600 nanómetros. Cultive las células durante una hora adicional a 37 grados centígrados. Luego agregue el inductor para la expresión de proteínas y haga crecer las células a 25 grados centígrados durante la noche.
Recoja las células centrifugando a 3.000 g durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos de celda a menos 80 grados. Descongele los gránulos de células congeladas en hielo y vuelva a suspender con 15 mililitros de tampón de lisis, cinco microlitros de beta-mercaptoetanol y un microlitro de nucleasa.
Las células se rompen por sonicación. Centrifugar el extracto crudo a 20.000 g durante 25 minutos a cuatro grados. Filtre el sobrenadante con un filtro de membrana de 45 micrómetros.
Cargue la muestra filtrada en una columna que contenga un mililitro de resina NTA de níquel, equilibrada con 20 mililitros de tampón de lisis. Lave la columna con 20 mililitros de tampón de lavado. La proteína diana se elude con dos mililitros de tampón de elución.
La proteína purificada es desalinizada por la columna PD-10 agregando una muestra de 2,5 mililitros y recolecta la muestra desalinizada con tampón desalinizante de 3,5 mililitros. El siguiente paso es caracterizar bioquímicamente la proteína acetilada purificada. Desnaturalice las proteínas con el tampón de muestra SDS por encima de 100 grados durante cinco minutos.
Centrifugar la mezcla, cargarla en el gel SDS-PAGE y hacer funcionar a 200 voltios durante 30 minutos. Lave el gel con agua destilada y agite suavemente. Para hacer el sándwich para Western bloting, desde el cátodo hasta el ánodo hay una esponja, papel de filtro, tampón de transferencia, gel SDS-PAGE empapado, membrana de PVDF activada por metanol, otro papel de filtro, retire las burbujas del sándwich y otra esponja.
Coloque la pila en el tanque de transferencia. Funciona a una corriente constante de 350 miliamperios durante 45 minutos. Lave la membrana de PVDF con tampón TBST de 25 mililitros durante cinco minutos agitando suavemente.
Bloquee la membrana con 5%BSA y el tampón TBST durante una hora a temperatura ambiente. Incubar la membrana con anticuerpo de acetillisina conjugado con HRP diluido a temperatura ambiente durante una hora o cuatro grados durante la noche con una agitación suave. Lave la membrana con 20 mililitros de tampón TBST durante cinco minutos agitando suavemente.
Repita este paso cuatro veces. Aplique el sustrato de quimioluminiscencia a la membrana durante un minuto. Capture la señal con un generador de imágenes con base de cámara CCD.
Los mismos volúmenes de fracciones de elución y purificación de proteínas se cargaron en el gel SDS-PAGE. El rendimiento de la proteína acetilada es aproximadamente la mitad de la proteína de tipo salvaje, que es altamente eficiente, y la misma cepa de expresión sin acetillisina y medios de crecimiento no puede producir proteínas con cantidad detectable, lo que indica una alta pureza de la proteína acetilada ya que no hay aminoácidos canónicos incorporados en esta posición específica. La Western blot mostró que no hay acetilación detectable en la proteína de tipo salvaje, lo que indica el bajo fondo de acetilación no específica de este sistema de expresión, mientras que la proteína acetilada tenía una banda clara.
Laespectrometría de masas en tándem confirmó que la acetilación se produce en el sitio correcto cuya posición correspondiente en el gen estaba mutada al codón de parada. Para obtener buenos rendimientos y pureza de las proteínas acetiladas, se debe utilizar el sistema optimizado de incorporación de acetillisina tanto para una alta eficiencia como para una alta pureza. Las celdas BL21 (DE3) deben usarse para acetilación de fondo bajo e inespecífica para aumentar la pureza.
El sistema de incorporación genética podría utilizarse en sistemas eucariotas para aplicaciones más amplias.
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Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para generar proteínas homogéneamente acetiladas en sitios específicos utilizando E. coli como huésped de expresión. La técnica aprovecha la expansión del código genético para superar los desafíos asociados con los métodos tradicionales de acetilación de proteínas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Ingeniería de proteínas
- Modificaciones postraduccionales
Antecedentes
- La acetilación de lisina es una modificación postraduccional prevalente.
- Es crucial para diversos procesos biológicos como la transcripción génica y el metabolismo.
- La generación de proteínas acetiladas en sitios específicos ayuda a estudiar sus funciones.
- Los métodos tradicionales para la acetilación suelen ser ineficaces.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para producir proteínas acetiladas en E. coli.
- Facilitar el estudio de los mecanismos de acetilación de proteínas.
- Mejorar la comprensión del papel de la acetilación en los procesos biológicos.
Métodos Utilizados
- Técnica de expansión del código genético.
- Expresión de proteínas en Escherichia coli.
- Acetilación sitio-específica de proteínas.
- Desarrollo de protocolo para acetilación homogénea.
Resultados principales
- Generación exitosa de proteínas acetiladas de manera homogénea.
- Se demostró la eficacia de la técnica de expansión del código genético.
- Se proporcionó una nueva herramienta para estudiar la acetilación de proteínas.
- Mejoró la comprensión del papel de la acetilación en funciones biológicas.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado simplifica la producción de proteínas acetiladas.
- Este método puede aplicarse a diversos estudios que involucren modificaciones proteicas.
- Las investigaciones futuras pueden aprovechar esta técnica para explorar procesos relacionados con la acetilación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La acetilación específica en sitios de proteínas en Escherichia coli permite una interrogación precisa de las modificaciones postraduccionales fundamentales para la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Este protocolo aborda desafíos persistentes en la generación de proteínas modificadas de manera homogénea, favoreciendo la confianza predictiva y la continuidad traslacional en los portafolios de I+D.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la prueba directa de hipótesis dependientes de la acetilación en sitios proteicos definidos.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos al aislar el impacto funcional de eventos específicos de acetilación de lisina.
- Apoya la validación robusta de dianas al proporcionar proteínas puras y modificadas de manera específica en sitios concretos para ensayos posteriores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona reactivos proteicos acetilados estandarizados y reproducibles para ensayos bioquímicos y biofísicos cuantitativos.
- Mejora la fiabilidad del ensayo al eliminar el fondo derivado de la acetilación no específica.
- Permite la producción escalable de proteínas modificadas para plataformas de cribado de alto rendimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Correlaciona hallazgos bioquímicos in vitro con modificaciones postraduccionales relevantes para la enfermedad observadas in vivo.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir estudios funcionales de la acetilación en sistemas modelo.
- Reduce el riesgo de traslación al aclarar las consecuencias biológicas de eventos específicos de acetilación.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir la generación de proteínas acetiladas de manera específica en sitios determinados para la comprobación de hipótesis, el desarrollo de ensayos y estudios mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis nulas mediante la comparación directa de variantes proteicas de tipo salvaje y acetiladas.
- Selección: Proporciona reactivos reproducibles y de alta pureza para el desarrollo de ensayos cuantitativos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la medición precisa de cambios funcionales dependientes de la acetilación utilizando inmunotransferencia (western blotting) y espectrometría de masas.
- Investigación Traducional: Facilita la correlación de hallazgos in vitro con patrones de acetilación in vivo relevantes para modelos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para generar diversas proteínas modificadas de forma específica en sitios concretos, dirigidas a múltiples blancos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas.
- Valor operativo: Estandariza la producción de proteínas modificadas con alta eficiencia y pureza.
- Valor estratégico: Permite tomar mejores decisiones de avance o interrupción al aclarar el impacto funcional de la acetilación.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas y vías metabólicas basada en evidencia bioquímica sólida.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en clonación molecular, expresión proteica y análisis de modificaciones postraduccionales.
- Necesita acceso a sistemas de expresión en E. coli, herramientas de mutagénesis dirigida y plataformas analíticas como inmunotransferencia (western blotting) y espectrometría de masas.
- Exige la estandarización cruzada de protocolos entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes dianas proteicas u hospedadores de expresión según las necesidades del proyecto.
- El rendimiento y la pureza dependen de la optimización del sistema de incorporación de acetil-lisina y de la selección de la cepa hospedadora.
